虾类黑变机理.ppt

虾类黑变机理 多酚氧化酶 一 引言1多酚氧化酶的性质2酶促褐变的生理作用二 酚氧化酶的生物化学和分子生物学性质三 褐变控制1物理处理2抑制剂 食品的外观 风味 质地和营养价值是消费者选择食品时的四个因素 重要的是颜色 也是消费者评价食品质量的首要因素之一 通过酶促反应或非酶促反应形成的颜色 影响着许多水果 蔬菜和海洋食品 尤其是甲壳类食品的最重要的颜色反应之一酶促褐变反应 是多酚氧化酶引起的 这种酶曾经被称为酚氧化酶 酚酶 一元酚和二元酚氧化酶和酪氨酸酶 1问题1 1黑变病酚氧化酶能导致甲壳类 如龙虾和蟹变黑 被称为黑变病 1 2多酚氧化酶的性质多酚氧化酶能催化两种基本的反应 用苯酚和氧气作底物 该反应能在与羟基相连的位置催化羟基化反应 第二步反应是二元酚被氧化为邻位苯醌 苯醌常通过非酶反应机理进一步氧化成黑色素 褐色产物 1 2O2 O2 2H2O 一元酚氧化酶一元酚氧化酶催化一元酚羟基化成为二元酚 种酶被称为酪氨酸酶 因为L 酪氨酸是主要的一元酚底物 二元酚氧化酶第二步反应即二元酚被氧化成醌 被称为二元酚氧化酶活力或儿茶酚氧化酶活力 进一步反应是儿茶酚被氧化成为邻位 苯醌 虫漆酶虫漆酶 对 二元酚氧化酶 E C 1 10 3 2 DPO 是另外一种类型的含铜的多元酚氧化酶 对于其酚底物具有明显的非特异性 底物被虫漆酶氧化是由于单一电子反应生成自由基 氧气被还原成水的同时酚类底物也被氧化 1 2酶促褐变的生理作用 抗病能力被认为是多酚氧化酶在动物体内的功能之一 主要存在于昆虫和甲壳类动物中 该酶在动物体内常以酶原或多酚氧化酶前体形式存在 它对甲壳类动物中的骨化过程起到重要的作用 黑色素和部分聚合酚醛塑料具有抗微生物的性质 据说特殊的微生物能诱导产生能激活多酚氧化酶的蛋白酶 微生物次级代谢产物例如 葡聚糖 糖蛋白 脂多糖 海带多糖和其它一些产物也能诱导产生能激活多酚氧化酶的蛋白酶 2 酚氧化酶的生物化学和分子生物学性质 PPOs是含铜的蛋白质 在所有PPO顺序中最显著的特征是两个铜结合位点 被称为CuA和CuB PPO的活性位点由两个铜离子构成 每个铜离子与三个保守的组氨酸残基结合 这一对铜离子是PPO与氧气和酚类底物相互作用的位点 在甲壳类中 PPO体系以无活性的酚氧化酶原 proPO 形式存在于血淋巴中 因此 PPO来源于血蓝蛋白 血蓝蛋白是在甲壳类血淋巴的血浆中发现的氧气运输蛋白 血蓝蛋白和PPOs存在由两个铜离子直接与蛋白质结合而形成的氧结合位点 但是 血蓝蛋白不起催化作用 纯的proPO的分子量为76kDa 它是一种等电点在5 4左右的糖蛋白PPO活性的最适pH值在pH6 0和pH8 0之间 温度对甲壳类PPO的稳定性影响表明这些酶在20 50 范围内具有相似的稳定性 PPOs的稳定性是非常不同的 它依赖于许多因素 如温度 pH 底物浓度 离子强度 缓冲体系等 3 褐变控制 多酚氧化酶 PPO 催化酚氧化生成邻位 醌 邻位 醌是活性很强的化合物 它们自发聚合形成高分子量化合物或黑色素 或与氨基酸和蛋白质反应而加深颜色 阻止酶促褐变可以通过多种途径来实现 方法论上是除去一种或多种反应必需的成分 氧气 酶 铜或底物 3 1物理处理加热冷藏冷冻干燥辐射高压和超临界CO2 3 2抑制剂 褐变抑制剂在食品加工中的应用受毒性 对味道 风味 质地和价值的影响因素的制约 用于防止酶促褐变的抑制剂有5类 1 还原剂 2 螯合剂 3 酸化剂 4 酶抑制剂 5 络合剂 3 2 1还原剂 抗氧化剂 亚硫酸盐试剂硫酸盐是PPO的一种竞争性抑制剂 能使PPO活性位点的巯基结合 L 抗坏血酸抗坏血酸抑制的机理基本上被归结为还原 酶促形成邻位 醌成原来的二元酚 从而阻止色素的形成 异抗坏血酸异抗坏血酸和它的盐异抗坏血酸钠都是很强的还原剂 它们是氧惰性剂 因此能抵抗还原分子中的氧 酚类抗氧化剂抗氧化剂通过抑制生成自由基的氧化反应过程 螯合金属和惰性单线态氧来延缓酸败或变色 从而保藏食品 半胱氨酸半胱氨酸能抑制黑变病被推测是形成了无色的硫醇 邻位 醌 它甚至直接与PPO上的铜生成稳定的复合物而抑制酶活 3 2 2酸化剂 酸化剂的作用是将pH控制在PPO最佳催化活性所要求的pH之下 酸化剂如 柠檬酸 苹果酸 磷酸能将pH降到3以下 在这个pH下PPO是无活性的 酸化剂经常与其他抗褐变剂结合使用 柠檬酸和抗坏血酸一种是食品工业中使用的最广泛的酸之一 3 2 3 螯合剂 在它们的活性位点有金属离子 因此通过螯合剂除去它们的金属离子将使酶失去活性 螯合剂通过它们能起到络合或螯合的作用的分子结构中的不共用电子对与强氧化剂如铜铁离子络合 由于PPO是含铜的金属蛋白像辅基一样 它将被金属螯合剂抑制 在食品中应用的最好的GRAS螯合剂是柠檬酸和乙二胺环己酸 EDTA EDTAEDTA与铁 铜 钙通过螯合反应生成非常稳定的络合物 在羧基完全解离的高pH下 EDTA的螯合效果最好 在阻止酶促褐变中 EDTA通常与其他化合试剂合用 磷酸盐多磷酸盐 焦磷酸钠 金属磷酸盐都是螯合剂 由于它们在冷水中是微溶的 因而用在食品中作为抗褐变试剂时的浓度为0 5 2 麦芽酚麦芽酚 3 羟基 2 甲基 4氢 吡喃 4 one 一种 吡喃酮的衍生物 麦芽酚不能直接抑制PPO 但它能通过与邻位 醌的结合使其重新生成邻位 二羟基醌或使PPO不可逆灭活来抑制褐变 曲酸曲酸 5 羟基 2 羟甲基 4H 吡喃 4 one 是一种 吡喃酮衍生物 是许多曲霉菌和青霉菌的代谢产物 酪氨酸酶被曲酸的抑制可能是由于它能和酶活性位点的铜结合 因为曲酸是非常好的过渡金属如铁 和铜 的螯合剂 3 2 4 络合剂 甲壳胺甲壳胺来源于有壳的水生动物 甲壳质为 1 4 D 胺基葡萄糖的多聚体 甲壳胺无毒 生物可降解 有抗微生物作用 作用机理还不清楚 可能是带正电荷的多聚体能吸收悬浮的PPO的底物或产物的原故 环状糊精环状糊精是一类由液化淀粉在葡聚糖转移酶作用下经环状麦芽糊精而生成的环状寡糖 CD抑制褐变的机理主要是它们能与PPO的底物结合 CD的中央空穴有较弱的非极性与PPOs酚类形成包含络合物 因而能阻止醌的氧化和随后的聚合 从而阻止黑色素的生成 3 2 5 酶抑制剂 4 已基间苯二酚被取代的间苯二酚 它们的结构与酚类底物相关 被认为是PPO的抑制剂 间苯二酚衍生物与酚类底物的结构相类似 通过对PPO的竞争性抑制来阻止褐变反应 4 已基间苯二酚 4 HR 能抑制酪氨酸的一元酚氧化酶和二元酚氧化酶活性 卤化盐无机卤化盐是很有名的PPO抑制剂 NaF是最强的PPO抑制剂 其他依次是NaCl NaBr 和NaI 蜂蜜蜂蜜可以抑制酶促褐变 蜂蜜对PPO起抑制作用的化合物是分子量为600的小肽 因为蛋白质 肽和氨基酸通过螯合PPO活性中心的Cu2 形成稳定络合物来抑制PPO的活性 这可能就是蜂蜜肽的抑制机理 氨基酸 肽和蛋白质氨基酸 肽和蛋白质通过直接抑制酶或通过与PPO催化产物醌反应来抑制PPO催化的褐变 它们也能通过与催化各酚底物螯合PPO的活性位点的铜来抑制PPO活性 蛋白质 肽和 氨基酸能和铜离子形成稳定的络合物 组氨酸和半胱氨酸对铜离子有特别高的亲和力 因为组氨酸有咪唑环 半胱氨酸有巯基 二者都能连接金属离子 芳香族羧酸苯甲酸和肉桂系列的芳香族羧酸是PPO的抑制剂 同时它们的结构与底物的结构相类似 肉桂酸和它的类似物 对位 对羟基桂皮酸 阿魏酸和芥子酸被发现是植物PPO的强烈抑制剂 对虾黑变的新机理 我国海捕虾产量 海水养殖虾产量 南美白对虾 P vannamei 南美白对虾原分布在中 南美洲太平洋沿岸水域 外形似中国对虾 正常体色为浅灰色 壳薄体肥 肉质鲜嫩 出肉率高达65 以上 营养丰富 深受国内外市场欢迎 生长速度快 养殖60天即可上市 为当前世界上养殖最普遍的品种 我国南方沿海可以养两茬 该虾生长快 适应性强 食性杂 巳可耐受较长时间的干露 故易干活运销 该虾是对虾中个体最大的一种 发现的最大个体长达33厘米 体重500 600克 斑节对虾P monodon 日本对虾Penaeusjaponicus 日本对虾是日本最重要的对虾养殖品种 在日本养到25克左右出售价格最高 鹰爪虾 对虾科 Trachypenaeuscurvirostris 中国水产品的进出口贸易情况 中国2002年出口量排列前五位的依次是冻鱼及鱼片 占46 1 头足类 占18 1 各种加工鱼类及罐头 5 8 养殖虾 5 2 和烤鳗 3 2 出口额排在前五位的是冻鱼及鱼片 30 0 头足类 16 4 烤鳗 12 6 养殖虾 12 2 加工鱼类及罐头 6 0 1 引起虾类黑变真正原因是什么 2 血蓝蛋白是怎样被激活的 3 血蓝蛋白在对虾中的存在位置 4 血蓝蛋白仅仅氧化酪氨酸吗 5 是否还有其它因素能引起虾类的黑变 1 引起虾类黑变真正原因是什么 DOPA Melanin DOPAquinone 5 6 dihydroxyindole DHI DOPAchrome Phenoloxidase PO Tyrosine 虾类黑色素的形成 目前普遍被接受的形成机理 多酚氧化酶酶原的激活机理 Prophenoloxidase ProPO Phenoloxidase PO ProPOSystem Beta 1 3glucan LPS Peptidoglycan prophenoloxidaseactivatingfactor p APMSF 1 3葡聚糖 脂多糖 肽聚糖 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 0 Storagetime week POactivityduringstorageat 20 Residualactivity 多酚氧化酶原的cDNA序列及由cDNA序列推导出的氨基酸序列 Pacifastacusleniusculusprophenoloxidase Bombyxmoriprophenoloxidase Drosophilamelanogasterprophenoloxidase Homosapienstyrosinase Oryziaslatipestyrosinase Neurosporacrassatyrosinase Sinorhizobiummelilotityrosinase Proteins identity 57 35 38 15 13 11 14 PanulirusinterruptushemocyaninsubunitA Penaeusvannameihemocyanin Eurypelmacalifornicumhemocyaninsubunita 29 30 38 不同来源的多酚氧化酶原氨基酸序列的同源性比较 pjppo 0 1 lycopoA sopo mdpo papo 1000 889 1000 olty rnty ggty hsty mmty 1000 999 994 1000 bdhex mdhex aghex amhex 1000 886 1000 pihca pihcb 1000 pihcc pvhc1 pvhc2 1000 998 1000 agppo1 bmppo1 1000 bmppo2 msppo 1000 723 dmppo gam2 agppo3 agppo6 1000 987 agppo4 agppo5 1000 962 1000 1000 plppo 1000 825 echcb echcc 1000 echca echcf echce echcg 441 520 echcd 977 504 1000 1000 853 1000 417 973 973 Plantphenoloxidase Vertebratetyrosinase Crustaceanhemocyanin Insectphenoloxidase Cheliceratehemocyanin Crustaceanprophenoloxidase nsty smty Microbialtyrosinase Insecthexamerin DendrogramofPOs 2 血蓝蛋白是怎样被激活的 血蓝蛋白 Hc 由肝胰腺分泌在血清中作为氧的运输载体可作为渗透压调节剂 蜕皮激素载体 抗菌肽前体从基因序列看 与多酚氧化酶有较大的同源性被激活后 具有多酚氧化酶活性 血细胞组分在激活血蓝蛋白的过程中起重要作用 血蓝蛋白的激活 Hc HemocyaninHLS HemocyteLysateSupernatant AandC ActivatedHemocyaninBandD NativeHemocyanin NativeHc ActivatedHc 血蓝蛋白的激活机理 S Sbond 3 血蓝蛋白在对虾中的存在部位 血蓝蛋白存在于虾类的表皮 在虾的表皮会发生明显的黑变 表皮中的血蓝蛋白 100mm Stainedwith A Antibody B Toluidineblue C NegativeControl D Secondaryantibody Dorsal Ventral Epicuticle Endocuticle Exocuticle A B C D 4 血蓝蛋白仅仅氧化酪氨酸吗 DOPA Melanin DOPAquinone 5 6 dihydroxyindole DHI DOPAchrome Hemocyanin Tyrosine 血蓝蛋白引起的虾类黑色素的形成过程 DHIandDHICA 5 6 Dihydroxyindole 2 carboxylicacid DHICA 5 6 Dihydroxy