2009CB941200-调控内胚层组织器官发育的分子机制研究.doc

项目名称：调控内胚层组织器官发育的分子机制研究首席科学家：罗凌飞 西南大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：教育部 重庆市科委一、研究内容在本项目拟开展的研究工作中，我们将应用斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠等模式动物和胚胎干细胞研究体系，以肝脏和胰腺这两个重要的内胚层器官为主要研究对象，辅以肠道的研究，沿着从内胚层细胞到内胚层器官前体细胞的命运预定、到前体细胞的分化和成熟功能细胞的形成、到器官的形态建成、功能发挥、和受损再生的动态连续过程，全面深入地研究在内胚层组织器官特别是肝脏和胰腺的发育和再生过程中发挥重要功能的因子、信号途径和表观遗传稳定性的作用机制，并阐明其中可能存在的时间、空间网络关联。按照本项目拟设置的三个课题，具有研究内容如下：课题一：调控肝脏和肠道发育的分子机理研究1. 斑马鱼体节形成早期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。1）可用于精确定位和分选预定的肝脏、肠道前体细胞的转基因斑马鱼的建立；2）46体节时期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。2. 在斑马鱼预定的肝脏或肠道前体细胞中特异和差异表达基因的筛选及其功能机制研究。1）46体节时期斑马鱼预定的肝脏、肠道前体细胞分选，两者之间及其分别与原肠中期内胚层细胞差异表达基因的芯片筛选；2）差异表达基因发挥功能的分子机理研究。3. 肝细胞命运决定后调控肝脏发育基因的筛选与功能研究。1）肝脏发育不同时期的差异表达基因的芯片筛选；2）差异表达基因的功能和作用机理研究。4. 利用胚胎干细胞体系研究肝前体及肝细胞体外分化的分子机理。1）胚胎干细胞向肝脏前体细胞分化过程中命运决定的分子机理；2）胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的基因表达特性分析，影响其定向分化的关键基因的寻找及作用机理研究；3）胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的体外分化能力及分子机理研究。5. 组蛋白H3的N端三甲基化表观遗传调控机制在由胚胎干细胞到肝细胞分化过程中的功能。1）肝干细胞的形成与分化中组蛋白H3 N端三甲基化与染色质形成的关系；2）肝细胞特异的组蛋白H3 N端三甲基化酶的克隆；3）H3 N端三甲基化在从胚胎干细胞到肝细胞分化过程中的表观遗传稳定性及功能的系统研究；4）肝细胞特异性组蛋白H3 N端三甲基化酶在肝细胞形成与分化中的作用与分子机理。6. 表观遗传在斑马鱼内胚层器官发育的不同阶段的稳定性及其功能的系统研究。1）在斑马鱼内胚层器官发育的不同阶段对H3K4Me3、H3K27Me3、H3K9/18Ac、H4K12Ac的表观遗传稳定性及功能的系统化研究；2）选取具有代表性的表观遗传位点，研究染色质上相应位点附近基因在调控内胚层器官发育中的功能及分子机理。7. 具有肝脏发育缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制研究。1）具有肝脏发育缺陷突变体的表现型研究；2）导致肝脏发育缺陷的致变基因克隆及其调控肝脏发育的分子机理研究。8. NEMO/IKKg的K63多泛素化在调控肝脏发育中的功能与分子机理。1）NEMO/IKKg及其多泛素化在调控斑马鱼肝脏发育中的功能；2）NEMO/IKKg多泛素化酶的确定及其在肝脏发育中的功能。9. Wnt信号途径及其上游调控因子KLP在斑马鱼肝脏发育中的功能机制。1）Wnt信号途径调控肝脏发育的分子机理；2）KLP调控肝脏发育的分子机理。课题二：调控胰腺发育的分子机理研究1. 在斑马鱼预定的胰内外分泌前体细胞中差异表达基因的筛选及其功能机制研究。1）斑马鱼原肠中后期内胚层细胞、46体节时期预定的内、外分泌前体细胞及非预定的胰腺前体细胞的分选，四者差异表达基因的芯片筛选；2）差异表达基因的表达模式、功能和作用机制研究。2. 非洲爪蟾预定的胰腺内胚层细胞特异性调控因子的筛选和功能机制研究。1）非洲爪蟾囊胚晚期/原肠早期预定的胰腺内胚层细胞的细胞谱系分析定位；2）基因芯片比较正常的预定胰腺内胚层细胞与BMS453处理过的内胚层细胞、RA处理过的内胚层细胞、高表达了Hex的内胚层细胞、高表达了VegT和-catenin的爪蟾胚胎多能性前体细胞的基因表达图谱以筛选出决定预定胰腺内胚层细胞的特异性内在调控因子；3）对筛选所得重要调控因子发挥功能的分子机理研究。3. 非洲爪蟾胰腺特异性表达的新基因的筛选及功能机制研究。1）利用大规模整体原位杂交从非洲爪蟾胚胎及成体的胰腺cDNA文库中筛选胰腺特异性表达的新基因；2）新基因调控胰腺发育的功能及分子机理研究。4. Hex特异性地诱导腹侧胰腺前体细胞增多的分子机理研究。1）Hex在原肠胚期过量表达诱导巨大腹侧胰腺的细胞机制研究；2）Hex的相互作用因子、在染色质上附着位点、下游调控基因的筛选及其调控胰腺发育的分子机理研究。5. 非洲爪蟾胚胎胰腺和肝脏的体外重建。1）在经过早期紫外线照射形成的爪蟾belly piece中选择性地恢复胰腺和肝脏形成的研究。2）在体外诱导爪蟾胚胎多能性前体细胞形成胰腺及真正成熟的胰岛细胞的研究。6. 利用胚胎干细胞体系研究胰腺细胞体外分化的分子机理。1）分别建立pdx1和 ngn3启动子驱动的报告体系；2）研究RA, BMP, FGF等信号途径调控pdx1表达的分子机理；3）胰腺前体细胞的基因表达谱分析，胰腺前体细胞向内分泌细胞分化过程中的信号调控机制研究；4）胰内分泌前体细胞的基因表达谱分析，Ngn3下游调控基因的表达谱分析。7. 具有胰腺发育缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制研究。1）具有胰腺发育缺陷突变体的表现型研究；2）导致胰腺发育缺陷的致变基因克隆及其调控胰腺发育的分子机理研究。8. 分离小鼠内胚层组织的成体干细胞，确定干细胞的分化途径以及分化的子代细胞谱。1）利用三维培养体系，从小鼠胚胎和新生小鼠体内分离和富集内胚层组织的干细胞/前体细胞，确定其表面标记；2）分析成体小鼠内的干细胞/前体细胞组分；3）分析内胚层组织干细胞/前体细胞的特异基因表达模式，确定干细胞/前体细胞内特异基因表达；4）建立体外干细胞/前体细胞分化体系，确定内胚层组织的细胞分化谱；5）建立体内细胞分化测定体系，确定体内分化细胞谱，比较体内外分化谱的异同，明确内胚层组织的细胞分化测定手段。9. 在小鼠胚胎发育过程中，确定小鼠内胚层组织的干细胞/祖细胞的形成、分化的子代细胞谱与分化途径，探索内胚层组织的构筑。1）标记内胚层特异表达基因，在成体内胚层组织内确定基因表达谱的特异性；2）分离小鼠器官形成期的胚胎，确定特异基因在小鼠胚胎中的组织特异性；3）筛选内胚层分化过程中的特异表达的基因；4）分离单细胞到器官形成期的小鼠胚胎，对胚胎内胚层细胞进行谱系定位，为系统分析小鼠内胚胎发育提供基础。10. 建立内胚层组织特异基因条件敲除小鼠，标记内胚层组织起源细胞，分析内胚层组织的形成与构筑的过程，探讨内胚层组织形成的分子机制。1）确定内胚层发育的特异基因；2）构建条件性基因打靶的ES细胞，体外分析细胞的分化能力；3）构建条件基因打靶小鼠；4）分析内胚层分化发育的分子基础与分子机制。课题三：正向遗传突变筛选具有内胚层器官发育或再生缺陷的突变体及致变基因的功能机制研究1. 斑马鱼肝脏和胰岛细胞再生模型的建立及ENU正向遗传突变筛选研究在肝脏或胰腺发育、肝脏或细胞再生过程中发挥重要功能的基因及其作用机制。1）斑马鱼肝脏和胰岛细胞再生模型的建立及再生的细胞过程研究；2）ENU化学诱变筛选具有肝脏或胰腺发育缺陷、肝脏或细胞再生缺陷的突变体及其表现型研究；3）致变基因的克隆和功能机制研究。2. 斑马鱼胰外分泌腺再生模型的建立及ENU正向遗传突变筛选研究在胰外分泌腺再生过程中发挥重要功能的基因及其作用机制。1）斑马鱼胰外分泌腺再生模型的建立及再生的细胞过程研究；2）ENU化学诱变筛选具有胰外分泌腺再生缺陷的突变体及其表现型研究；3）致变基因的克隆和功能机制研究。3. 通过增强子诱捕获得的胰腺GFP标记转基因鱼的基因定位、鉴定及功能研究。1）对获得的胰腺GFP标记转基因鱼进行基因定位并鉴定候选基因；2）新基因的功能及分子机理研究。4. 利用转座子介导的插入突变筛选具有肝脏、胰腺或肠道发育缺陷的突变体及致变基因的功能机制研究。1）携带转座子的转基因斑马鱼的建立；2）具有肝脏、胰腺或肠道发育缺陷的突变体筛选；3）致变基因的克隆和功能机制研究。二、预期目标（一）总体目标针对内胚层组织器官的发育与再生领域研究的热点和难点，依托并联合运用本项目申请组已建立的斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠和胚胎干细胞研究平台，揭示调控从内胚层细胞到肝脏和胰腺等主要内胚层器官前体细胞的命运预定和分化、到成熟功能细胞的形成、到器官的形态建成、功能发挥、和受损再生的这一动态连续发育过程中各个阶段的分子机理。整合各个课题的研究成果，在分子水平上描绘出调控内胚层组织器官发育的整体蓝图，为满足国家对重大疾病防治的迫切需求服务。通过本项目的实施，在发现预定的肝脏和胰腺前体细胞的分子标记和重要命运决定因子、揭示内胚层组织器官发育过程中的表观遗传调控机制、阐明调控肝脏和胰腺形态建成及受损再生的分子机理等国际研究前沿领域有所突破，为使我国的内胚层组织器官发育研究进入国际先进行列打下扎实的基础。（二）五年预期目标1. 建立并完善我国利用模式动物和胚胎干细胞研究以肝脏和胰腺为代表的内胚层组织器官发育和再生的研究体系。2. 发现并鉴定预定的肝脏或胰腺前体细胞的分子标记和关键命运决定因子，阐明其发挥功能的分子机理，填补国际上缺乏预定的肝脏和胰腺前体细胞的早期分子标记这一研究空白。3. 筛选并鉴定510个在内胚层组织器官发育过程中及23个在肝脏或胰腺的再生过程中发挥重要功能的新因子，阐明其发挥功能的分子机理。4. 构建24个特异基因条件打靶小鼠，初步分析这些基因在内胚层组织器官发育中的作用。5. 同时以胚胎干细胞和斑马鱼为研究体系，阐明表观遗传机制特别是组蛋白修饰机制在调控内胚层组织器官发育中的功能及机制。6. 整合已有的知识及本项目各个课题的研究成果，深入揭示多种因子、信号途径、表观遗传机制等联合调控内胚层组织器官的前体细胞命运决定、形态建成、功能发挥和受损再生这一连续过程的时空分子调控网络。7. 联合我国的斑马鱼研究资源库，本项目实施过程中建立和获得的所有转基因和突变种系都将通过我国的斑马鱼研究资源库成为国内科研工作者的共享资源。8. 发表4050篇SCI学术论文，其中影响因子大于5的1520篇，影响因子大于10的510篇；申请专利47个。9. 通过项目培养青年科技骨干人才，培养高水平博士后510人、博士研究生5070人；建立并逐渐壮大一支活跃在内胚层组织器官发育研究领域的创新团队和中青年学术带头人队伍，并至少有两位青年科学家在项目实施过程中获得国家杰出青年基金资助。三、研究方案（一）技术路线课题一：调控肝脏和肠道发育的分子机理研究1. 斑马鱼体节形成早期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。1） 可用于精确定位和分选预定的肝脏、肠道前体细胞的转基因斑马鱼的建立。建立sox17:Kaede和sox17:Dendra转基因鱼，这两个转基因系是在斑马鱼中进行内胚层细胞精确谱系定位和分选的重要工具。2） 46体节时期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。利用激光定点激发技术，将sox17:Kaede或sox17:Dendra转基因鱼中的单个内胚层细胞转变为红色荧光细胞，然后谱系定位红色荧光细胞在内胚层器官中的位置。我们将以单细胞分辨率完成每一个前肠内胚层细胞的谱系定位。2. 在斑马鱼预定的肝脏或肠道前体细胞中特异和差异表达基因的筛选及其功能机制研究。1） 46体节时期斑马鱼预定的肝脏、肠道前体细胞分选，两者之间及其分别与原肠中期内胚层细胞差异表达基因的芯片筛选。A）根据本课题第1部分获得的前肠内胚层细胞谱系定位，在46体节时期的sox17:Kaede或sox17:Dendra胚胎中定点激活单一类型的预定前体细胞，然后立即利用FACS技术分选红色荧光细胞；B）细胞分选后立即提取总RNA并制备芯片探针，通过基因芯片分析获得并确证肝脏、肠道两种预定的前体细胞之间及其分别与原肠中末期内胚层细胞的差异表达基因。2） 差异表达基因的功能及作用机理研究。A）在差异表达基因克隆并经定量PCR确证后，首先将研究基因的表达模式，力争获得10体节以前预定的肝脏和肠道前体细胞的特异性分子标记；B）研究mRNA过表达、morpholino敲降、内胚层特异性morpholino敲降后的胚胎表现型及其对肝脏和肠道不同发育时期的分子标记表达的影响；C）对于重要功能因子制备特异性抗体，并运用酵母双杂交、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀（对转录因子或结合在染色质上的蛋白复合物成员）筛选其相互作用因子或染色质附着位点，从转录调控、表观遗传调控、蛋白相互作用调控三个方面研究这些因子调控肝脏和肠道早期发育的分子机理。3. 肝细胞命运决定后调控肝脏发育基因的筛选与功能研究。1） 肝脏发育不同时期的差异表达基因的芯片筛选。机械分离前肠内胚层区域组织后，利用FACS技术分离gutGFP斑马鱼的14hpf、24 hpf、48 hpf、72 hpf和96 hpf胚胎中携带GFP的细胞，提取总RNA后制备探针进行基因芯片分析，获得并确证差异表达基因。2） 差异表达基因的功能和作用机理研究。对于通过基因芯片获得的新基因，我们将利用基因过表达和敲降、内胚层特异性敲降、整体原位杂交、免疫组化、酵母双杂交、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等方法研究新基因的功能及其作用机理。4. 利用胚胎干细胞体系研究肝前体及肝细胞体外分化的分子机理。1） 胚胎干细胞向肝脏前体细胞分化过程中命运决定的分子机理。A）建立报告体系，标记肝脏前体细胞。Afp的表达标志着内胚层细胞进一步分化为肝脏前体细胞，因此我们将采用同源重组的方式，建立afp启动子驱动报告基因表达的胚胎干细胞系。利用该细胞系，我们可以定量判断肝脏前体细胞的分化效率，并对肝脏前体细胞进行分离纯化；B）研究关键信号通路FGF和BMP在分化过程中的作用。我们已经基本建立了胚胎干细胞向肝脏细胞定向分化的体系，整个分化过程与肝脏体内发育过程相对应，可分为三个阶段：第一、胚胎干细胞向内胚层细胞分化阶段，第二、内胚层细胞向肝脏前体细胞分化阶段，第三、肝脏前体细胞向成熟肝实质细胞分化阶段。我们初步研究发现，FGF和BMP信号通路在内胚层细胞向肝脏细胞命运决定过程中可能起到关键的作用。进一步，我们将对FGF和BMP信号通路及其下游重要信号通路在胚胎干细胞向肝脏细胞分化过程中的功能进行深入分析。通过配体激活或者小分子抑制的方式，对这些候选下游信号进行特异性的激活或抑制，并通过免疫荧光、流式细胞术、RT-PCR等方式检测这些信号分子对向肝脏前体细胞的分化和增殖能力的影响。这些分析有助于进一步阐明FGF和BMP信号通路在促进胚胎干细胞向肝脏前体细胞命运决定的分子机理。2） 胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的基因表达特性分析，影响其定向分化的关键基因的寻找及作用机理研究。A）寻找表面标记，用于分离纯化肝脏前体细胞。通过免疫细胞化学方法，寻找肝脏前体细胞的表面分子标记，并利用此标记，对分化得到的肝脏前体细胞进行流式细胞分选，从而分离并纯化肝脏前体细胞；B）寻找调控肝脏前体细胞形成的关键转录因子。我们将通过基因芯片的方法，对分选得到的肝脏前体细胞进行基因表达分析，并与之内胚层细胞阶段和肝实质细胞阶段进行比较，从而寻找调控肝脏前体细胞形成的关键转录因子；C）研究关键转录因子在胚胎干细胞向肝脏细胞分化过程中的功能。利用Tet-on调控的基因表达系统，建立重要候选基因可诱导表达的人类胚胎干细胞系，并在分化的不同时间点激活这些基因的表达，以分析这些基因对人类胚胎干细胞向肝脏细胞分化的影响；我们还将利用RNA干涉技术（RNAi）进行lost-of-function的研究，对这些基因的功能进行进一步验证。3） 胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的体外分化能力及分子机理研究。根据体内发育研究中已有的部分线索，寻找可能参与细胞分化调控的信号通路，并分别通过配体激活或者小分子抑制，调节特定信号通路的活性，进一步分析这些信号通路对肝脏前体细胞向肝实质细胞和胆管细胞分化的影响，从而寻找调控前体细胞向肝、胆两谱系进行分化的关键信号通路。5. 组蛋白H3的N端三甲基化表观遗传调控机制在由胚胎干细胞到肝细胞分化过程中的功能。1） 肝干细胞的形成与分化中组蛋白H3 N端三甲基化与染色质形成的关系。在肝细胞分化的不同阶段检测细胞内组蛋白H3 N端三甲基化与染色质形成的关系，确定染色质组蛋白H3 N端三甲基谱。2） 肝细胞特异的组蛋白H3 N端三甲基化酶的克隆。利用RT-PCR分析不同分化阶段肝细胞内各种组蛋白H3 N端三甲基化酶表达，克隆相应阶段肝细胞内特异的组蛋白H3 N端三甲基化酶。3） H3 N端三甲基化在从胚胎干细胞到肝细胞分化过程中的表观遗传稳定性及功能的系统研究。A）利用N端三甲基化的组蛋白H3抗体和小鼠全基因组基因芯片，在肝细胞分化的不同时期将染色质免疫共沉淀与基因芯片联用（ChIP on Chip），系统化地研究N端三甲基化的组蛋白H3的染色质附着位点在肝细胞分化不同阶段的变化；B）选取具有代表性的附着位点，研究肝细胞分化不同阶段在附着位点附近基因的转录水平变化，对于转录发生变化的基因深入研究其在肝细胞分化过程中的功能及作用机制。4） 肝细胞特异性组蛋白H3 N端三甲基化酶在肝细胞形成与分化中的作用与分子机理。A）在斑马鱼胚胎和胚胎干细胞体系中，抑制或过表达肝细胞特异的组蛋白H3 N端三甲基化酶，通过检测肝脏不同发育时期的分子标记研究其在肝细胞分化及肝脏发育中的功能；B）利用ChIP on Chip，研究肝细胞特异性组蛋白H3 N端三甲基化酶功能缺失后，三甲基化组蛋白H3在染色质上附着位点的变化，以及对代表性位点附近基因转录的影响，对于转录受影响的基因深入研究其介导表观遗传调控肝细胞分化的分子机理。6. 表观遗传在斑马鱼内胚层器官发育的不同阶段的稳定性及其功能的系统研究。1） 在斑马鱼内胚层器官发育的不同阶段对H3K4Me3、H3K27Me3、H3K9/18Ac、H4K12Ac的表观遗传稳定性及功能的系统化研究。A）建立斑马鱼全基因组基因芯片；B）利用sox17:GFP或gutGFP转基因鱼中内胚层细胞所携带的绿色荧光，在不同发育时期的斑马鱼胚胎中通过FACS技术分选内胚层细胞并制备匀浆；C）利用H3K4Me3、H3K27Me3、H3K9/18Ac、H4K12Ac抗体及斑马鱼全基因组基因芯片在各时期的胚胎匀浆中进行ChIP on Chip，系统地阐明不同修饰的组蛋白在内胚层器官发育不同时期的全基因组中分布变化。2） 选取具有代表性的表观遗传位点，研究染色质上相应位点附近基因在调控内胚层器官发育中的功能及分子机理。A）研究组蛋白修饰酶的特异性化学抑制剂如曲古霉素A（TSA）对基因表达水平和内胚层器官发育的影响；B）在基因组中选取在不同发育阶段表观遗传稳定发生变化的修饰后组蛋白附着位点，研究其附近基因在内胚层中转录水平在不同发育时期的变化，以及该基因是否对于TSA等对内胚层器官发育的影响具有回救（rescue）效应；C）对于内胚层中转录水平在不同发育时期发生变化的基因，我们将研究其在内胚层发育过程中的功能及分子机理。7. 具有肝脏发育缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制研究。1） 具有肝脏发育缺陷突变体的表现型研究。通过检测内胚层及肝脏发育不同时期的分子标记，研究突变体所具有的肝脏发育缺陷表现型。2） 导致肝脏发育缺陷的致变基因克隆及其调控肝脏发育的分子机理研究。A）同全基因组多型性标记（polymorphic marker）扫描、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆重叠群（contig）的建立、零重组多型性标记的获得、候选致变基因的测序等过程定位和克隆致变基因；B）利用特异性的morpholino和mRNA回救以确证致变基因，研究其表达模式；C）运用细胞移植技术研究致变基因调控肝脏发育功能的细胞自主（autonomous）或非自主（non-autonomous）性，如果是非自主的，确定调控肝脏发育的致变基因表达组织；D）采用酵母双杂交、抗体制备、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等方法深入研究该基因调控肝脏发育的分子机理。8. NEMO/IKKg及其K63多泛素化在调控肝脏发育中的功能与分子机理。1） NEMO/IKKg及其多泛素化在调控斑马鱼肝脏发育中的功能。A）研究NEMO/IKKg、NF-B亚基p65和p50敲降及内胚层特异性敲降后肝脏分子标记表达的变化；B）制备斑马鱼NEMO/IKKg抗体，在不同时期分离gutGFP斑马鱼胚胎的肝脏区域细胞并制备细胞匀浆，通过NEMO/IKKg抗体进行免疫共沉淀后利用泛素抗体检测NEMO/IKKg的泛素化水平及其在不同发育时期的变化。2） NEMO/IKKg多泛素化酶的确定及其在肝脏发育中的功能。A）生化分析DrUbc13、DrUev、DrTraf6与NEMO/IKKg之间的相互作用；B）潜在的多泛素化蛋白敲降后，检测肝脏中NEMO/IKKg的泛素化水平的变化；C）研究导致NEMO/IKKg泛素化水平发生变化的K63多泛素化蛋白过表达或敲降后，对胚胎细胞核中具有活性的磷酸化NF-B水平以及对肝脏发育的影响；D）研究NEMO/IKKg敲降后，K63泛素化蛋白过表达或敲降对肝脏发育的影响，以确证K63多泛素化蛋白是通过NEMO/IKKg来发挥功能的；E）建立转基因鱼，在不同发育时期诱导K63多泛素化蛋白过量表达，研究其对肝脏发育和NEMO/IKKg泛素化水平的影响。9. Wnt信号途径及其上游调控因子KLP在斑马鱼肝脏发育中的功能机制。1) Wnt信号途径调控肝脏发育的分子机理。A）利用hsp:dkk1-GFP转基因系，在胚胎发育的不同时期抑制Wnt通路，分析肝脏分子标记表达的变化；B）利用全胚胎原位杂交和Real-time PCR等，获得斑马鱼Wnt信号途径分子表达的完整信息，确定不同发育时期参与Wnt途径激活的潜在信号分子，深入研究这些信号分子在肝脏发育中的功能与机制。2) KLP调控肝脏发育的分子机理。KLP是我们在最近工作中发现的Wnt信号途径上游调控因子。A）研究KLP敲降或过表达导致的肝脏发育表现型及肝脏分子标记表达的变化；B）通过Wnt信号分子对KLP功能异常所导致的肝脏表现型的回救、Wnt信号途径被抑制或Wnt信号分子功能缺失后KLP功能异常所导致的肝脏表现型和分子标记表达的变化等，探讨KLP通过Wnt信号途径调控肝脏发育的作用机制。C）在胚胎干细胞体外分化体系中，研究KLP过表达或抑制对肝细胞分化的影响。课题二：调控胰腺发育的分子机理研究1. 在斑马鱼预定的胰内外分泌前体细胞中差异表达基因的筛选及其功能机制研究。1） 斑马鱼原肠中后期内胚层细胞、46体节时期预定的内、外分泌前体细胞及非预定的胰腺前体细胞的分选，四者差异表达基因的芯片筛选。A）在46体节时期的sox17:Kaede或sox17:Dendra胚胎中定点激活单一类型的胰腺预定前体细胞，然后立即利用FACS技术分选红色荧光细胞；B）细胞分选后立即提取总RNA并制备芯片探针，通过基因芯片分析获得并确证胰内、外分泌腺两种预定的前体细胞相互之间及其分别与原肠中末期内胚层细胞和非胰腺前体细胞之间的差异表达基因。2） 差异表达基因的表达模式、功能和作用机制研究。A）在差异表达基因克隆并经定量PCR确证后，首先将研究基因的表达模式，力争获得10体节以前预定的胰内、外分泌腺前体细胞的特异性分子标记；B）研究mRNA过表达、morpholino敲降、内胚层特异性morpholino敲降后的胚胎表现型及其对胰腺不同发育时期的分子标记表达的影响；C）对于重要功能因子制备特异性抗体，并运用酵母双杂交、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀（对转录因子或结合在染色质上的蛋白复合物成员）筛选其相互作用因子或染色质附着位点，从转录调控、表观遗传调控、蛋白相互作用调控三个方面研究这些因子调控胰腺早期发育的分子机理。2. 非洲爪蟾预定的胰腺内胚层细胞特异性调控因子的筛选和功能机制研究。1） 非洲爪蟾囊胚晚期/原肠早期预定的胰腺和肝脏内胚层细胞的细胞谱系分析定位。利用DMNB-caged fluorescein dextran的单细胞激光定点激发进行内胚层细胞的谱系定位。2） 基因芯片比较正常的预定胰腺内胚层细胞与BMS453处理过的内胚层细胞、高表达了Hex的内胚层细胞、高表达了VegT和-catenin的爪蟾胚胎多能性前体细胞的基因表达图谱以筛选出决定预定胰腺内胚层细胞的特异性内在调控因子。A）在上述细胞谱系定位的基础上，进行基因芯片差异表达筛选；B）对于筛选得到的差异表达基因，研究其表达模式、过表达或敲降后所导致的胰腺发育表现型以确定其对胰腺发育的重要性。3） 筛选所得重要调控因子发挥功能的分子机理研究。A）对于筛选重要调控基因，研究其敲降或过表达对早期内胚层或胰腺发育不同时期分子标记表达的影响；B）对于重要的调控因子制备其抗体，并进一步采用酵母双杂交、免疫共沉淀、对于DNA结合因子采用ChIP-Cloning，研究其相互作用因子、在染色质上的结合位点、下游基因等，深入研究其调控胰腺发育的分子机理。3. 非洲爪蟾胰腺特异性表达的新基因的筛选及功能机制研究。1） 利用大规模整体原位杂交从非洲爪蟾胚胎及成体的胰腺cDNA文库中筛选胰腺特异性表达的新基因。我们计划从非洲爪蟾34期胚胎腹侧胰腺原基特异的cDNA文库及成体胰腺特异的cDNA文库中，运用大规模整体原位杂交的方法分析4000个以上随机挑选的克隆在不同时期胚胎中的表达，对胰腺特异性表达的克隆测序后选取其中的新基因进行进一步深入研究。2） 新基因调控胰腺发育的功能及分子机理研究。A）我们首先检测早期内胚层或胰腺发育不同时期的分子标记，研究基因过表达或敲降导致胰腺发育缺陷表现型和具体发育时期；B）对于产生胰腺发育缺陷的重要调控因子，制备其抗体并进一步采用酵母双杂交、免疫共沉淀、对于DNA结合因子采用ChIP-Cloning，研究其相互作用因子、在染色质上的结合位点、下游基因等，深入研究其调控胰腺发育的分子机理。4. Hex特异性地诱导腹侧胰腺前体细胞增多的分子机理研究。1） Hex在原肠胚期过量表达诱导巨大腹侧胰腺的细胞机制研究。A）检测Hex过表达或敲降后胰腺的早期发育分子标记pdx1、p48/ptf1a、肝脏分子标记prox1表达； B）利用BrdU和H3P（磷酸化组蛋白H3）抗体染色，检测Hex的过表达对细胞增殖的影响，如果Hex过表达会导致细胞增殖加快，我们将在使用细胞增殖抑制剂的情况下检测Hex的过表达对巨大腹侧胰腺的诱导能力；C）在斑马鱼中过表达Hex以重复非洲爪蟾中的诱导巨大腹侧胰腺的结果，如果得到类似结果，我们将利用细胞共移植技术研究Hex过表达对原肠胚期细胞迁移的影响，如果Hex过表达会影响细胞迁移，我们将在抑制原肠胚期细胞迁移的情况下检测Hex的过表达对巨大腹侧胰腺的诱导能力。由此，我们可以阐明Hex过表达是通过调控细胞分化、细胞增殖、还是细胞迁移来诱导巨大腹侧胰腺的。2） Hex的相互作用因子、在染色质上附着位点、下游调控基因的筛选及其调控胰腺发育的分子机理研究。A）利用biotinylation/proteomics筛选与Hex相结合的蛋白因子，确证它们的直接相互作用；B）通过多肽芯片及构建系列突变体确证Hex与相互作用因子的结合区域，研究突变蛋白与完整蛋白的功能差异；C）制备Hex抗体，在原肠胚期爪蟾胚胎中进行ChIP-Cloning，筛选Hex在染色质DNA上的附着位点并确证；D）检测Hex功能异常是否导致了染色质局部转录活性的变化；E）研究Hex过表达或敲降对其染色质DNA附着位点附近基因的转录水平的影响，研究相应基因介导Hex对胰腺发育调控作用的分子机理；F）通过基因芯片筛选受Hex过表达影响的下游基因，研究这些下游基因介导Hex对胰腺发育调控作用的分子机理。5. 非洲爪蟾胚胎胰腺和肝脏的体外重建。1） 在经过早期紫外线照射形成的爪蟾belly piece中选择性地恢复胰腺和肝脏形成的研究。在已有认识及本项目其它工作的基础上，我们将系统地进行胰腺和肝脏的体外重建研究，Hex、Ptf1a/p48和Pdx1以及本项目研究中获得新功能因子将是这一重建过程研究中的首选因子。2） 在体外诱导爪蟾胚胎多能性前体细胞形成胰腺及真正成熟的胰岛细胞的研究。我们将综合运用本课题中的所有研究成果，在研究胰腺早期发育机制的基础上系统地寻找在爪蟾胚胎前体细胞中重建胰腺发育及成熟的胰岛细胞的最佳方案，该方案将队友的哺乳类胚胎干细胞形成成熟的胰岛细胞具有直接的参考价值。6. 利用胚胎干细胞体系研究胰腺细胞体外分化的分子机理。1） 分别建立PDX1和 NGN3启动子驱动GFP和RFP表达的报告体系。基于BAC建立合适的报告体系pPDX1:GFP和pNGN3:RFP，并将分别其导入胚胎干细胞，通过筛选得到可以稳定表达的转基因细胞系。2） 研究RA, BMP, FGF等信号途径调控pdx1表达的分子机理。A）目前我们已有的工作成果表明，activin A可以高效诱导胚胎干细胞分化产生内胚层细胞，这使我们研究内胚层向PDX1+细胞分化的分子机制成为可能。在此基础上，通过对不同分化阶段中 PDX1表达细胞的表达谱分析，寻找伴随PDX1变化的其他信号分子；B）在内胚层的基础上，分别用RA, BMP, FGF等信号分子单独或互相组合来处理胚胎干细胞来源的内胚层细胞，通过观察PDX1的表达变化，来研究这些信号分子对胰腺命运决定的功能作用。3） 胰腺前体细胞的基因表达谱分析，胰腺前体细胞向内分泌细胞分化过程中的信号调控机制研究。A）在胰腺特化的分化阶段，分离PDX1+细胞，通过基因芯片技术分析胰腺前体细胞特征性的基因表达模式，从而为研究胰腺的命运决定提供线索；B）体外培养分选得到的PDX1+胰腺前体细胞，进行进一步的诱导分化，以Notch信号通路为线索，检测不同信号通路对分化得到的内、外分泌部细胞比例的影响，从而分析在内、外分泌部命运决定过程中起关键调控作用的信号通路，并进一步分析这些信号通路与Notch信号通路的关系；C）通过对不同分化阶段 PDX1表达细胞的表达谱分析，寻找伴随NGN3表达变化的信号分子，同时分析Sox9, Foxa2, Hnf6, Tcf2的表达情况，从而找到和NGN3表达变化直接相关的信号通路。4） 胰内分泌前体细胞的基因表达谱分析，Ngn3下游调控基因的表达谱分析。在胰腺内分泌前体细胞命运决定的相应分化阶段，分离NGN3+细胞，通过基因芯片技术分析胰腺内分泌前体细胞特征性的基因表达模式，从而为研究胰腺内分泌的命运决定提供线索。我们将在分化体系中表达NGN3的时间段中取不同的时间点，分离NGN3+细胞,利用Real-time PCR技术对Sox9, Foxa2, Hnf6, Tcf2等相关基因进行表达分析，从而建立和NGN3表达量变化相伴随的关键转录因子表达变化谱。7. 具有胰腺发育缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制研究。1） 具有胰腺发育缺陷突变体的表现型研究。通过检测内胚层及胰腺发育不同时期的分子标记，研究突变体所具有的胰腺发育缺陷表现型。2） 导致胰腺发育缺陷的致变基因克隆及其调控胰腺发育的分子机理研究。A）同全基因组多型性标记（polymorphic marker）扫描、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆重叠群（contig）的建立、零重组多型性标记的获得、候选致变基因的测序等过程定位和克隆致变基因；B）利用特异性的morpholino和mRNA回救以确证致变基因，研究其表达模式；C）运用细胞移植技术研究致变基因调控胰腺发育功能的细胞自主（autonomous）或非自主（non-autonomous）性，如果是非自主的，确定调控胰腺发育的致变基因表达组织；D）采用酵母双杂交、抗体制备、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等方法深入研究该基因调控胰腺发育的分子机理。8. 分离小鼠内胚层组织的成体干细胞，确定干细胞的分化途径以及分化的子代细胞谱。1） 利用三维培养体系，从小鼠胚胎和新生小鼠体内分离和富集内胚层组织的干细胞/前体细胞，确定其表面标记。分离小鼠胚胎和新生小鼠的多种内胚层组织的细胞，接种到由本课题组发展的三维细胞培养体系中，培养7天，通过细胞表面的标记，进行分选，分选出不同的早期细胞，在体外诱导分化，确定干细胞/祖细胞。2） 分析成体小鼠内的干细胞/前体细胞组分。利用流式细胞仪，分析所获得的干细胞/祖细胞的表面标志，明确干细胞/祖细胞的特异分选标记。3） 分析内胚层组织干细胞/前体细胞的特异基因表达模式，确定干细胞/前体细胞内特异基因表达。利用细胞分选标记，分选从小鼠胚胎、新生小鼠及成体小鼠的内胚层组织中分离出干细胞/祖细胞群，提取mRNA，进行基因表达谱分析，与分化的细胞内的基因表达谱进行对比，确定干细胞/祖细胞内的特异表达的基因，通过进一步的RT-PCR和蛋白检测，明确内胚层干细胞/祖细胞内的特异基因表达。4） 建立体外干细胞/前体细胞分化体系，确定内胚层组织的细胞分化谱。确定内胚层组织的细胞分化谱。在体外建立内胚层细胞分化培养体系，应用生长因子和小分子诱导干细胞/祖细胞定向分化形成消化道、肝或肺等内胚层细胞。建立内胚层细胞分化体系，确定细胞的分化过程与不同细胞分化的阶段的表面标志。5） 建立体内细胞分化测定体系，确定体内分化细胞谱，比较体内外分化谱的异同，明确内胚层组织的细胞分化测定手段。将从小鼠胚胎、新生小鼠和成体小鼠体内分离的干细胞/祖细胞，注射到小鼠的胚胎内，跟踪细胞的分化，确定体内细胞的分化谱。9. 在小鼠胚胎发育过程中，确定小鼠内胚层组织的干细胞/祖细胞的形成、分化的子代细胞谱与分化途径，探索内胚层组织的构筑。1） 标记内胚层特异表达基因，在成体内胚层组织内确定基因表达谱的特异性。克隆已有的工作中确定的与消化道、肝及肺等内胚层组织器官基因，制备探针，在成体小鼠体内，确定探针的特异性。2） 分离小鼠器官形成期的胚胎，确定特异基因在小鼠胚胎中的组织特异性。3） 筛选内胚层分化过程中的特异表达的基因。应用测定的特异探针，与分离的器官形成期胚胎进行杂交，确定在胚胎发育中，内胚层器官起源的细胞，跟踪细胞的分化和发育，确定器官的早期构筑与结构。4） 分离单细胞到器官形成期的小鼠胚胎，对胚胎内胚层细胞进行谱系定位，为系统分析小鼠内胚胎发育提供基础。应用测定的内胚层组织的干细胞特异探针，与分离的单个细胞到器官形成期的小鼠胚胎进行杂交，确定在胚胎发育中，内胚层组织起源的细胞，跟踪细胞的分化和发育，内胚层组织早期构筑与结构。10. 建立内胚层组织特异基因条件敲除小鼠，标记内胚层组织起源细胞，分析内胚层组织的形成与构筑的过程，探讨内胚层组织形成的分子机制。1） 确定内胚层发育的特异基因。确定本项目组内在早蟾和斑马鱼内克隆的内胚层发育的特异基因，与小鼠体内确定的基因进行比较，明确在分化与发育过程中，发挥重要作用的基因谱。确定内胚层早期形成中的靶基因。2） 构建条件性基因打靶的ES细胞，体外分析细胞的分化能力。克隆特异的内胚层形成的靶基因片段，将LacZ 和GFPcDNA插入到靶基因的ATG后面，用LoxP片段一起可以被切割的DNA片段，构建条件性基因打靶的载体，并将该载体转入的小鼠ES细胞，筛选同源重组的ES细胞，分离纯化同源重组的ES细胞，建立细胞克隆。并在体外建立分化体系，确定ES细胞的分化能力，和内胚层形成的体外过程。3） 构建条件基因打靶小鼠。将同源重组的ES细胞注射到小鼠的囊胚中，构建嵌合体小鼠，经传代形成基因打靶小鼠。利用LacZ和GFP标记内胚层早期的细胞，在胚胎发育中跟踪细胞的分化过程。4） 分析内胚层分化发育的分子基础与分子机制。将条件基因打靶的小鼠与特异表达重排酶的小鼠交配，形成特异组织器官的基因敲出小鼠，分析小鼠特异组织的形成改变和表型，确定基因活动的上下游的分子基础，初步研究内胚层特异基因活动的分子基础。课题三：正向遗传突变筛选具有内胚层器官发育或再生缺陷的突变体及致变基因的功能机制研究1. 斑马鱼肝脏和胰岛细胞再生模型的建立及ENU正向遗传突变筛选研究在肝脏或胰腺发育、肝脏或细胞再生过程中发挥重要功能的基因及其作用机制。1） 斑马鱼肝脏和胰岛细胞再生模型的建立及再生的细胞过程研究。A）建立lfabp:DenNTR和ins:ChNTR转基因系；B）用不同浓度Mtz在不同发育时期处理转基因胚胎以获得最佳的Mtz浓度和处理时间；C）撤除Mtz后，将残余肝细胞由绿色荧光转变为红色荧光（由于细胞数目较少，Mtz处理可完全杀死细胞，因此无需使用荧光转变来区别新老细胞），连续记录以观察新生细胞的分化位置和整合进入功能器官的再生过程。2) ENU化学诱变筛选具有肝脏或胰腺发育缺陷、肝脏或细胞再生缺陷的突变体及其表现型研究。A）交配获得p48:GFP-ins:ChNTR-lfabp:DenNTR（pilGRenN）三转基因系纯合子；B）以pilGRenN纯合子为载体，开展ENU化学诱变及正向遗传突变筛选，在F3代胚胎中筛选具有胰外分泌腺、细胞或者肝脏发育缺陷的突变体；C）在具有发育缺陷的突变体筛选结束后，用Mtz处理F3代胚胎，撤除Mtz后筛选具有肝脏或细胞再生缺陷的突变体；D）将具有发育或再生缺陷突变体的F2代亲本与野生型外交以恢复（recover）突变种系。E）突变体的表现型分析。3) 致变基因的克隆和功能机制研究。A）同全基因组多型性标记（polymorphic marker）扫描、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆重叠群（contig）的建立、零重组多型性标记的获得、候选致变基因的测序等过程定位和克隆致变基因；B）利用特异性的morpholino和mRNA回救以确证致变基因，研究其表达模式；C）运用细胞移植技术研究致变基因调控胰腺发育功能的细胞自主（autonomous）或非自主（non-autonomous）性，如果是非自主的，确定调控胰腺发育的致变基因表达组织；D）采用酵母双杂交、抗体制备、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等方法深入研究该基因调控胰腺发育的分子机理。E）若具有细胞或肝脏再生缺陷突变体的致变因子是母源性因子，那么此因子很有可能是在肝脏或细胞发育过程中发挥重要功能的母源性因子。我们将通过生殖细胞移植技术建立母源配子突变体（maternal-zygotic mutant），研究母源性因子功能缺失后对肝脏或者细胞的发育特别是对早期细胞分化的影响及其作用机制。2. 斑马鱼胰外分泌腺再生模型的建立及ENU正向遗传突变筛选研究在胰外分泌腺再生过程中发挥重要功能的基因及其作用机制。建立elastase:DenNTR转基因系研究胰外分泌腺再生的细胞过程，并以此转基因系为载体开展ENU正向遗传突变筛选。具体研究方案同本课题的第1部分。3. 通过增强子诱捕获得的胰腺GFP标记转基因鱼的基因定位、鉴定及功能研究。1） 对获得的胰腺GFP标记转基因鱼进行基因定位并鉴定候选基因。利用LM-PCR（linker mediated PCR）和基因组数据库寻找潜在的候选基因。2） 新基因的功能及分子机理研究。A）克隆候选基因并研究其表达模式，与相应转基因品系的荧光表达相对应；B）通过荧光融合蛋白确定新基因编码蛋白的亚细胞定位；C）研究新基因过表达或敲降后胰腺分子标记的表达变化；D）运用细胞移植技术研究新基因调控胰腺发育功能的细胞自主或非自主性，如果是非自主的，确定调控胰腺发育的新基因表达组织；F）采用酵母双杂交、抗体制备、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等方法深入研究新基因调控胰腺发育的分子机理。4. 利用转座子介导的插入突变筛选具有肝脏、胰腺或肠道发育缺陷的突变体及致变基因的功能机制研究。1） 携带转座子的转基因斑马鱼的建立。构建转基因载体pT2/SB-hsp:转座酶-转座子，将该载体与体外转录的转座酶mRNA共注入gutGFP受精卵后建立转基因系。2） 具有肝脏、胰腺或肠道发育缺陷的突变体筛选。A）利用hsp启动子在转基因斑马鱼卵子形成过程中诱导转座酶的表达和转座子的移位，从而在新产生的卵子基因组中形成新的遗传突变；B）诱导雌核发育二倍体的形成；C）在发育过程中，通过gutGFP的绿色荧光可直接筛选具有肝脏、胰腺或肠道发育缺陷的纯合突变体，用于基因组突变位点分析。D）在进行雌核发育的同时，将部分携带新遗传突变的卵细胞与野生精子外交以维持品系。3） 致变基因的克隆和功能机制研究。同本课题中第3部分的研究方案。（二）课题设置课题一：调控肝脏和肠道发育的分子机理研究主要研究内容：1. 斑马鱼体节形成早期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。2. 在斑马鱼预定的肝脏或肠道前体细胞中特异和差异表达基因的筛选及其功能机制研究。3. 肝细胞命运决定后调控肝脏发育基因的筛选与功能研究。4. 利用胚胎干细胞体系研究肝前体及肝细胞体外分化的分子机理。5. 组蛋白H3的N端三甲基化表观遗传调控机制在由胚胎干细胞到肝细胞分化过程中的功能。6. 表观遗传在斑马鱼内胚层器官发育的不同阶段的稳定性及其功能的系统研究。7. 具有肝脏发育缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制研究。8. NEMO/IKKg的K63多泛素化在调控肝脏发育中的功能与分子机理。9. Wnt信号途径及其上游调控因子KLP在斑马鱼肝脏发育中的功能机制。主要目标：本课题以重要的内胚层器官肝脏和肠道的发育为主要研究内容。开展本课题研究工作的主要目标是：谱系定位预定的肝脏前体细胞；获得预定的肝脏和肠道前体细胞的早期分子标记或关键决定因子并阐明其功能机制；获得调控肝细胞分化、肝脏形态建成或功能发挥的新基因并阐明其发挥功能的分子机理；阐明表观遗传机制调控肝细胞分化和内胚层器官发育的分子机理；阐明蛋白的K63多泛素化、Wnt信号途径及其上游调控因子KLP调控肝脏发育的功能机制。承担单位：西南大学、四川大学课题负责人：罗凌飞经费比例：45课题二：调控胰腺发育的分子机