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人类体细胞染色体标本制备与核型分析 作者：佚名 来源：中国医科大学-医学遗传学实验手册 时间：2008-5-21【实验目的】 1熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。 2熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。 【实验原理】 染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹带，表明每条染色体的特征。 【实验用品】 1采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。 2RPMI1640液体培养基、小牛血清、肝素（500U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。 32.5胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。 【实验步骤】 一外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析 1.采血及接种培养 1.1在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。 1.2常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。 1.3在超净工作台中，预先将RPMI1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（6号针头），水平摇动混匀。 1.4置37恒温培养箱中培养72小时。培养过程中每天水平摇动培养物12次，使血液均匀悬浮，再继续培养。 1.5终止培养前24小时，加入秋水仙素，使终浓度达到0.2g/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至72小时。 2制片 2.1收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。 2.21000rpm离心8分钟（注意先配平）。 2.3弃上清液，加入37预温的0.075mol/LKCl溶液8ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37恒温水浴箱低渗处理25分钟。 2.4加入1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心8分钟。 2.5弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。 2.61000rpm离心8分钟。 2.7弃上清液，重复固定一次。 2.8弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。 2.9吸取少量细胞悬液，滴23滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。 2.10将标本置Giemsa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干。 2.11显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。 二人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析 1.G显带染色体标本制备 1.1常规制片后，将标本置70烤箱中干烤2小时，自然冷却。 1.2取2.5胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45ml生理盐水，用1NHCl或1NNaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH6.87.2），置37预温。 1.3将玻片标本放入胰酶溶液中处理2545秒钟，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长。 1.4取出染色体玻片标本，置于37预温的生理盐水中，然后用蒸馏水冲洗玻片（或轻甩，除去多余的胰酶）。 1.5将玻片标本放入37预温的Giemsa染液中，染色510分钟。 1.6自来水冲洗，气干。 1.7显微镜观察。 【实验结果与分析】 一.常规染色体核型分析 1根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。 A组染色体：包括13号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 B组染色体：包括45号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。 C组染色体：包括612号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。 D组染色体：包括1315号染色体，具有近端着丝粒和随体。 E组染色体：包括1618号染色体，16号染色体着丝粒在3/8处，17号和18号染色体着丝粒约在1/4处。 F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒。 G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，为近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。 2绘图：绘出在显微镜下观察到的染色体。二G显带染色体标本分析G带显示的正常人显带核型特征（见附图1.1、1.2、1.3） A组染色体：包括13号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 1号染色体短臂：在320条带左右的分裂相上，近侧段有两条深带，第2条深带稍宽；在处理好的标本上，远侧段可显出34条浅染的深带。此臂分为3个区，近侧的第1深带为2区1带，第2深带为3区1带。长臂：副缢痕紧贴着丝粒，染色深浅不一，其远侧为一宽的浅带，近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条染色较浓。此臂分为四个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2深带为3区1带，远侧段第1深带为4区1带。 2号染色体短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。此臂分为2个区，中段两条深带之间的浅带为2区 1带。长臂：有 7条深带，第 3和第4深带有时融合。此臂分为 3个区第2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3区1带。 3号染色体着丝粒区浓染短臂：在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中远侧的一条较窄，且着色较浅，这是区别3号染色体短臂的重要特征。近侧段的深带可分为两条深带。此臂分2个区，中段浅带为2区1带。长臂：一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。在显带好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。此臂分为2个区，中段浅带为2区1带。 B组染色体：包括45号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。 4号染色体短臂：可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区。长臂：可见均匀分布的四条深带，在显带较好的标本上，远侧段的两条深带可各自再分为两条较宽的深带。此臂分为3个区，近侧段第1和第2深带之间的浅带为2区1带，远侧段的两条深带之间的浅带为3区1带。 5号染色体短臂：可见两条深带，其中远侧的深带宽而且色浓，短臂只有一个区。长臂：近侧段有两条深带，染色较浅，有时不明显；中段可见三条深带，染色较深，有时融合成一条宽的深带；远侧段可见二条深带，近末端的一条着色较浓。此臂可分为3个区，中段第 2深带为 2区1带，中段深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为 3区 1带。 C组染色体：包括612号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。 6号染色体短臂：中段有一条明显而宽阔的浅带，其中近侧段和远侧段各有一条深带，近侧深带紧贴着丝粒；在显带较好的标本上，远侧段的深带又可分为两条深带。此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1带。长臂：可见五条深带，其中近侧的一条紧贴着丝粒，远侧段末端的一条深带着色较浅。此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1带。 7号染色体着丝粒浓染。短臂：有三条深带，中段深带着色较淡，有时不明显；远侧深带着色浓宽，状如”瓶盖”。此臂分为2个区，远侧段的浅带为2区1带。长臂：有三条明显的深带，远侧近末端的一条深带着色较淡，第2和第3深带稍接近。此臂分为3个区，近侧第1深带为2区二带，中段的第2深带为3区1带。 8号染色体短臂：有两条深带，中段有一条较明显的浅带，这是与10号染色体相区分的主要特征。此臂分为2个区，中段的浅带为2区1带。长臂：可见三条分界不明显的深带，远侧段的深带着色较浓。此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。 9号染色体着丝粒浓染。短臂：近侧段和中段各有一条带，在显带较好的标本上，中段可见两条窄的深带，此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。长臂：可见明显的两条深带，副缢痕一般不着色，在有些标本上显现出特有狭长的颈部区。此臂分为 3个区，近侧的一条深带为2区 1带，远出的一条深带为3区二带。 10号染色体着丝粒浓染。短臂：近出段和中段各有一条深带，在有些标本的中段可见两条深带，但与8号染色体短行比较，其深带的分界不够清晰。此臀只有一个区。长臂：可见明显的三条带，近侧的深带较明显，远侧的两条深带较靠近，这是与8号染色体相鉴别的主要特征。此管分为2个区，近侧段的一条深带为2区1带。 11号染色体短臂：近中段可见两条靠的很近的较窄的深带在显带较差的标本上，只能看见一条宽带。此臂只有1个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒远侧段可见一条明显的较宽的深带，这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带，这是与12号染色体相鉴别的一个明显特征；在显带较好的标本上，远侧段的深带可分为两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，一般极难辨认，但它是一个分区的界标，在有些标本上近末端处还可见一条窄的淡色的深带。此臂分为2个区，上述远侧两条深带之间的浅带为2区1带。 12号染色体短臂：中段可见一条深带。此臂只有1个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒；中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带，但与11号染色体相比较这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染色体的一个主要特征；在显带好的标本上，中段较宽的深带可分为三条深带，其正中的一条着色较浓；在有些标本上，远侧段的近端还可见12条染色较淡的深带。此行分为2个区，中段正中的深带为2区1带。 X染色体其长度介于7号和8号染色体之间。短臂：中段有一条明显的深带，如竹节状。在有些标本上，远侧段还可见一条窄的、着色淡的深带。此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。长臂：可见45条深带，近中部的一条深带最明显。此臂分为2个区，近中段的深带2区1带。D组染色体：包括1315号染色体，具有近端着丝粒和随体。 13号染色体着丝粒浓染。长臂：可见4条深带，第1和第4带较窄，染色较淡。第2和第3深带较宽，染色较浓，此臂分为3个区，第2深带为2区1带，第3深带为3区1带。 14号染色体着丝粒浓染。长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带，在处理好的标本上，中段尚可见一条较浅的深带。此臂分为3个区，近侧深带为2区1带，远侧深带为3区1带。 15号染色体着丝粒浓染。长臂：中段有一条明显的深带，染色较浓，有的标本上，近侧段可见l2条淡染的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1带。E组染色体：包括 1618号染色体，16号染色体着丝粒在 3/8处，17号和 18号染色体着丝粒约在 1/4处。 16号染色体短臂：中段有一条深带，较好的标本上可见两条深带。此臂只有1个区。长臂：中段和远侧各有一条深带，有时远侧段的一条不明显，副缢痕着色浓。此臂分为2个区，中段深带为2区1带。 17号染色体短臂：有一条深带，紧贴着丝粒。此臂只有1个区。长臂：远侧段可见一条深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。此臂分为2个区，这条明显而宽的浅带为2区1带。 18号染色体短臂：有一条窄的深带。此臂只有1个区。长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带。此臂分为2个区，两深带之间的浅带为2区1带。F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒。 19号染色体着丝粒及周围为深带，其余为浅带。短臂和长臂均只有1个区。 20号染色体着丝粒区浓染。短臂：有一条明显的深带。此臂只有1个区。长臂：在中段和远侧段可见12条染色较浅的深带，有时全为浅带。此管只有1个区。 G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，具近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。 21号染色体着丝粒区着色浅。与22号染色体相比较，其长度比22号短。其长臂近侧有一明显而宽的深带。此臂分为2个区，其深带为2区1带。 22号染色体着丝粒区染色浓。与21号染色体相比较，其长度比21号长；在长臂上可见两条深带，近侧的一条着色较浓而且紧贴着丝粒，近中段的一条着色浅，在有的标本上不显现。此臂只有1个区。 Y染色体长度变化较大，有时整个长臂被染色成深带。在染色较好的标本上，可见两条深带。此臂只有1个区。图1.1 G显带染色体核型图1.2 G显带染色体核型分析图1.3 正常男性G显带染色体模式图【注意的问题】1采血时不要加入太多的肝素，因为肝素含量过多时往往抑制淋巴细胞的转化。2培养过程中培养液逐渐变黄色，说明pH发生了较大变化，将不利于细胞生长，此时可加入适量灭菌的1.4% NaHCO3溶液调整，或再加入23ml培养液的办法来校正。3培养失败的原因，一般有下述几种：培养瓶及器材洗涤不符合要求；配制溶液的双蒸水不符合要求；PHA和培养液的质量有问题，或培养液pH不符合要求；无菌操作不符合要求，发生污染；淋巴细胞对PHA反应降低，致分裂相太少。4标本质量不佳的原因：秋水仙素的处理不当，如秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，结果分裂相太少；如浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难于进行分析；低渗处理不当，低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；如果低渗处理不够，则染色体分散不佳，难以进行计数分析；离心速度不合适，收集细胞时离心的速度太低易丢失细胞，如果低渗后离心速度过高，往往使分裂相过早破裂，完整的分裂相减少；标本固定不充分，如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊，或残留胞浆痕迹，使背景不清；玻片去污不彻底，冷冻不够，使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失，或染色体分散不佳。5制备G显带染色体标本时，要严格控制胰酶消化时间，时间不足显不出带纹，时间过长，使染色体