复合蛋白酶水解低值淡水鱼工艺的响应面优化.docx

姚 芳 祁兴普 刘 萍 复合蛋白酶水解低值淡水鱼工艺的响应面优化 J 江苏农业科学 2012 40 6 229 233复合蛋白酶水解低值淡水鱼工艺的响应面优化姚 芳，祁兴普，刘 萍( 江苏畜牧兽医职业技术学院食品科技系 / 江苏省畜产品深加工及安全检测工程技术研究开发中心，江苏泰州 225300)摘要: 采用复合蛋白酶对鲢鱼蛋白进行水解研究，应用响应面分析法对水解条件进行优化。选用蛋白酶用量、温度、pH 值、水解时间 4 个因素，以蛋白质的水解度为评价指标，在单因素工艺试验的基础上，通过 4 因素 3 水平的 Box Behnken 响应面分析法优化鲢鱼蛋白质的水解条件。结果表明，最优水解条件为蛋白酶用量 2 0 g /100 g，温度54 3 ，pH 值 7 46，时间 6 h，在此条件下，水解度为 38. 42% ，与模型的预测值 38 45% 基本一致。关键词: 低值淡水鱼; 复合蛋白酶; 水解; 响应面; 优化中图分类号: TS254 4文献标志码: A文章编号: 1002 1302( 2012) 06 0229 04我国是世界淡水鱼生产的第一大国，加工率不足 5% ，其中成本低廉、高产的低值淡水鱼如鲢、鳙等占淡水鱼生产总量 的 60% 以上1，以鲜活销售为主。由于鲢鱼土腥味重，肉薄 刺多，风味不及其他淡水鱼，因此附加值较低2; 但从营养学 角度来看，其蛋白质含量达 16 6% ，氨基酸组成与人体相近， 生物价优于植物蛋白，本质上与高价鱼并无多大差距3。随 着鱼类资源的日益匮乏，对低值鱼类的高值化利用越来越受 到重视。利用低值鱼的蛋白资源制备高档调味品和营养强化 剂一直是国内外研究热点4 7。低值鱼蛋白经酶催化水解 后，水解液中含有较丰富的氨基酸和肽类等营养物质8，又 保持了鱼肉的鲜味，同时不含氯丙醇等有毒物质，应用前景较 好，附加值极高。但是，酶法水解的动物蛋白有一定苦味，苦 味肽的端基多为疏水性氨基酸，采用外切酶切除此类疏水性 氨基酸，与原苦味肽相比苦味要低得多9，一定程度上能有 效脱苦。本试验以低值鲢鱼为原料，通过响应面法优化酶解 工艺参数，旨在为低值鱼肉蛋白资源的高价值利用提供指导。1 3 方法低值鱼酶解液的制备流程 低值淡水鱼清洗绞1 3 1碎加去离子水调节 pH 值加酶恒温水解100 灭酶15 min冷却3 000 r / min 离心 15 min过滤取上清液低值鱼水解蛋白液。1 3 2 水解度的测定 水解度( DH) 是指底物蛋白质中被 水解肽键数占肽键总数的百分数，水解断裂的肽键数可通过 水解放出的氨基氮数目来测定10。它是控制水解过程的一 个重要参数，计算公式为:水解度 = ( 水解液的游离氨基酸态氮含量 原料中原有 氨基酸态氮含量) / 样品中总氮量 100%游离氨基酸态氮测定 参照 GB / T 5009 3920031 3 3酱油卫生标准的分析方法规定的方法测定游离氨基酸态氮含量。总氮量测定 参照 GB 5009 52010食品安全国家1 3 4标准 食品中蛋白质的测定规定的方法测定总氮量。酶解条件单因素设定 单因素试验设计以水解度为1 3 51 材料与方法评价指标，研究加酶量、酶解温度、pH 值、反应时间对蛋白酶水解效果的影响，每组试验重复 3 次。1 1 材料与试剂低值淡水鱼( 鲢鱼) 购于江苏省泰州市水产市场; 碱性蛋 白酶( 15 万 U / g) ( 诺维信公司) ; 风味蛋白酶( 8 0 万 U / g)( 诺维信公司) ; 胰酶( 2 万 U / g) ( 杭州三叶公司) ; 其他试剂 均为分析纯( 上海国药集团) 。1 2 仪器与设备AL204 型电子分析天平( 上海梅特勒仪器厂) ; HHS 型电 热恒温水浴锅( 上海博讯实业有限公司) ; 德尔斯 MGB 090 电动绞肉机( 广东省佛山市顺德名健电器制造有限公司) ; EL 20K酸度计( 上海梅特勒仪器厂) ; JB200 S 数显强力电 动搅拌机( 上海精密仪器厂) ; TD5A WS 型台式低速电动离 心机( 江苏金坛恒丰仪器制造有限公司) 。响应面试验设计 根据单因素试验结果，采用响应面1 3 6设计试验，运用 Box Behnken 中心组合试验设计原理11，选择对水解度显著影响的因素: 加酶量、温度、时间、pH 值，进行4 因素 3 水平的响应面试验，试验设计见表 1。表 1 Box Behnken 试验因素水平因素水平X1 : 蛋白酶用量( g /100 g)X2 : 温度( )X3 : 时间( h)X : pH 值4 1011 01 52 050556045677 581 3 7数据分析采用 F 检验对数据进行方差分析以评价模型的统计意义，采用 Design Expert 8 05b 软件分析数据。收稿日期: 2011 12 04基金项目: 江苏省泰州科技发展计划指导性项目( 编号: 2011021 ) ; 泰 州市横向项目( 编号: HZ201101) 。作者简介: 姚 芳( 1980) ，女，四川仪陇人，硕士，讲师，从事食品加 工与贮藏研究。E mail: yaofang7577 yahoo com cn。结果与分析2酶种类对鲢鱼酶解效果的影响利用低值淡水鱼酶解生产高档调味汁，其生产成本、产品2 1 230 江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 6 期质量、风味在很大程度上由酶的用量、组成、专一性决定，因此需要筛选出能高效作用于低值鱼蛋白的蛋白酶12。以鲢鱼 为底物，分别添加水解效果较好13的碱性蛋白酶、胰酶、风味 蛋白酶、碱性蛋白酶 + 风味蛋白酶( 1 1 ) 、胰酶 + 风味蛋白 酶( 1 1) 、碱性蛋白酶 + 胰酶 + 风味蛋白酶( 1 1 1 ) 各2 0 g /100 g，料液比 1 3，在 pH 值 7 5、55 下酶解 4 h，比 较各蛋白酶对鲢鱼酶解效果的影响( 图 1) 。水解度最大，其后下降。这是因为在一定范围内升高温度，反应速度加快，酶解效率也相应提高，但温度过高，酶蛋白变 性16，酶的稳定性下降，酶解效率随之降低。故适宜的酶解 温度为 55 。2 2 3 酶解时间对酶解效果的影响 称取 100 g 淡水鱼肉，水解条件为蛋白酶用量 2 0 g /100 g，pH 值 7 5，温度 55 ， 料液比 1 3，研究不同酶解时间对酶解效果的影响( 图 4) 。由图 1 可见，水解效果最好的是碱性蛋白酶 + 风味蛋白酶( 1 1) 的组合，风味蛋白酶是一种在中性或微酸性条件下 酶解蛋白质的真菌蛋白酶和肽酶的复合体，包含有内切蛋白 酶和外切 肽 酶 2 种 活 性，能 从多肽链内部和末端水解肽 键14，达到深度水解和脱苦的目的，碱性蛋白酶是一种内切 丝氨酸蛋白酶，在鱼类资源的酶解中具有显著的优越性15， 故选用碱性蛋白酶和风味蛋白酶( 1 1 ) 的复合酶作为试验 用酶。2 22 2 1酶解工艺参数的单因素试验分析蛋白酶用量对酶解效果的影响 选用 1 1 的碱性蛋由图 4 可见，随着时间的增加，水解度不断增加，5 h 以内，水解度迅速增加，超过 5 h，水解度缓慢增加，综合考虑，适 宜的酶解时间为 5 h。2 2 4 初始 pH 值对酶解效果的影响 称取 100 g 淡水鱼 肉，水解条件为蛋白酶用量 2 0 g /100 g，温度 55 ，酶解5 h， 料液比 1 3，研究不同 pH 值对酶解效果的影响。由图 5 可 见，pH 值对酶水解的影响较小，风味蛋白酶的最适 pH 值为7 0，但在很广的 pH 范围内都有较好的活性14，碱性蛋白酶 的最适 pH 值在 7 8 之间，淡水鱼下脚料中含有的内源性蛋 白酶在广泛的 pH 范围内都具有活性。综合考虑，适宜的 pH 值为 7 5。白酶和风味蛋白酶作为试验用酶，称取 100 g 淡水鱼肉在 pH值 7 5、55 下酶解 4 h，料液比 1 3，研究蛋白酶不同添加 量对酶解效果的影响( 图 2) 。由图 2 可见，随着酶添加量的增加，鱼蛋白水解度也随之增加，当酶量超过 1 5 g /100 g 后，水解度的增量趋于平缓，综 合经济效益考虑，适宜的加酶量为 2 0 g /100g。酶解温度对酶解效果的影响 称取 100 g 淡水鱼肉，2 2 2水解条件为蛋白酶用量 2 0 g /100 g，pH 值 7 5，酶解 4 h，料液比 1 3，研究不同酶解温度对酶解效果的影响( 图 3 ) 。由 图 3 可见，随着酶解温度的升高，鱼蛋白水解度增加，55 时姚 芳等: 复合蛋白酶水解低值淡水鱼工艺的响应面优化 231 2 3 双酶水解鱼蛋白的响应面试验分析复合蛋白酶水解低值鲢鱼蛋白的响应面分析试验根据 Box Behnken 设计进行了 29 组试验，其中 5 组中心点重复 试验，结果见表 2，回归模型的方差分析见表 3。利用 Design Expert 8 05b 软件对表 2 数据进行多元回归拟合，得到复合 蛋白酶水解低值鲢鱼蛋白的回归方程如下: DH = 130. 0367 + 15. 18X1 + 4. 944 3X2 1. 566 7X3 + 5. 216 7X4 0. 04X1 X2表 3 回归模型方差分析表方差来源平方和自由度均方F 值P 值模型X1X2X3X4X1 X2 0 000 1 0 0001 0 000 2 0 000 1 0 682 30 169 70 722 80 169 71 000 01 000 00 169 7 0 000 1 0 000 1 0 437 70 104 571 6859 410 482 340 003 3330 0400 002 50 0400 0000 0000 0401 508 120 0120 0580 270 200 06871 95141111111111111114104285 1259 410 482 340 003 3330 0400 002 50 0400 0000 0000 0401 508 120 0120 0580 0190 0200 017268 313 113 0625 15122 660 172 100 132 100 0000 0002 1078 86425 740 643 0122+ 0. 05X1 X3 0. 4X1 X4 + 0. 2X3 X4 1. 926 7X1 0. 044 8X2X X1 322+ 0. 043 3X3 0. 376 7X4X1 X4X2 X3X2 X4X3 X4X1 2X2 2X3 2X4 2 残差 失拟 误差 总和表 2Box Bchnken 试验设计及结果试验号X1X2X3X4水解度( % )12345678910111213141516171819202122232425262728290101 10 10 100 10100010 11000 100010010 1 1001 1 10 11010010 1100000000 101000 10 10 1100000 100110101 1000100 1 1 10010000 10 10100 100011136 137 534 838 432 735 233 435 732 034 835 133 235 736 536 234 936 337 934 533 537 335 436 436 334 036 036 735 637 61 170 476 8注: R2 = 0 996 3，R2= 0 992 6; “”表示差异极显著( P Adj0. 001) ，“* ”表示差异显著( P 0 05) 。分析可以看出，失拟项不显著( P = 0 476 8 0 05) ，表明该模型是稳定的，能很好地预测酶解各因素对水解度的影响。响应面图形是响应值对应自变量蛋白酶用量、温度、时 间、pH 值所构成的一个三维空间图，可直观地反映出各自变 量对响应值的影响。由图 6 可知，各因素对水解度影响的大小顺序为蛋白酶 用量 时间 温度 pH 值; 随着蛋白酶用量的增加，时间的 延长都能显著地提高水解度; 温度和 pH 值过高或过低都不 能使水解度达到最大，只有取某个适中值时，才可使水解度达 到最大值; 各因素之间的交互作用对水解度的影响很小。2 4 验证试验根据 Box Behnken 试验所得的结果和二次多项回归方 程，利用 Design Expert 8 05b 软件中的 Optimization 分析得出优 化结果，即获得较高水解度的条件为蛋白酶用量 2 0 g /100 g， 温度 54 34 ，时间 6 h，pH 值 7 46，复合蛋白酶水解低值白 鲢鱼蛋白的水解度预测可达到 38 45% 。为了检验模型预测 的准确性，在最佳酶解条件下进行试验，实际测得的水解度为38 42% ，可见该模型能较好地预测复合蛋白酶对低值淡水鱼 的水解情况。从表 3 看出，回归方程本身对水解度的影响高度显著( F = 268 31，P 0 000 1) 。试验中一次项 X1 、X2 、X3 及二次22项 X1 、X2 对水解度的影响极显著，交互项对水解度的影响不显著。表明在复合蛋白酶水解低值鲢鱼蛋白的过程中，各 个因素对水解度的影响不是简单的线性关系，蛋白酶用量、水解温度和水解时间对水解度有极显著的影响，各因素之间的交互作用对水解度没有造成显著影响。由统计学计算得出的模型 R2 值为 0 996 3，说明模型有3 结论本试验在单因素试验基础上，以水解度为响应指标，通过4 因素 3 水平响应分析对碱性蛋白酶与风味蛋白酶 1 1 组 成的复合酶水解低值淡水鱼工艺条件进行了优化，经方差分 析和响应面图得知各因素对水解度影响的大小顺序为蛋白酶 用量 时间 温度 pH 值，各因素之间的交互作用对水解度 的影响很小。最佳水解条件为蛋白酶用量 2 0 g /100 g，温度54 3 ，pH 值 7 46，时 间 6 h，在 此 条 件 下，水 解 度 为38. 42% ，与模型的预测值 38 45% 基本一致。所得的酶解液很好的精密度; R2 = 0 992 6，说明该模型能解释 99 26% 响Adj应值的变化，仅有总变异的 0 74% 不能用此模型来解释，说明该模型拟合程度好，用该模型对复合蛋白酶水解低值淡水 鱼蛋白的水解过程进行优化是合适的。从模型的失拟性方差 232 江苏农业科学2012 年第 40 卷第 6 期可喷雾干燥加工成可溶性食用鱼蛋白粉，或经调味加工后制成特殊风味的调味品或经调配制备多肽饮料等，使低值淡水 鱼高值化。J 食品科技，2007，32( 2) : 159 1615赵谋明，崔 春，刘 珊 低值鱼蛋白酶解产物制备不同肉香型 热反应物J 食品与生物技术学报，2006，25( 3) : 1 66刘 红，杨荣华，戴志远，等 利用鲢鱼制备肉味香精及其香气成 分的分析J 中国食品学报，2010，10( 2) : 149 1537Dohmoto N Development of a new type fish sauce using the soy sauce fermentation methodJ Nippon Suisan Gakkaishi，2001，67 ( 6 ) :1103 11098陈 彦，王明蓉，沈 洁 低值鱼蛋白的酸酶复合水解工艺研究J 食品科学 2006，27( 8) : 200 2049何 慧，王 进，裴 凡，等 蛋白质水解物与苦味的构效关系及 脱苦研究J 食品科学，2006，27( 10) : 571 573( 下转第 233 页)参考文献:1张 慜，张骏 国内外低值淡水鱼加工与下脚料利用的研究进展J 食品与生物技术学报，2006，25( 6) : 115 120，1262孔保华，耿 欣，刁新平 鲢鱼肉的营养及理化特性的研究J渔业现代化，2002，4: 33 353张 俊 低值淡水鱼综合利用新技术研究D学，2006无锡: 江南大4刘汉文，李 智 利用低值鱼生产氨基酸调味基料工艺的研究江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 6 期 233 周剑忠，张丽霞，单成俊 黑莓清汁生产中酶解工艺优化J 江苏农业科学，2012，40( 6) : 233 235黑莓清汁生产中酶解工艺优化周剑忠，张丽霞，单成俊( 江苏省农科院农产品加工研究所，江苏南京 210014)摘要: 以黑莓鲜果为原料，采用两段酶解工艺，通过单因素和正交试验，研究黑莓清汁生产过程中的酶解工艺。结果表明，在第 1 阶段的黑莓浆中加入果浆酶，明显提高黑莓出汁率，最佳的酶解条件为果浆酶的添加量 0 15% 、酶 解温度 50 、酶解时间 2 5 h; 在第 2 阶段的黑莓汁中加入果胶复合酶，明显提高黑莓清汁的透光度，最佳的酶解条件 为加酶量 0 055% 、酶解温度 45 、酶解时间 2 2 h。关键词: 黑莓清汁; 酶解工艺; 果浆; 复合酶中图分类号: S255 44文献标志码: A文章编号: 1002 1302( 2012) 06 0233 03黑莓属于蔷薇科悬钩子属，鲜果柔软多汁，色泽艳丽，风味醇美，具有丰富的营养价值，被称为超级水果1，2。由于黑 莓收获期短，容易腐烂，除少量鲜食外，大部分需速冻储存，逐 步加工利用。目前，我国的黑莓大部分以冻果的形式出口，附 加值较低。将黑莓加工成黑莓汁，不仅可以延长供应期，而且 可以进一步开发和利用。但是黑莓汁生产存在出汁率低、易 产生混浊和沉淀，影响了黑莓加工产业的发展。在黑莓破碎过程中，添加适量果胶酶制剂或与纤维素酶 结合使用，可明显提高出汁率、可溶性固形物、透光度。果胶 酶酶解澄清技术在苹果、阳桃、猕猴桃、桑果、荔枝、柑橘等果 汁澄清方面已有较多报道3 8。本研究旨在优化黑莓汁生产 中的酶解工艺，制备出汁率高、澄清透明、稳定性好的黑莓清 汁，满足市场需求。股份有限公司生产) ; HH 系列超级恒温水浴锅; DS 1 高速组织捣碎机等。黑莓清汁的酶解制备工艺流程:1 3果浆酶果胶复合酶黑莓鲜果清洗打浆酶解榨汁酶解灭酶过滤黑莓清汁。黑莓鲜果清洗后，用打浆机打浆，果浆酶用去离子水稀释10 倍后加入黑莓浆中，保温搅拌一定时间后，榨汁，将果胶复 合酶加入黑莓汁中，酶解一定时间后，加热 80 维持 10 min， 硅藻土过滤，获得黑莓清汁。试验设计1 41 4 1 单因素试验1 4 1 1 果浆酶添加量对黑莓出汁率的影响 取 5 份黑莓 浆样 品 ( 500 g / 份 ) ，分 别 添 加 0 10% 、0 15% 、0 20% 、0. 25% 、0 30% 的果浆酶，在 50 下酶解 2 h，榨汁，计算出汁 率:1 材料与方法1 1 材料黑莓( Hull，单冻) ，南京新得力食品有限公司; 果浆酶、果 胶复合酶，甘肃华羚生物科技有限公司。1 2 主要仪器与设备紫外可见分光光度计( UV 1600 PC 型，上海美谱达仪 器有限公司生产) ; 精密电子天平( LC 210 2，德国赛多利斯出汁率 = 黑莓浆的重量 100%黑莓果的重量果浆酶酶解温度对黑莓出汁率的影响 取 5 份黑1 4 1 2莓浆样品，分别添加 0 2% 果浆酶，在 35、40、45、50，55 酶解时间设为 2 h，榨汁，计算出汁率。1 4 1 3 果浆酶酶解时间对黑莓出汁率的影响 取 5 份黑 莓浆样品，分别添加 0 2% 果浆酶，在 50 条件下，分别酶解1 0、1 5、2 0、2 5、3 0 h，榨汁，计算出汁率。收稿日期: 2011 12 31基金项目: 江苏省农业科技自主创新资金编号: CX( 10) 233。作者简介: 周剑忠( 1965) ，男，研究员，研究方向为食品微生物及生 物技术。Te