无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程.doc

无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。依据：中国药典2015年版药品生产质量管理规范2010年修订中国药品检验标准操作规程2010年版责任：QC化验员对实施本规程负责。内容:1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。2、材料及设备2.1 生化培养箱2.2 生物安全柜2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供）2.4 灭菌试管、灭菌注射器2.5 0.9%无菌氯化钠溶液2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。3、无菌检查培养基的适用性检查3.1无菌性检查取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置3035，胰酪大豆胨液体培养基置2025，培养14天，应无菌生长。3.2灵敏度检查3.2.1菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC(B) 63501 生孢梭菌Clostridium sporogenes CMCC(B) 64941 白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98001 黑曲霉Aspergillus niger CMCC(F) 980033.2.2菌液制备3.2.2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液制备3.2.2.1.1 取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或胰酪大豆胨琼脂培养基上， 3035培养1824小时，取新鲜传代菌种一支待用。取一支灭菌中试管，加入3ml 0.9%无菌氯化钠溶液，把新鲜传代菌种培养物用接种环轻轻刮取，在加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的试管壁上研磨，使之成为均匀悬液。3.2.2.1.2 取菌悬液1ml于比浊管中，用0.9%无菌氯化钠溶液逐步稀释至与标准管的浊度一致。记录下所加入的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量，余下的2ml菌液盖上试管塞以备用。3.2.2.1.3 打开试管塞，取1ml菌液于中试管中，加入比浊时所需的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量一致的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，此时试管中的细菌浓度与标准比浊管相一致。根据细菌浊度标准菌数表的菌数，将菌悬液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9无菌氯化钠溶液系列稀释至不大于100cfu/ml。3.2.2.1.4 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液制备方法同金黄色葡萄球菌。3.2.2.2 生孢梭菌菌悬液的制备3.2.2.2.1取生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上， 3035培养1824小时， 取一支灭菌中试管，用灭菌注射器吸取硫乙醇酸盐流体培养基中底部三分之二处的新鲜菌液1ml，加入3mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，轻轻混匀，使之成为均匀悬液。3.2.2.2.2 比浊稀释方法同金黄色葡萄球菌，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液系列稀释至不大于100cfu/ml。3.2.2.3 白色念珠菌菌悬液的制备3.2.2.3.1 取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上， 2025培养2448小时，取新鲜传代菌种一支待用。取一支灭菌中试管，加入3mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，把新鲜传代菌种培养物用接种环轻轻刮取，在加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的试管壁上研磨， 使之成为均匀悬液。3.2.2.3.2 取菌悬液1ml于比浊管中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液逐步稀释至与标准管的浊度一致。记录下所加入的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量，余下的2ml菌液盖上试管塞以备用。3.2.2.3.3 打开试管塞，取1ml菌液于中试管中，加入比浊时所需的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量一致的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，此时试管中的细菌浓度与标准比浊管相一致。根据细菌浊度标准菌数表的菌数，将菌悬液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9无菌氯化钠溶液系列稀释至不小于100cfu/ml。3.2.2.4 黑曲霉菌悬液的制备3.2.2.4.1 取黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025培养57天，取新鲜传代菌种一支待用，打开试管塞，加入35ml 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，轻轻振荡，用灭菌注射器吹打，将孢子洗脱。3.2.2.4.2 然后用注射器吸出孢子悬液至无菌中试管内，与比浊管进行比浊，并用0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液系列稀释至小于100cfu/ml。3.2.2.5.菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。3.2.3培养基接种及培养3.2.3.1.按硫乙醇酸盐流体培养基及胰酪大豆胨培养基固体粉末的处方量配制成液体培养基，并按规定的温度和时间进行湿热灭菌，待用。3.2.3.2.取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，3035培养3天，逐日观察结果。3.2.3.3.取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，2025培养5天，逐日观察结果。3.2.4结果判定： 3.2.4.1 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管