噪声对鲤鱼的影响-----用RIA放射免疫法测定血液的皮质醇含量.doc

噪声对鲤鱼的影响用RIA放射免疫疗法测定鲤鱼血液中皮质醇含量生命科学学院2012级生物科学2班 小组成员：佐合然古丽20120513211胡睿20120513194曾悦20120513203王蕾20120513204宋鑫娅20120513210 一、研究背景 人为活动噪声能影响鲸、鸟类和鱼类的日常行为、摄食和生态学过程,研究表明,长期暴露于噪声等应激状态下会导致生物体处于一种异平衡负荷,生物体适应异平衡付出的代价是造成能量的消耗,进而造成机体各项机能的下降。噪声轻者可致捕食、种间交流和洄游等能力下降,重者的可屏蔽动物听觉或引起听觉的暂时性失聪。研究发现,在不考虑鱼类听觉阈值的情况下,噪声能引发鱼类的内分泌学胁迫应答。脊椎动物通过神经内分泌激素对强烈刺激所作出的反应将导致其生理或行为上的预警反应,皮质醇水平是衡量预警反应的重要生理指标。例如:拥挤和剧烈振荡胁迫造成草鱼血液内皮质醇含量大幅度升高,亚致死量重金属和高密度饲养模式都能提高机体内皮质醇水平,环境温度的变化也影响裸盖鱼()皮质醇的反应。研究发现,噪声可以促使3种淡水鱼皮质醇的分泌,欧洲大西洋鲑鱼()与鲈鱼()呈现相同的应激答。目前,噪声对生化压力的反应研究主要集中于哺乳动物,而对于海洋鱼类和淡水鱼类对噪声应激的反应研究资料相对匮乏。随近几年淡水生态系统的开发活动的升温,在淡水环境中,船舶噪声会对鱼类产生胁迫且此类问题日益突出,本文在实验条件下就船舶噪声对重庆市长江流域的淡水鱼鲫鱼对船舶噪声的影响的现象研究，以期为淡水生物应激生物学提供科学资料。（一）研究目标1、船舶噪声是否会对鲤鱼的内分泌造成影响。2、鲤鱼对于船舶噪声的影响机体是否有相应的应对措施。3、人类对于解决船舶噪声对鲤鱼的影响可以采取什么样的方式。二、研究方法与步骤（一）实验方法选择放射免疫法(RIA）。根据实验分析，本实验采用竞争性RIA，又称传统RIA优点：经济，简便，通用。（二）实验原理 实验基本原理是当内源性（未标记）的皮质醇和标记的皮质醇在一起孵育时，它们相互竞争抗体 ，把与抗体结合的皮质醇的量和已知的标准量进行比较而定量，即根据被测定的抗原物质和其标记物（标记抗原）同特异性抗体之间存在着竞争性的结合。主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag +已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物AgAb+未知抗原与抗体复合物Ag Ab+游离标记抗原Ag （去除）（未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关）。若以Ag和Ag*分别代表待测抗原和标记抗原，Ab代表抗体，AgAb和Ag*Ab分别代表非标记的和标记的抗原抗体复合物，则当Ag与Ag*同时存在时，这一系统呈如图所示的平衡关系：在Ab恒定时，由于Ag的存在而使Ag*Ab的产量减少。若F代表未结合的Ag*，B代表Ag*Ab复合物，则B/F与Ag之量存在函数关系。若以B/F为纵坐标，Ag浓度（ng/ml）为横坐标，则可绘制出剂量反应标准曲线。测量未知样品时，只需在同样条件下测量B和F的放射性，即可由标准曲线求出被测样品的浓度，而不需纯化样品。本方法要求有高纯度的标记抗原，测定标准曲线时要寻找合适的标准品，标准品的免疫活性应与待测样品相当，且不含放射性免疫干扰物。竞争性RIA法，根据加样顺序与温育次数的区别，反应方式分三种：平衡法，顺序加样法，急诊检测法。此次实验采取顺序加样法，即先将非标记抗原（被测物与标准品），与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后。加入标记抗原，再作第二次温育后，分离B（复合物）与F（游离物）。（三）、实验步骤（1） 取正常鲤鱼血样从驯养于水族箱的未受刺激的鲤鱼中，取出3条，直接放入0.1g/LMS-222溶液中。此过程要快，尽量不要惊动水族箱中剩下的鱼，以免它们产生应激反应。当麻醉的鱼鳃盖停止运动时，便可取血样。一手抓住鱼，另一手擦干躯干和尾部的水，用剪刀从尾柄处切断尾部，用含量少量肝素1ml注射器（不要针头）直接从血液流出的地方收集血液（尽量取），放入微量离心管中，立即离心。小心取出血浆，移到另一微量离心管中，贮存于冰箱（4）中。（2） 取处于噪声状态的鲤鱼血样单次刺激和重复刺激噪声源强均为138和155两个水平, 单次刺激为实验初期以噪声源刺激10后在每天的规定时间点取样, 重复刺激为每隔24以固定源强的噪声刺激10, 作用停止30后取样;梯度噪声刺激源强分别为112(对照组)、138 、144 、146 、151和155等6个梯度水平, 刺激时间均为10。（3） 皮质醇的放射免疫测定测定前，所有的试剂、皮质醇标准品、测定管和血浆样品都升到室温。（1） 将皮质醇标准品稀释10倍：准确取50ul标准样品于一个干净的、已写了标签的小试管内，加450ul重馏水,震荡使之均匀混合。（2） 对每个血样分别稀释：1）1:10,50ul血样+450ul重馏水；2）1:100,10ul血样+990ul重馏水（3） 根据下表将塑料测定管（12mm75mm）编号。每一样品都有两个平行管。测定管编号 皮质醇标准品或样品1,2 皮质醇标准品:0ug/dL（1/10L,即100mL）3,4 皮质醇标准品:2.5ug/dL5,6 皮质醇标准品:5ug/dL7,8 皮质醇标准品:10ug/dL9，10 皮质醇标准品:20ug/dL11，12 皮质醇标准品:40ug/dL13，14 皮质醇标准品:60ug/dL15，16 血浆样品（对照）:100mL/L(即稀释1:：10，下同)17，18 血浆样品（对照）:100mL/L(即稀释1:：10，下同)19，20 血浆样品（应激5）:100mL/L21，22 血浆样品（应激5）:10mL/L23，24 血浆样品（应激30）:100mL/L25，26 血浆样品（应激30）:10mL/L27，28 血浆样品（应激60）:100mL/L29，30 血浆样品（应激60）:10mL/L（4） 以30s或1min的间隔，在对应的管号中加入20uL稀释的皮质醇标准品或血浆样品。测定的标准性很大程度上取决于加样是否准确，所以实验前必须熟练掌握加样器的操作方法。（5） 在每一测定管中准确加入1mL皮质醇RIA示踪溶液，震荡均匀。（6） 室温下孵育90min。（7） 以加样时同样的时间间隔（30s或1min）用抽滤方法吸走上清液。要保证吸走所有上清液体。（8） 加4mL重馏水，再吸走所有上清液体。（9） 在-射线测定仪中测定，每管测定10min。（10） 取两支平行管的每分钟计数的平均值，减去本底。（4） 实验结果计算以下列公式计算：结合率AB/AB(o)=皮质醇标准品或血样的放射性活度 100 零标准品（管1、管2的放射性活度）以皮质醇标准品测定的结合率为纵坐标，皮质醇标准品的含量为横坐标，在对数函数坐标纸上绘出标准曲线，然后根据血样测定的结合率（AB/AB(o)值），从标准曲线上查出血样的皮质醇含量。如果样品作10mL1L稀释的，则其含量要乘上10倍。分析比较皮质醇含量在鲤鱼正常状态和处于应激状态（噪声处理后）血样中的差异。三、研究方案根据测定鲤鱼血液中皮质醇的含量来测试噪声对鲤鱼的影响。本方案采用RIA放射免疫法，分析比较皮质醇含量在鲤鱼正常状态和处于应激状态（噪声处理后）血样中的差异，得出如今船舶噪声对于鱼类的影响。四、可行性分析船舶采用液压传动这种传动方式日益增多，特别在船舶辅机和特种机械，如舵机、锚机、 起货机、减摇鳍、可变距推进器等上用得更多，其原因是船舶要求辅机具有较轻的重量指标和较好的控制品质。在现代超大型船舶和海洋工程中，需要与之相适应的大功率、高效率的液压传动系统。随着高压、高速、大容量液压元件的大量采用，使系统振动噪声随之加剧。声音超过 7 0 d B( A) 便成为噪声。使人听起来极不舒服，甚至使动物烦燥不安，噪声作为污染已经日益受到人们的重视。因此，研究和分析液压噪声和振动对鲈鱼的影响，减少、降低振动和噪声，对改善环境噪声污染、保护鱼类有着积极而深远的意义。 高速船由于舱室密封性好，故舱室噪声的主要成分是低频结构声，空气噪声占的比重较小。在船舶液压传动系统中，各元件或部件产生噪声和传递噪声程度不同，下表列出了其排序。液压元( 部) 件产生和传递噪声程度排序元件与部件名称产生噪声名次传递噪声名次液压泵12溢流阀23压力阀33节流阀44方向阀53液压缸52油箱51管路62船舶液压系统的噪声主要有机械噪声和流体噪声两种。机械噪声包括回转体的不平衡，电动机噪声和联轴器引起的噪声。流体噪声主要包括液压泵的流体噪声，阀的流体噪声和液压冲击。噪声污染逐渐引起人们的关注，为控制噪声采取了多种方法。噪声橡胶减振垫和阻尼涂层均是减小结构声传递的有效措施；为了增加隔声量，总布置设计时，机舱和客舱之间应设过渡舱室；结构设计应加大机舱壁的隔声量，机舱前壁面向机舱的一面还可敷设吸声材料；客舱内要选择低噪声的空调和通风管路；并可适当布置吸声材料，窗帘、地毯亦可增加吸声量；机舱门尽可能不要面向客舱，应向尾；进、排气管道要设消声器，要优选消声性能好，结构尺寸小，重量轻的消声器.5、 项目实施（一）项目详细工作内容：挑选健康的鲤鱼，用丁香酚麻醉后移转入实验水箱中, 稳定24以上进行实验。刺激实验于300塑料水箱中进行。每箱放置3，每一实验组设置2个平行。船舶噪声源采用水听器(1020)、水下声音水平()测量仪( 1020)和高频数字数据录音机(索尼244)在3.5万船舶满载经过时现场录制。声信号由基于个人电脑的 (1.11)软件和 ( 4.03)软件分析处理后存储, 以笔记本电脑( 43)配合音箱信号放大器为音频输出, 水下扬声器置于容器中间单次刺激和重复刺激噪声源强均为138和155两个水平, 单次刺激为实验初期以噪声源刺激10后在每天的规定时间点取样, 重复刺激为每隔24以固定源强的噪声刺激10, 作用停止30后取样;梯度噪声刺激源强分别为112(对照组)、138 、144 、146 、151和155等6个梯度水平, 刺激时间均为10。（二）皮质醇测试 实验结束后, 鱼体在3 5内用丁香酚深度麻醉, 5注射器尾部脊椎取血, 血液样品于低温下凝固1 2, 8000/离心取上层血清, 置于-70超低温冰箱中保存待测。血清中皮质醇的测定按照RAI方法进行。对实验结果利用11.5统计软件分析。（三）项目预期结果： 鱼类受单次刺激后血液中皮质醇水平：实验周期内, 噪声刺激鱼后, 鱼类血液中皮质醇含量先上升、后下降, 后逐渐恢复原有水平或维持在较高的水平, 稳定后受噪声刺激越大的实验组皮质醇含量高于受噪声刺激较低的实验组。 鱼类受重复噪声刺激后血液中皮质醇水平：鱼类对先前所经历的应激过程可能存在着某种生理记忆。（4） 项目组织形式 承担单位为重庆师范大学生命科学学院水生生物学实验室，成员曾悦王蕾负责买鱼，宋鑫娅，古丽负责对鱼进行噪音实验，胡睿进行数据分析。（5） 项目预算 鲤鱼采购400元，采购鱼的交通费100元，总计500元。参考文献:1 Demers N E, Bayne CJ. The immediate effects of stress on hormones andplasma lysozyme in rainbow trout J . Developmental & Comparative Immunology, 1997, 21: 3633732 Pickering A D. Environmental stress and the survival ofbrown trout, Salmo trutta J. Freshwater Biology, 1989, 21:47553 林浩然，刘晓春.鱼类生理学实验技术和方法.2006,12:106-109.4 施慧雄, 焦海峰 , 尤仲杰 , 王亚, 李松海, 徐继林, 杨家锋.船舶噪声对鲈鱼和大黄鱼血浆皮质醇水 平的影响.生态学报2010, 30(14):37603765.5 王文博, 汪建