第五章 基因表达与调控.doc

第五章 基因表达调控 （Regulation of Gene Expression） 第一节 基因表达调控基本概念与原理 一、 基因表达的概念 二、 基因表达的特异性 三、 基因表达的方式 四、 基因表达调控的生物学意义 五、 基因转录激活调节的基本要素一、基因表达的概念基因表达 ：是指生物体基因组种结构基因所携带的遗传信息经过转录及翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定生物学功能的全过程。 基因表达产物：各种RNA(tRNA、mRNA和rRNA)以及蛋白质、多肽。 二、基因表达的特异性 （一）时间特异性 往往与细胞或个体的特定分化、发育阶段相适应，又称阶段特异性。（二）空间特异性 由细胞在各组织器官的分布差异所决定的，故又称为细胞特异性或组织特异性。三、基因表达的方式 （一）组成性表达 管家基因：在生命全过程都是必需的、且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。组成性基因表达 ：管家基因较少受环境因素的影响，在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续表达。（二）诱导和阻遏表达诱导表达 在特定环境信号刺激下，基因表现为开放或增强，表达产物增加。阻遏表达 在特定环境信号刺激下，基因被抑制，从而使表达产物减少。（三）协调表达 协调表达 在一定机制控制下，功能相关的一组基因，协调一致，共同表达。四、基因表达调控的生物学意义（一）适应环境变化、维持细胞增殖、分化（二）维持个体生长、发育 五、基因转录激活调节基本要素 （一） 特异DNA序列（二） 调节蛋白 （三） RNA聚合酶（一）特异DNA序列1. 原核生物的特异DNA序列 原核生物的基因表达与调控是通过操纵子机制实现的 操纵子： 是由功能上相关联的多个编码序列（2个以上）及其上游的调控序列（包括操纵序列、启动序列和调节序列）等成簇串联在一起，构成的一个转录协调单位。操纵子结构：图编码序列：规定蛋白质结构，又称结构基因；多顺反子mRNA：由多个结构基因串联在一起，受同一个启动序列调控，转录生成一个mRNA, 翻译生成多个蛋白质,称此为多顺反子mRNA.原核生物的共有序列原核生物的启动序列，在距离转录起始点10区和35区往往含有一些重要的保守序列（共有序列）。 10区：含TATAAT序列，又称Pribnow盒。 35区：含TTGACA序列。图：2. 真核生物的特异DNA序列 真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异DNA序列，称为顺式作用元件。 顺式作用元件能够被转录调节蛋白特异识别和结合，从而影响基因表达活性。 顺式作用元件又分：启动子、增强子、沉默子（1）启动子 是RNA聚合酶结合位点及其周围的一组转录调控组件（包括转录起始点以及典型的TATA盒）。 （2）增强子 是增强启动子转录活性的DNA序列，并决定组织特异性表达。 （3）沉默子 能够对基因转录起阻遏作用的DNA片段，属于负性调控元件。 （二）调节蛋白1. 原核生物的调节蛋白特异因子：决定RNA聚合酶对启动序列的特异识别和结合能力；(RNA聚合酶的s因子)阻遏蛋白：通过与操纵序列结合，阻遏基因转录；（由调节基因表达的阻遏蛋白）激活蛋白：与启动子上游DNA序列结合，促进RNA聚合酶与启动序列结合，促进基因转录。（CAP分解代谢物基因活化蛋白）2.真核生物的调节蛋白 反式作用因子：能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式作用因子。 按其功能不同，常有以下三类：（基本）转录因子 ；转录调节因子：DNA-蛋白质；共调节因子：蛋白质-蛋白质（1）基本转录因子：是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合、并启动转录的一类调节蛋白。（参与构成基础转录装置所需的一类通用转录因子） 真核生物 RNA聚合酶（ RNApol ）识别启动子所需的转录因子（TF）有多种亚类：TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I等。 其中TFD最先、最直接与启动子TATA盒结合的转录因子，然后按一定时空顺序依次结合RNApol 和其他转录因子，形成一个转录前起始复合物（PIC）。 (2) 转录调节因子：这类调经蛋白能识别并结合转录起始点的上游激活序列和远端的增强子元件，通过DNA蛋白质相互作用而调节转录活性。 起激活转录作用转录激活因子； 阻遏转录作用转录阻遏因子。（3）共调节因子首先与转录因子或转录调节因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，以调节转录活性。 如果与转录激活因子有协同作用共激活因子； 与转录阻遏因子有协同作用共阻遏因子。反式作用因子的特殊功能域 ：DNA结合域；转录激活域；结合其他蛋白质的功能域。(三) RNA聚合酶 1.启动子与RNA聚合酶活性 启动子核苷酸序列影响与RNA聚合酶的亲和力。 2.调节蛋白与RNA聚合酶的活性 调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA酶活性。六、基因表达的多级调控基因结构活化转录水平 转录起始 转录后加工转录后水平 转录产物的转运 翻译调控翻译水平 翻译后加工第二节 原核生物基因转录调控 一、乳糖操纵子调节机制图 乳糖操纵子结构基因表达产物（图）当培养基中乳糖浓度降低而葡萄糖浓度升高时当培养基中乳糖浓度升高而葡萄糖浓度降低时二、色氨酸操纵子的调节机制 色氨酸操纵子（trp operon）：阻遏型操纵子；主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。当细胞内缺乏色氨酸时，此操纵子开放；而当细胞内合成的色氨酸过多时，此操纵子被关闭。 色氨酸操纵子的调节机制（图）三、原核生物基因表达调控的特点 主要在转录水平进行调节1） 因子的特异启动作用 2） 操纵子调控机制具有普遍性3） 结构基因进行多顺反子转录4） 阻遏蛋白阻遏转录具有普遍性第三节 真核生物基因表达调控一、真核生物基因组特点 （一）基因组结构庞大 人类的单倍体基因组由 3X109 的核苷酸组成，含有大约2.6 3.9万个基因。（二）形成染色体结构 真核生物的基因组是以DNA和蛋白质结合形成染色体结构形式而存在于细胞核。（三）单顺反子 真核基因的转录产物一般是单顺反子 。 单顺反子：一个编码基因转录生成一个mRNA分子，并指导翻译一条多肽链。（四）重复序列 真核生物基因普遍存在重复序列。 根据重复频率不同，分为以下4类： 高度重复序列；中度重复序列；单拷贝重复序列；反向重复序列（回文序列）1. 高度重复序列 重复数百万次，序列简单序列，不到10bp;称为卫星DNA；2. 中度重复序列 重复上千次，序列由几百个bp构成；3. 单拷贝序列 只出现1次或几次。真核生物极大多数为单一基因；4. 反向重复序列 是指在DNA链某些区域，出现反向排列的碱基序列。如： “CGTACC-/-CCATGC-”, 又称“回文结构”。 （五）断裂基因 （图）外显子：具有实际编码意义的结构基因序列；内含子：不具有编码意义的碱基序列 ，又称插入序列。（六）大多数为非编码区（95左右）二、真核基因表达调控的特点 （一）DNA、染色体水平的变化特点1对核酸酶极度敏感（图）2DNA拓朴结构变化 天然双链DNA几乎均以负性超螺旋构象存在。 当基因激活后，则转录区前方的DNA拓朴结构变为正性超螺旋，有利于RNA聚合酶向前移动，进行转录。3. DNA甲基化 DNA甲基化程度与基因表达呈反比。4染色体结构的变化 组蛋白发生修饰，碱基暴露等原因而引起核小体结构改变，使核小体不稳定性增加。二）RNA聚合酶、mRNA的转录激活及调节 真核生物有3种RNA聚合酶：RNA pol、。每种RNA聚合酶有约10个亚基组成，其中TATA盒结合蛋白（TBP）为3种酶共有。 RNA pol对催化mRNA的生成起主要作用。转录前RNA pol必须与TBP、TFD等各种通用转录因子形成转录前复合体（PIC），从而激活或抑制RNA的转录。 聚合酶转录前起始复合体的组装（图）（三）正性调节占主导 真核基因一般都处于阻遏状态，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。 通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。 采用正性调节机制更有效、经济、特异； 采用负性调节不经济（四）转录和翻译过程分开进行 转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位（胞核与胞浆），可分别进行调控。（五）转录后加工 真核基因大多为断裂基因，内含子和外显子一起被转录。 转录后产物（hnRNA）经剪接、加帽、加尾等加工修饰，才能转变为成熟的mRNA .第四节 外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势： 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理： 启动子；终止子； 核糖体结合位点；密码子；质粒拷贝数一、启动子（图表）1.Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP：（图） cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。 负调节因子 lac I （图）：在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。2.Trp 表达系统以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。 在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达Trp 表达系统（图）3.Tac 表达系统tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越lac、tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子转录调控的需要。 当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表达系统。大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。 但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。 需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。4.PL 和 PR 表达系统 以噬菌体早期转录启动子 PL 、 PR 为核心构建的表达系统。 在野生型噬菌体中， PL 、 PR 启动子转录与否决定了噬菌体进入裂解循环还是溶源循环转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。 因此 PL 、 PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts) 的基因产物来调控 PL 、 PR 启动子的转录。 在较低温度（30）时以活性形式存在 在较高温度（42）时失活脱落5.T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。 T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启动子的转录。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转录的序列。 在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型；温度诱导型；双质粒系统转录调控的机理（1）化学诱导型（图）噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生株，一段含有 lacI、lacUV5 启动子和 T7 RNA 聚合酶基因的DNA 片段被插入其 int 基因中用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。（2）温度诱导型（图） PL 启动子控制 T7 RNA 聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7 噬菌体启动子的转录。 这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。（3）双质粒系统（图） 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带有 T7 启动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制 T7 RNA 聚合酶的启动子调控类型T7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法：在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因。 因为 T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。 目前 T7 溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。 二、终止子1.强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率2.强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选三、核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 图：基因的转录与翻译大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 1.SD 序列的影响 一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于 SD （ UAAGGAGG）序列与16S rRNA 的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。 对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T，均会导致翻译效率大幅度降低2.SD 序列与起始密码子之间的序列的影响 SD 序列下游的碱基若为 AAAA 或 UUUU，翻译效率最高；而CCCC 或 GGGG 的翻译效率则分别是最高值的 50% 和 25%。 紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在这个位置上最佳的碱基组合是 UAU 或 CUU，如果用 UUC、UCA 或 AGG 取代之，则酶的表达水平低 20 倍3.SD 序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前 提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基， 均会导致翻译起始效率不同程度的降低。4.起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。 除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。四、密码子1.生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的 U 和 A 出现的频率较高；在 GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有 G 或 C 的简并密码子占 90% 以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能：中等强度规律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多细胞内 tRNA 的含量2.密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。 一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成：按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 同步表达相关 tRNA 编码基因：对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用五、质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，在28时，每个细胞的质粒拷贝数为60，在42时，拷贝数迅速增至300 600，在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达。第二部分 大肠杆菌基因工程菌的构建策略蛋白质的合成是在细胞之中进行的 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的20%40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒：包涵体存在于大肠杆菌细胞质中在细胞内表现为可溶性的蛋白质：可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。一、包涵体型异源蛋白的表达1.包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子2.以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定：能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。二、分泌型异源蛋白的表达分泌表达至少有四大优点：(1)便于简化发酵后处理的纯化工艺；(2)分泌表达设汁，有利于正确构象的形成；(3)分泌蛋白减少了重组蛋白受到蛋白水解酶降解的机会，提高蛋白的回收率；(4)目的蛋白末端完整：相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍构建分泌表达的策略一般来讲，N端的信号肽可以帮助蛋白质穿膜，促进分泌作用，因此可以在目的基因的前边加上编码信号肽序列的DNA，但信号肽不能保证高效分泌，而且对存在有外膜的大肠杆菌仍不能够分泌到培养基中。采用基因工程的方法使革兰氏阴性菌向培养基中分泌蛋白：有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。三、非融合型异源蛋白的表达1.所谓非融合蛋白是指所表达的外源蛋白的N端不含任何其他氨基酸，因此要求翻译起始位点ATG必须位于要表达的外源基因片段的5端。将该基因插入合适的启动子和SD序列的下游，构成原核表达系统的核糖体结合位点，就可以在原核细胞中表达非融合蛋白了。SD序列与翻译起始位点ATG之间的距离极大影响表达效率，合适的距离的选择方法：在ATG上游合适位点找一酶切位点，酶解，用外切酶对上游片段进行不同程度的消化，再重新连接环化，找到表达量最高的重组质粒，该质粒中ATG与SD序列间的距离为最适距离。2.起始密码ATG ，编码的是甲硫氨酸，所以： 在多数情况下，N 端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质没有特别的影响，但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物学活力的报道。 另外，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质。从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看，这是一个需要引起重视的问题。去除附加的甲硫氨酸有二种方法： 在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。 在分离纯化后在体外用外肽酶处理。 但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。3.非融合蛋白能够较好地保持原来的蛋白活性，但是在宿主细胞内易被蛋白酶降解，从而造成蛋白的产量很低。方法： 选用Ion-营养缺陷型宿主菌。黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物。 利用细菌蛋白酶抑制剂。T4噬菌体的pin基因产物是大肠杆菌蛋白酶的抑制剂，可以将pin克隆到质粒中，一起转化大肠杆菌。四、融合型异源蛋白的表达融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。它们的功能往往是异常的，或者是已经发生了变化。由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型 1.由报告基因的编码序列区和另一个基因的启动子及其调节序列构成的2.由一种异源蛋白质基因的编码序列区同寄主细胞的诱导型启动子构成以融合形式表达目的蛋白的优缺点：目的蛋白稳定性高，尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 外膜蛋白（OmpF） 促进分泌b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象目的蛋白的回收融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法酶促裂解法 五、影响基因在大肠杆菌中的表达效率因素1.5-UTR对克隆基因表达效率的影响 a. 启动子结构对表达效率的影响大肠杆菌启动子的保守序35区（5TTGACA）和10(5TATAAT)区;它们之间的距离(17bp)。 b. 启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 当mRNA分子5末端与SD序列之间的长度小于15bp时，转译效率下降。2. 质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 a. 质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b. 质粒载体的不稳定性对表达效率的影响3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 a. 转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作用较高，C或G时，下降50%或25%； 位于起始密码子AUG上游的密码三联体的碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、UCA或AGG时下降20倍； 位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成，也影响转译的速率。 b. mRNA的稳定性对表达效率的影响4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子； 一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的） 高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。 不同生物密码