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怀宁中学生物竞赛辅导教程高中生物竞赛辅导讲义第七章 微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人工条件下发挥作用，都是“以数取胜”或是“以量取胜”的。生长、繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。可以说，没有一定的数量就等于没有微生物的存在。一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、体积、密度或浓度作指标来衡量。所以：个体生长个体繁殖群体生长群体生长个体生长个体繁殖除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义，因此，在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。这一点与研究大生物时有所不同。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标；同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、霉腐微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关。所以有必要对微生物的生长繁殖及其控制的规律作较详细的介绍。第一节 测定生长繁殖的方法既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。一、测生长量测定生长量的方法很多，适用于一切微生物。（一）直接法1测体积 这是一种很粗放的方法，用于初步比较用。例如把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察其体积等。2称干重 可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的1020。在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤15次后，进行干燥。干燥温度可采用105、100或红外线烘干，也可在较低的温度（80或40）下进行真空干燥，然后称干重。以细菌为例，一个细胞一般重约10-1210-13g。另一种方法为过滤法。丝状真菌可用滤纸过滤，而细菌则可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，然后在40下真空干燥，称干重。以大肠杆菌为例，在液体培养物中，细胞的浓度可达2109个ml。100ml培养物可得1090mg干重的细胞。（二）间接法1比浊法 细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用McFarland比浊管。这是用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液只要在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者透光度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。如果要作精确测定，则可用分光光度计进行。在可见光的450650um波段内均可测定。为了对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪，可采用不必取样的侧臂三角烧瓶来进行。测定时，只要把瓶内的培养液倒入侧臂管中，然后将此管插入特制的光电比色计比色座孔中，即可随时测出生长情况，而不必取用菌液（图7-1）。图7-1 测定生长用的侧臂三角瓶（左）和比色管架（右，自制，适用于“721”型分光光度计）1侧臂试管三角烧瓶；2侧臂试管；3侧臂试管插座；4比色架面板；5连接螺丝；6比浊测定透光窗；7光路开关孔；8比色架底板2生理指标法 与生长量相平行的生理指标很多，它们都可用作生长测定中的相对值。（1）测含氮量 大多数细菌的含氮量为其干重的12.5，酵母菌为7.5，霉菌为6.0。根据其含氮量再乘以6.25，即可测得其粗蛋白的含量（因内中包括了杂环氮和氧化型氮）。测定含氮量的方法很多，如用硫酸、过氯酸、碘酸或磷酸等消化法和Dumas测氮气法。后一方法是：将样品与氧化铜混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出氮气量。（2）测含碳量 将少量（干重为0.22.0mg）生物材料混入1ml水或无机缓冲液中，用2ml2重铬酸钾溶液在100下加热30分钟，冷却后，加水稀释至5ml，然后在580nm波长下读取光密度值（用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线），即可推算出生长量。（3）其他 磷、DNA、RNA、ATP、DAP（二氨基庚二酸）和N-乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产CO2（用标记葡萄糖作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，都可用于生长量的测定。 二、计繁殖数与测定生长量不同，对繁殖来说，一定要计算微生物的个体数目，所以计繁殖数只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。（一）直接法直接法就是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，所得的结果是包括死细胞在内的总菌数。1比例计数法 这是一种很粗的计数方法。将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞等）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。2血球计数板法 是用来测定一定容积中的细胞总数目的常规方法。具体方法详见实验参考书。（二）间接法一种活菌计数法，是根据活细胞通过生长繁殖会使液体培养基混浊，或在平板培养基表面形成菌落的原理而设计的方法。1液体稀释法 对未知菌样作连续的10倍系列稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，接种到3组共15支装有培养液的试管中（每管接入1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN（mostprobablenumber，最大可能数量）表，再根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。2平板菌落计数法 是一种最常用的活菌计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混和，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。经保温培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50500个菌落为宜。这种方法在操作时，有较高的技术要求。其中最重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。有人认为，对原菌液浓度为109个ml的微生物来说，如果第一次稀释即采用10-4级（用10l毛细吸管直接吸10l菌液至100ml无菌水中），第二次采用10-2级（吸1ml上述稀释液至100ml无菌水中），然后再吸此菌液0.2ml进行表面涂布和菌落计数，则所得的结果最为精确。其主要原因是，一般的吸管壁常因存在油脂而影响计数的精确度（有时误差竟高达15）。这一稀释过程的示意图见图7-2。平板菌落计数法虽最为常用，但方法较烦，操作者需要有熟练的技术。为此，近年来已有多种小型的商品化产品供快速计数用，其形式有小型厚滤纸片（1cm2）或琼脂片（25cm）等。共同原理是在滤纸或琼脂中吸有合适的培养基，其中还加有活菌指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazoliumchloride，TTC，无色）。待蘸取测试菌液后，置密封包装袋或瓶内，经短期培养，在滤纸或琼脂片上就会出现一定密度的玫瑰红色微小菌落。将它与标准纸版上的图谱比较，就可以不必数其具体菌落即可估算出该样品的含菌量。这类商品灵敏快速，不经过专门微生物学操作训练的任何工作人员都可应用，尤其适合于野外的调查等工作。TTC可在呼吸链中接受来自FADH2的氢，并使自己还原成红色的2，3，5-三苯基甲（TF，triphenylfor-mazan，遇氧不退色），即：另外，平板菌落计数法对产甲烷菌等严格厌氧菌的计数也不适用，为此，要应用严格厌氧技术，例如Hun-gate滚管技术进行稀释、培养和菌落计数（详见第三节）。除平板菌落计数法可以对活菌进行计数外，借助于特殊染料，还可较方便地在显微镜下进行活菌计数，例如，作酵母活细胞计数可用美蓝染色液（美蓝0.025g，NaCl0.9g，KCl0.042g，CaCl26H2O 0.048g，NaHCO30.02g，葡萄糖1g，蒸馏水加至100ml）染色后在显微镜下进行观察，结果活细胞为无色，死细胞为蓝色。又如，较新的方法是用特殊滤膜过滤含菌样品，经吖啶橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，凡活细胞发橙色荧光，死细胞则发绿色荧光。以上介绍了若干测定微生物的生长量或计算繁殖数的主要方法。其中，最常用的为称干重、测浊度（用分光光度计）、测含氮量、用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。必须指出的是，不管采用什么方法，都有其优缺点和使用范围。所以，在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。第二节 微生物的生长规律一、细菌的个体生长和同步生长细菌的细胞是极其微小的，但是，与一切其他细胞或个体一样，也有一个自小到大的生长过程。在整个生长过程中，细胞内发生阶段性的十分复杂的生物化学变化和细胞学变化。可是，要研究单个细菌的这类变化，技术上是十分困难的。目前能使用的方法，一是用电子显微镜观察细菌细胞的超薄切片，二是使用同步培养（synchronousculture）技术，即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，就称同步生长（synchronousgrowth）。获得细菌同步生长的方法主要有两类，其一是通过环境条件来诱导同步性，例如用变换温度、光线或对处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等；其二是通过物理学方法从随机的、不同步细菌群体中选择出同步的群体，它一般可用选择性过滤或梯度离心法来达到。在这两类方法中，由于诱导法可能造成与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，这在生理学研究中尤为明显。在选择法中，有代表性的是Helmstetter-Cummings技术。他们根据某些细菌会紧紧地粘附在硝酸纤维微孔滤膜上的原理，设计了一个具体的选择方法：将非同步的细菌液体培养物通过微孔滤膜，让细胞吸附于其上；然后将滤膜反置，再以新鲜培养液滤过。这时，一些未粘牢的细胞先被冲洗掉，接着脱落到培养液中的都是那些新分裂形成的细胞，于是就获得了同步生长（图7-3）同步生长的细菌，在培养过程中会很快丧失其同步性。例如，在第一个细胞分裂周期中，起先细胞数一直未增加，到后来，数目突然增加一倍。到第二个分裂周期时，情况就没有那么明显了。到第三个分裂周期时，已几乎完全丧失同步性。其中的道理非常简单，因为在不同个体间，细胞分裂周期一般都有较大的差别。二、典型生长曲线当我们把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气（厌氧菌则不能通气）等条件下，它们的群体就会有规律地生长起来。如果以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线（growthcurve）。根据微生物的生长速率常数（growthrateconstant），即每小时的分裂代数（R）的不同，一般可把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期（图7-4）。（一）延滞期（lagphase）又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。该时期有几个特点：生长速率常数等于零。细胞形态变大或增长：许多杆菌可长成长丝状，例如，Bacillusmegaterium（巨大芽孢杆菌）在接种的当时，细胞长为3.4m；培养至3.5小时，其长为9.1m；至5.5小时时，竟可达到19.8m。细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。影响延滞期长短的因素很多，除菌种外，主要有三。（1）接种龄 接种龄即“种子”（inoculum）的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。这是一种生理年龄。实验证明，如果以对数期接种龄的“种子”接种，则子代培养物的延滞期就短；反之，如以延滞期或衰亡期的“种子”接种，则子代培养物的延滞期就长；如果以稳定期的“种子”接种，则延滞期居中。（2）接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。一般说来，接种量大，则延滞期短，反之则长（图7-5）。因此，在发酵工业上，为缩短不利于提高发酵效率的延滞期，一般采用110的接种量。（3）培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。所以，在发酵生产中，常使发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近。延滞期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物，就需要有一段适应期，于是出现了生长的延滞期。（二）指数期（exponentialphase）又称对数期（logarithmicphase），是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。指数期有以下几个特点：生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的代时G（增代时间，generationtime）或原生质增加一倍所需的倍增时间（doublingtime）最短；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；酶系活跃，代谢旺盛。在指数生长期中，有三个参数最为重要，这就是：（1）繁殖代数（n）从图7-6可以得出：x2=x12n以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2（2）生长速率常数（R）按前述生长速率常数的定义可知：（3）代时（G）按前述平均代时的定义可知：影响指数期微生物增代时间的因素很多，主要有：菌种：不同菌种的代时差别极大，这可以从表7-1中看到。营养成分：从表7-1中可以看出，同一种细菌，在营养物丰富的培养基中生长，其代时较短，反之则长。营养物浓度：营养物的浓度可影响微生物的生长速率和总生长量（图7-7）。 如图7-7所示，在营养物浓度很低的情况下，营养物的浓度才会影响生长速率，随着营养物浓度的逐步增高，生长速率不受影响，而只影响最终的菌体产量。如果进一步提高营养物的浓度，则生长速率和菌体产量两者均不受影响。凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，就称生长限制因子。培养温度：温度对微生物的生长速率有极其明显的影响（表7-2）。指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故可作为代谢、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主菌龄，也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。（三）稳定期（stationaryphase）又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数R等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。这时的菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系，这一关系就是生长产量常数Y（或称生长得率，growthyield）。上式中，x为稳定期时的细胞干重（gml培养液），x0为刚接种时的细胞干重，C0为限制性营养物的最初浓度（gml），C为稳定期时限制性营养物的浓度（由于计算Y时必须用限制性营养物，所以C应等于0）。例如，据实验和计算，Penicilliumchrysogenum（产黄青霉）在组合培养基上生长时，其Y值为12.56，即每2.56g葡萄糖可合成1g菌丝体（干重）。在稳定期时，细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。稳定期到来的原因主要是：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，例如CN比值不合适等；酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜，等等。稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物，例如单细胞蛋白、乳酸等为目的的一些发酵生产的最佳收获期，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。（四）衰亡期（declinephase或deathphase）在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，因此，整个群体就呈现出负生长（R为负值）。这时，细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶（autolysis）；有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物；在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期。产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。 三、微生物的连续培养连续培养（continuousculture）又称开放培养（openculture），是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养（batchculture）或密闭培养（closedculture）而言的。连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，通过认识稳定期到来的原因，并采取相应的有效措施而实现的。具体地说，当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌均匀，另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上（图7-8和7-9）。连续培养器的类型很多，可从以下表解中看出。 以下仅对控制方式和使用目的不同的两种连续培养器的原理作一简单介绍。（1）恒浊器（turbidostat） 这是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。在这一系统中，当培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。（2）恒化器（chemostat或bactogen） 与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的，因而可称为外控制式的连续培养装置。可以设想，在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。恒化器（图7-9）主要用于实验室科学研究中，尤其用于与生长速率相关的各种理论研究中。它与恒浊器明显不同，其比较见表7-3。按照培养器的级数，可把连续培养器分成单级连续培养器与多级连续培养器两种。上面已经提出，如果某微生物代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平行，就可以采用单级恒浊器来进行研究或生产。相反，如果要生产的恰恰是与菌体生长不平行的那些发酵产物，例如丙酮、丁醇等时，就应根据两者的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置（各级间相互串联）。从图7-10中即可看到在发酵微生物中，生长与代谢产物的形成存在两种类型。现以丙酮丁醇的发酵生产为例来说明采用两级连续培养的必要性和优点。丙酮丁醇生产菌Clostridumacetobutylicum（丙酮丁醇梭菌）的生长可分两个阶段，前期较短，以产菌体为主，生长温度以37为宜；后期较长，以产溶剂为主，温度以33为宜。根据这一特点，有人设计了一个两级连续发酵装置。第一级保持37，pH4.3，培养液的稀释率为0.125/小时（即流速控制成8小时更换一次容器内的培养液），第二级为33，pH4.3，稀释率为0.04小时（即25小时更换培养液一次）。利用这样的装置可在一年多的时间内连续运转，并达到较单级连续培养好得多的生产效益。在我国，早在60年代，就已采用高效率的多级连续发酵法大规模地生产丙酮、丁醇等溶剂。连续培养如用于生产实践上，就称为连续发酵（continuousfermentation）。连续发酵与单批发酵相比有许多优点：高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量较稳定；图7-10生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。与一切事物一样，连续培养或连续发酵也有其缺点。最主要的是菌种易于退化。可以设想，处于如此长期高速繁殖下的微生物，即使其自发突变几率极低，也无法避免变异的发生，尤其发生比原生产菌株生长速率高、营养要求低和代谢产物少的负变类型。其次是易遭杂菌污染。可以想象，在长期运转中，要保持各种设备无渗漏，尤其是通气系统不出任何故障，是极其困难的。因此，所谓“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一、二年。此外，在连续培养中，营养物的利用率一般亦低于单批培养。在生产实践上，连续培养技术已广泛应用于酵母菌体的生产，乙醇、乳酸和丙酮、丁醇等发酵，以及用假丝酵母（Candidaspp）进行石油脱蜡或是污水处理中。国外还把微生物连续培养的原理扩大运用于提高浮游生物的产量，并收到了良好的效果（在25下，日产量可比原有方法提高一倍）。第三节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多，除第五章已讲过的营养条件外，还有许多物理条件。在这里，我们仅讨论其中最主要的温度、pH和氧气三项。一、温度由于微生物的生命活动是由一系列生物化学反应组成的，而这些反应受温度的影响极为明显，因此，温度是影响微生物生长的最重要的因素之一。这里要讨论的是在微生物生长范围内的各种温度。与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有宽有窄，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这三个重要指标，这就是生长温度的三基点。如果将微生物作为一个整体来看，它的温度三基点是极其宽的，这可从以下表解中看出。 对某一具体微生物来说，有的生长温度很宽，有的则很窄，这与它们长期生存的生态环境是否有较稳定的温度有很大关系。例如，一些生活在土壤中的芽孢杆菌，它们是宽温微生物（1540）；Ecoli既可在人体大肠中生活，也可在体外环境中生活，故也是宽温微生物（1047.5）；而专性寄生在人体泌尿生殖道中的Neisseriagonorrhoeae（淋病奈瑟氏球菌）则是窄温微生物（3640）。最适生长温度有时也简称为“最适温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。但是，对同一微生物来说，其不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度。从表7-4中，还可看到同一微生物的不同生理过程有着不同的最适温度。对不同生理、代谢过程各有其相应最适温度的研究，有着重要的实践意义。例如，国外曾报道在Penicilliumchrysogenum（产黄青霉）165小时的青霉素发酵过程中，运用了有关规律，即根据不同生理代谢过程的温度特点分四段控制其培养温度，即：0小时5小时40小时125小时165小时。结果，其青霉素产量比自始至终进行30恒温培养的对照提高了14.7。二、氧气地球上的整个生物圈都被大气层包围着。以体积计，氧约占空气的15，氮约占45（表7-5）。因此，氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响。 按照微生物与氧的关系，可把它们分成好氧菌（aerobe）和厌氧菌（anaerobe）两个大类，并继续细分为五类。现将它们表解如下： 以下就把这五种与氧有关的微生物类型作一比较。（1）专性好氧菌（strictaerobe） 必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶（SOD，superoxidedismutase）和过氧化氢酶。绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌，例如Pseudomonasaeruginosa（铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌）和Coeynebacteriumdiphtheriae（白喉棒杆菌）等。（2）兼性厌氧菌（facultativeaerobe） 在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好（图7-11）；在有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌。例如Saccharomycescerevisiae（酿酒酵母）、肠杆菌科的各种细菌包括Ecoli、Enterobacteraerogenes（产气肠杆菌，旧称产气气杆菌或产气杆菌）和Proteusvulgaris（普通变形杆菌）等都是常见的兼性厌氧微生物。（3）微好氧菌（microaerophilicbacteria） 只能在较低的氧分压（0.010.03巴，而正常大气中的氧分压为0.2巴）下才能正常生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。例如Vibriocholerae（霍乱弧菌）、一些Hydrogenomonas（氢单胞菌属）、Zymomonas（发酵单胞菌属）以及少数Bacteroides（拟杆菌属）的种等。（4）耐氧菌（aerotolerantanaerobe） 一类可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，分子氧对它也无毒害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。一般的乳酸菌多数是耐氧菌，例如Streptococcuslactis（乳链球菌）、Sfaecalis（粪链球菌）、Lactobacilluslactis（乳酸乳杆菌）以及Leuconostocmesenteroides（肠膜明串珠菌）等；乳酸菌以外的耐氧菌如Bu-tyribacteriumrettgeri（雷氏丁酸杆菌）等。（5）厌氧菌（anaerobe） 厌氧菌有以下几个特点：分子氧对它们有毒，即使短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含10CO2的空气中，它们在固体或半固体培养基的表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原势的环境下才能生长；其生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。常见的厌氧菌有Clostridium（梭菌属）、Bacteroides（拟杆菌属）、Fu-sobacterium（梭杆菌属）、Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Eubacterium（优杆菌属）、Peptococcus（消化球菌属）、Bu-tyrivibrio（丁酸弧菌属）、Desulfovibrio（脱硫弧菌属）、Veil-lonella（韦荣氏球菌属）以及各种光合细菌和产甲烷菌等。其中产甲烷菌的绝大多数种都是极端厌氧菌（参见第九章第五节）。现把以上五种微生物在深层固体培养基中的生长情况模式地图示于下（图7-12）。在微生物世界中，绝大多数种类都是好氧菌或兼性厌氧菌。厌氧菌的种类相对较少，但近年来已找到越来越多的厌氧菌。关于厌氧菌的氧毒害机制从本世纪初起已陆续有人提出，但直到1971年在McCord和Fridovich提出SOD的学说后，才有了进一步的认识。他们认为，图7-12五类对氧关系不同的微生物在半固厌氧菌因缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超体琼脂柱中的生长状态（模式图）氧物阴离子自由基（O2-）而毒害致死。各种微生物细胞内的SOD和过氧化氢酶的含量见表7-6。超氧阴离子自由基是活性氧的形式之一，因有奇数电子，故带负电荷；它既有分子性质，又有离子性质；其反应力极强，性质极不稳定，在细胞内可破坏各种重要生物高分子和膜，也可形成其他活性氧化物，故对生物体十分有害。在体内，超氧阴离子自由基可由酶促（如黄嘌呤氧化酶）或非酶促方式形成，即：O2+eO2-(O2-)生物在其长期进化过程中，早就发展出去除超氧阴离子自由基等各种有害的活性氧的机制。为一切好氧生物共有的SOD就是最重要的方式之一。好氧生物因为有SOD，因此剧毒的O2-就被歧化成毒性稍低的H2O2，在过氧化氢酶的作用下，H2O2再变成无毒的H2O。厌氧菌因为不能合成SOD，所以根本无法使O2-歧化成H2O2，因此，在有氧存在时，它们体内形成的O2-就使自身受到毒害。绝大多数的耐氧菌都能合成SOD（见表7-6），且有过氧化物酶，因此，剧毒的O2-可先歧化成有毒的H2O2，然后还原成无毒的H2O。即：已有实验证明，原来是兼性厌氧的Ecoli，如果让它发生缺乏SOD的突变，它就变成一种短期接触氧就被杀死的“严格厌氧菌”了。近年来，发现SOD在清除生物体内的超氧阴离子自由基的同时，还具有防治人体衰老、抗癌、防白内障、治疗放射病和肺气肿以及解除苯中毒等一系列疗效，所以正在通过直接从动物血液或微生物中提取，或是用遗传工程等手段将SOD基因导入受体菌等方法来开发这种新型的医疗用酶。此外，还在用化学修饰的方法努力延长SOD在体内的半衰期（未修饰的SOD在体内的半衰期仅6分钟），以尽快达到实用的目的。三、pHpH这一符号表示某溶液中氢离子浓度的负对数值。纯水的氢离子浓度是10-7molL，因此其pH值为7。凡pH值小于7者都呈酸性，大于7者呈碱性。每差一级，其离子浓度就相差10倍。微生物作为一个总体来说，其生长的pH范围极广（pH28），有少数种类还可超出这一范围，事实上，绝大多数种类都生长在pH59之间。与温度的三基点相类似，对不同生物的生长pH来说，也存在最高、最适与最低三个数值（表7-7）。凡其最适生长pH值偏于碱性范围内的微生物，有的是嗜碱性的，称嗜碱微生物（basophile），例如硝化细菌、尿素分解菌、根瘤菌和放线菌等；有的是不一定要在碱性条件下生活，但能耐较碱的条件，称耐碱微生物（basotolerantmicroorganism），如若干链霉菌等。生长pH值偏于酸性范围内的微生物也有两类，一类是嗜酸微生物（acidophile），例如Thiobacillus（硫杆菌属）等；另一类是耐酸微生物（acidotolerantmicroorganism），如乳酸杆菌、醋酸杆菌、许多肠杆菌和假单胞菌等。一般地说，多数真菌是嗜酸的（pH5），而多数放线菌则是嗜碱的（pH8）。除了不同种类的微生物有其最适的生长pH外，同一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程中，也有不同的最适pH要求，这对发酵生产中的pH控制尤为重要。例如，Aspergillusniger（黑曲霉）在pH22.5范围有利于产柠檬酸，在pH2.56.5范围内以菌体生长为主，而在pH7左右时，则以合成草酸为主。又如，Clostridiumacetobutylicum（丙酮丁醇梭菌）在pH5.57.0范围内，以菌体生长繁殖为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。抗生素生产菌也有同样的情况（表7-8）。虽然微生物的外环境中的pH变化很大，但其内环境中的pH却相当稳定，一般都接近中性。这样，就免除了DNA、ATP和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏。一般胞内酶的最适pH都接近中性，而周质空间中的酶和胞外酶的最适pH则较接近环境的pH。pH除了对细胞发生直接影响之外，还对细胞产生不同的间接影响，例如，影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响环境中有害物质对微生物的毒性，以及影响代谢反应中各种酶的活性等。微生物在其生命活动过程中，会改变外界环境的pH，这就是通常遇到的培养基的原始pH在培养微生物过程中会时时发生改变的原因。其中可能发生的反应有以下几种：在一般培养过程中，上述变酸与变碱两种过程往往以前者占优势，因此，随着培养时间的延长，一般培养基会变得较酸。当然，上述过程与培养基的碳氮比有极大的关系，碳氮比高的培养基，例如培养各种真菌的培养基，经培养后其pH值常会明显下降；相反，碳氮比低的培养基，例如培养一般细菌的培养基，经培养后，其pH值则常会明显上升。既然在微生物培养过程中培养基的pH会发生变化，而对发酵生产来说，这种变化往往对生产并不有利，因此，在微生物培养过程中，如何及时调节合适的pH就成了发酵生产中的一项重要措施。总结生产中的经验，可把这类调节措施区分成“治标”和“治本”两大类。前者是指根据表面现象而进行直接、快速但不能持久的调节；后者则是指根据内在机制所采用的间接、缓效但能发挥较持久作用的调节。现将微生物培养过程中调节pH的方法简要地归纳如下： 第四节 微生物培养法在本章开始时，我们就提到微生物是“以数取胜”或“以量取胜”的。在了解了它们生长规律的基础上，就应进一步知道，在实验室或在生产实践上，究竟可采取何种科学方法来保证所需微生物的大量繁殖，并进而产生大量有益代谢产物。为此，这里将从历史和现状的角度把较有代表性的微生物培养方法及装置作一简要介绍，以期能获得一个较系统和较全面的认识。一个良好的培养装置，应在提供丰富而均匀的营养物质的基础上，能保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必需的良好通气条件（只有少数厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。从历史发展的角度来分析，微生物培养技术的发展主要有这样几个特点：从少量培养发展到大规模培养；从浅层培养发展到厚层（固体）或深层（液体）培养；从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动、植物细胞；从单菌发酵发展到混菌发酵；从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”，等等。概括地说，微生物的培养方法可分为八个大类，即：现分别简要介绍如下。 一、实验室培养法（一）固体培养1好氧菌的培养主要有试管斜面、培养皿平板及较大型的克氏扁平、茄子瓶等的平板培养方法。2厌氧菌的培养培养厌氧菌除了需要特殊的培养装置以外，首先还要配制特殊的培养基。在这种培养基里，除了要满足六种营养要素外，还要加入还原剂和氧化还原势的指示剂（见第五章）。在用固体培养基培养厌氧菌的方法中，主要有：（1）高层琼脂柱 用加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌。在这种培养基中，越是深层，其氧化还原势越低，因而越有利于厌氧菌的生长。（2）Hungate滚管技术 1950年，美国著名微生物学家REHungate因分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌的需要，设计了一种具有划时代意义的严格厌氧技术Hungate滚管技术（Hungateroll-tubetech-nique）。其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还原无氧灭菌培养基（PRAS培养基，pre-reducedanaerobicallysterilizedmedium）。在进行产甲烷菌等严格厌氧菌的分离时，可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释，并接种到融化后的PRAS琼脂培养基中，然后将此试管（图7-13）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面上，犹如好氧菌在培养皿平板表面一样，最后长出许多单菌落。滚管技术的优点是：试管口与空气接触面积小；经滚动后，试管的内表面上有大面积的固体培养基可供长出单菌落。（3）厌氧培养皿用于厌氧培养的培养皿有几种设计。有的是利用皿盖去创造一个狭窄空间，加上还原性培养基的使用而达到无氧培养的目的（例如Brewer，皿，见图7-14）；有的则利用皿底有两个相互隔开的空间，其中之一放焦性没食子酸，另一则放NaOH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之。经摇动，使焦性没食子酸与NaOH溶液接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境（例如SPray皿或Bray皿，见图7-14）。（4）厌氧罐（anaerobicjar）技术 这是一种常规的不很严格的厌氧技术，可用于培养多数厌氧菌。在罐内一般可放10个常用的培养皿（直径9cm）或任何液体培养的试管。厌氧罐的类型很多，但一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体，上有一可用螺旋夹紧密夹牢的罐盖，盖内的中央有一不锈钢丝织成的网袋，内放钯催化剂；罐内还放一含美蓝的氧化还原指示剂（图7-15）。使用时，先装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气（N2CO2H2=801010，V/V）。这样，罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气中的H2还原成水，从而造成很高的无氧状态。这时指示剂美蓝被还原成无色。目前，国际上盛行方便的“GasPak”产气袋商品，把袋口剪开一角并加适量水后，即会自动放出足够的CO2和H2。这就是内源式的氢气和二氧化碳源。其原理是：产H2反应：一般用0.6硼氢化钠与40ml的水起作用即可产生1250ml氢气。产CO2反应：（5）厌氧手套箱（anaerobicglovebox） 这是50年代末问世的用于研究严格厌氧菌的重要装置。箱内既可通过塑料手套进行种种操作，又可进行恒温培养。箱体结构严密，箱内一般充以85N2、5CO2和10H2，同时以钯催化剂催化除O2，使箱内始终维持严格无氧状态。物件可通过有密闭装置的交换室进出箱体。上述的厌氧手套箱技术、Hungate滚管技术和厌氧罐技术已成为现代研究厌氧菌最有效的三项基本技术。（二）液体培养1好氧菌的培养 由于大多数微生物都是好氧菌，且微生物只能利用溶于水中的氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度就显得特别重要。在常压下（20）达到平衡时，氧在水中的溶解度仅为6.2mlL（0.28mmol）。这些氧只能保证氧化8.3mg（即0.046mmol）葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的1。除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养料一般都可保证微生物使用几小时至几天，因此，对好氧菌来说，生长的限制因子几乎总是氧的供应。只有将培养液装成浅层时，氧才不至于成为限制因子。在进行液体培养时，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有：浅层液体培养；利用往复式或旋转式摇床（shaker）对三角瓶培养物作振荡培养；在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出；对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置。在实验室进行好氧菌培养的具体方法有以下几类：（1）试管液体培养装液量可多可少。此法的通气效果一般均不够理想，仅适合培养兼性厌氧菌。（2）三角瓶浅层培养在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量（表7-9）和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。（3）摇瓶培养 即将三角瓶内培养液用8层纱布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同时降低瓶内的装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。此法是荷兰的AJKluyver等于1933年最早试用，目前仍广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化和发酵等试验中。（4）台式发酵罐 体积一般为几升至几十升，并有多种自动控制和记录装置。现成的商品种类很多，用作发酵研究十分方便。2厌氧菌的培养 在实验室中，用液体培养基培养厌氧菌时，一般采用加有有机还原剂（如巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉等）或无机还原剂（铁丝等）的深层液体培养基，并在其上封以凡士林-石蜡层，以保证它们的氧化还原电位（Eh）达到-150mV-420mV的范围。如果能将其放入前述的厌氧罐或厌氧手套箱中培养，则效果将会更好。二、生产实践中的微生物培养装置（一）固体培养1好氧菌的曲法培养在生产实践上，好氧菌的固体培养方法都是将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中产生的热量及时释放，这就是曲法培养的基本原理。这里，我们要对曲（qu或mouldybran）的概念用表解形式作一介绍。根据制曲的容器形状和规模的大小，可把各种制曲方法分成瓶曲、袋曲（用塑料袋制曲）、盘曲（用木盘制曲）、帘子曲（用竹帘子制曲）、转鼓曲（用木质空心转鼓，不断转动制曲）和通风曲等。其中的通风曲是机械化程度和生产效率较高的现代化制曲设备。它一般是由一个面积在10m2左右的曲槽组成，曲槽上有曲架和用适当材料编织成的筛板，其上可摊一层较厚（30cm左右）的曲料，曲架下部不断通以低温、潮湿的新鲜过滤空气，以此来进行半无菌的固体培养（图7-16）。我国的酱油厂一般都用此法制曲。2厌氧的堆积培养法 生产实践上对厌氧菌进行固体培养的例子还不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖进行堆积式的固体发酵，虽然其中的酵母菌是兼性厌氧菌，但也可以算作是厌氧固体发酵的例子。（二）液体培养1好氧菌的培养（1）浅盘培养