黄脊竹蝗5个地理种群线粒体16SrRNA基因片段的序列分析.pdf

第 31 卷第 7 期中 南 林 业 科 技 大 学 学 报Vol 31No 7 2011 年 7 月Journal of Central South University of Forestry 2 湖南第一师范学院 湖南 长沙 410004 3 新宁县第四中学 湖南 新宁 422709 摘 要 摘 要 对湖南桃江 广东广宁 广西桂林 重庆永昌 四川长宁等 5 个黄脊竹蝗 Rammeacris kiangsu Tsai地 理种群线粒体 16S rRNA 基因进行测序 并经 Clustal X 同源排序后得 506 bp 序列 对获得的序列分析表明 A T G C 平均含量分别为 32 0 37 7 17 6 12 6 其中保守位点数 504 个 变异位点数 2 个 自裔位点 2 个 所 有碱基转换总数为 1 颠换总数为 1 利用 MEGA4 0 软件重建系统发生树 发现其中这 5个黄脊竹蝗种群分化程度 很低 从而可以说明其群体遗传多样性单一 关键词 黄脊竹蝗 地理种群 16S rRNA 遗传分化 遗传多样性 中图分类号 X 503 223文献标志码 A文章编号 1673 923X 2011 07 0115 05 Fragment sequences analysis of mtDNA 16S rRNA gene among 5 geographic populations of Rammeacris kiangsu JIANG Sh i sheng1 HE Y i yuan1 ZHU Dao hong2 CAO Yuan qing3 1 Central South University of Forestry 2 Hunan First Normal University Changsha 410004 Hunan China 3 Xinning No 4 M iddle School Xinning 422709 Hunan China Abstract Approximately 506 base pairs of mitochondrial 16S rRNA gene from 5 populations of Rammeacris kiangsu Tsai Orthoptera Aeridoidea in T ao jiang Guang ning Gu i lin Chang ning Yong chang were sequenced Of these sequences average contents of A T G and C were 32 0 37 8 17 6 and 12 7 respectively In 506 bp se quences there were 504 conserved sites 2 variable sites and 2 singleton sites A total of transition and transversion a mong mtDNA 16S rRNA gene were 1 and 1 respectively The molecular phylogenetic trees were reconstructed by MEGA4 0 software methods it was found that there was a consistent evolutionary relationship among the 5 popula tions The results show the genetic diversity in 5 populations of Rammeacris kiangsu was exceptionally low Key words Rammeacris kiangsu geographical population 16S rRNA genetic differentiation genetic diversity 黄脊竹蝗 Rammeacris kiangsu 又名黄脊雷蓖 蝗 属昆虫纲 Inseeta 直翅目 Orthoptera 蝗总科 Aeridoidea 网翅蝗科 Arcypteridae 竹蝗亚科 Cer acrinae 雷蓖蝗属 Rammeacris 广泛分布于湖南 湖 北 四川 重庆 广东 广西 江西 福建 江苏 浙江 安徽 云南 贵州 台湾等地 1 主要为害毛竹 淡 中南林业科技大学学报第 31卷 竹 刚竹 小竹等多种竹种 也为害水稻 玉米 棕榈 等多种其它植物 黄脊竹蝗的成虫在接近交配时期 可作长距离的群飞迁移 造成发生地区迅速扩大 危 害的植物范围也随之扩大 目前 国内学者对黄脊竹蝗的生物学特性 形态 特征及防治研究比较多 但对其遗传特性的研究 在 国内还未见报道 随着分子生物学技术的迅速发 展 DNA 分子的多态性研究开始受到人们的普遍重 视 而 mtDNA mitochondrial DNA 由于具有分子 量小 结构简单 进化速度快 母性遗传等特点 成为 生物多样性 群体遗传学和系统进化研究中的重要 参考对象 2 3 本研究对黄脊竹蝗 5 个地理种群线 粒体 16S rRNA 基因的部分序列进行测定 并以其 作为分子标记来分析黄脊竹蝗的遗传分化 1 材料与方法 1 1 实验材料 本实验所用的黄脊竹蝗标本采之于 5 个不同地 区 其具体时间和地点见表 1 所有标本用无水乙 醇浸泡 20 保存 1 2 总 DNA的提取 表 1 黄脊竹蝗标本采集地及时间 Table 1 Populations of Rammeacris kiangsu sampled in this study 采集地纬度 N 经度 E 代码采集时间 重庆永昌29 4105 9CQYC 2006 03 四川长宁28 6104 9SCCN 2006 03 湖南桃江28 5112 1HNTJ 2006 04 广西桂林25 3110 3GXGL 2006 03 广东广宁23 7112 4GDGN2006 03 本实验是参照贺一原等 4 的苯酚 氯仿法从黄 脊竹蝗标本后足股节肌肉中提取总 DNA 提取之 前用双蒸水浸泡 48 h 以上 1 3 PCR扩增及测序 PCR 扩增引物设计参照 Simon 等 5 文献 LR J 12887 5 CCGGTCT GAACT CAGAT CACGT 3 LR N 13398 5 CGCCTGT TT AACAAAAA CAT 3 引物是由上海生工 Sangon 公司合成 PCR 反应总体积为50 L 其中含有 5 L 10 buffer 含 Mg2 1 L dNTP 2 L 引 物 10 mol L 2 L 模板 DNA 1 L Taq 酶 5 U L 其余用 ddH2O 补充至 50 L PCR 扩增条件包括 94 预变性 5 min 30 个循环 94 变性 30 s 49 退火 40 s 72 延 伸 30 s 72 再延 伸 7 min 最后 4 保存 PCR 产物用 1 5 的琼脂糖 凝胶电泳进行检测 将条带清晰的 PCR 原液交由 华大基因公司完成纯化及测序 为保证测序的准确 性 所有序列均进行双向测序 测序反应均在型号 为 3730XL 测序仪上进行 1 4 DNA 序列数据处理 所测序列经校对 用 ClustalX1 81 软件进行对 比 利用 MEGA4 0 软件计算黄脊竹蝗各群体 16S rRNA 基因序列的保守位点 变异位点 简约信息位 点 自裔位点 并统计分析群体间的碱基组成 遗传 距离和转换 颠换值 用 Kimura 2 Parameter 双参 数模型分析 用邻近法 neighbor joining method NJ 法 构建系统树 系统发生树中结点的自举检验 置信度以 1 000 次重复计算估计 2 结果与分析 2 1 基因组总 DNA 的提取 本实验所用的标本都是存放于 20 无水乙 醇中浸泡 并从标本后足股节肌肉中提取 DNA 提 取的总 DNA 用 1 0 的琼脂糖凝胶电泳检测 通 过凝胶成像系统观察得到清晰的总 DNA 条带 2 2 16S rRNA基因的 PCR 扩增结果 用引物对提取的总 DNA 进行 PCR 扩增 用 1 5 的琼脂糖凝胶电泳检测 电泳结果均可看到单 一条带的特异性产物 如图 1 大小为 560 左右 图 1 16S rRNA 基因部分序列电泳 Fig 1 Electrophoresis of 16S rRNA gene 116 第 7 期 姜石生 等 黄脊竹蝗 5 个地理种群线粒体 16S rRNA 基因片段的序列分析 对双向测序的序列进行拼接后并去掉两端引物序 列 都得到大小为 506 bp 序列 所测黄脊竹蝗的 16S rRNA 基因序列与 Genbank 数据库中的黄脊 竹蝗 AY995330 的同源性超过了 99 2 3 不同黄脊竹蝗地理种群 16S rRNA 基因序列 比较 5 个不同黄脊竹蝗地理种群 16SrRNA 基因序 列比较如图 2 所示 从图 2 中可以看出 湖南桃江 图 2 5 个地理种群的 16S rRNA 基因的序列比较 Fig 2 Sequences comparison on 16S rRNA gene of 5 geographic populations 117 中南林业科技大学学报第 31卷 HNT J 黄脊竹蝗 16S rRNA 基因片段在 319 bp 处有一个碱基 A 转换成 G 四川长宁 SCCN 黄脊 竹蝗 16S rRNA 基因片段在 471 bp 处有一个碱基 G 颠换 成 C 而 广东广 宁 GDGN 广 西桂 林 GXGL 重庆永昌 CQYC 黄脊竹蝗 16S rRNA 基因片段序列完全相同 所以从图可以看出 这 5 个地理种群 16S rRNA 基因片段序列差异非常小 2 4 黄脊竹蝗的 16S rRNA 基因遗传分析及系统 发育分析 2 4 1 遗传分析 5个地理种群的黄脊竹蝗 16SrRNA 基因部分 序列片段中 A T G C 平均含量分别为 32 0 37 7 17 6 12 7 A T 含量较高 为69 7 G C 含量较低 为 30 3 所有序列的碱基转换 数为 1 颠换数为 1 转换 颠换平均值为 1 转换数 等于颠换数 遗传距离在不同黄脊竹蝗间最大为 0 004 最小为 0 000 其中有 3 个地理种群体黄脊 竹蝗的16S rRNA 基因序列没有差异 所有序列的 平均距离为 0 0016 经 MEGA4 0 软件对各序列 进行分析 黄脊竹蝗 5 地理种群 16S rRNA 基因序 列遗传距离如表 2 所示 所测序列经 Clustal X1 81 软件分析比对 506 bp 其中保守位点数 C Con served sites 504 个 变异位点数 V Variable sites 2 个 简约信息位点 Pi Parsimony Information sites 0 个 自裔位点 S Singleton sites 2 个 表 2 5 黄脊竹蝗地理种群的 16S rRNA 基因序列的遗传 距离 Table 2 Genetic distance of sequence of 16S rRNA gene a mong 5 geographic populations Rammeacriskian gsu Tsai GXGLCQYCGDGNSCCNHNTJ GXGL CQYC0 0000 GDGN0 00000 0000 SCCN0 00200 00200 0020 HNTJ0 00200 00200 00200 0040 2 4 2 系统发育分析 以中华稻蝗 Oxya chinensis 为外群 基于 5 个 地理种群黄脊竹蝗 16S rRNA 基因序列的差异 构 建 N J 系统树 图 3 从图 3 可以看出 广东广宁 GDGN 重庆永昌 CQYC 广西桂林 GXGL 的 黄脊竹蝗种群聚在一起 并未出现分化 四川长宁 SCCN 和湖南桃江 HNT J 的黄脊竹蝗有一定程 度的分化 但分化程度很低 遗传距离仅为 0 004 通过以上分析发现 这 5 个黄脊竹蝗地理种群部分 有一定的遗传距离 但从总体来看 这 5 个黄脊竹蝗 地理种群并未出现种群分化现象 图 3 用 N J法构建 5 个种群的 16S rRNA 基因序列的分子系统树 Fig 3 N J phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequences of 5 geographic populations 3 讨 论 16S rRNA 基因在群体遗传多样性研究中已经 得到广泛应用 例如 邱高峰等 6 对中国对虾 16S rRNA 基因序列的多态性进行研究 在 523 bp 基因 片段中检测出 37 个多态性位点 分析表明不同地理 种群的中国对虾存在一定程度的分化 蒋钦杨等 7 对 3 个不同群体罗氏沼虾 16S rRNA 基因序列进 行研究 未发现多态性位点 认为 3 个不同群体罗氏 沼虾起源于同一种群 分化程度很低 王泽乐等 8 对重庆市26个南亚果实蝇种群 mtDNA 16S rRNA 基因部分序列进行研究 发现有 21 个种群未出现分 化 5 个种群出现分化但分析程度很低 牛东红 118 第 7 期 姜石生 等 黄脊竹蝗 5 个地理种群线粒体 16S rRNA 基因片段的序列分析 等 9 扩增了缢蛏 6 个群体 16S rRNA 基因片段序 列 序列分析结果表明 6 个群体中的 3 个野生群体 之间出现明显的遗传分化 3 个养殖群体之间并没 有出现遗传分化 周发林等 10 对中国南海海域 5 个斑节对虾野生群体的 16S rRNA 基因进行研究 结果表明 5 个群体存在显著差异 谭宏伟等 11 扩 增 测定 分析了云南省东方蜜蜂 16 个地理群体 16S rRNA 基因部分序列 结果表明不同地理群体 均得到 435 bp 基因序列 并且序列完全一致 戴艳 菊等 12 扩增了三疣梭子蟹 4 个野生群体 16S rRNA 基因片段 得到 524 bp 序列 其中只有 1 个碱基变 异 核苷酸多样性指数为 0 吕振明等 13 对中国沿 海鳓不同地理群体 16S rRNA 基因的遗传变异进 行分析 在 45个个体中共检测到 32 个多态位点 多 态位点比例达 4 88 因而表明 鳓群体中保存着 较高的遗传多样性 由以上研究可见 利用 16S rRNA 基因序列差异能很好地分析同种生物不同群 体的遗传分化程度 本研究测定了 5 个黄脊竹蝗地理种群的 16S rRNA 基因部分序列 其中广东广宁 GDGN 广西 桂林 GXGL 重庆永昌 CQYC 黄脊竹蝗 16S rRNA 基 因片 段 序列 完 全 相同 而湖 南 桃 江 HNT J 和 四川长宁 SCCN 的黄脊竹 蝗 16S rRNA 基因片段序列仅有一个碱基的差异 所以黄 脊竹蝗的遗传分化程度很低 因此 从线粒体 16S rRNA 基因序列来看 黄脊竹蝗的遗传多样性是很 低的 这主要是因为这 5 个地区的地理位置非常接 近 地理条件也很相似 再加上黄脊竹蝗的迁飞性很 强 地理隔离程度很低 赵琴等对这 5 个黄脊竹蝗 地理种群的个体大小 滞育 发育历期等方面进行了 研究 认为这 5 个黄脊竹蝗种群并无显著地理变异 正好与本文研究相吻合 由于条件的限制 本研究只限制于这 5 个地理 种群 黄脊竹蝗所分布的另外几个地理位置较远的 省份并没有采集到标本 再加上所用的遗传标记只 限制于 16S rRNA 基因 因而本研究可能并没有完 全反映出黄脊竹蝗遗传多样性的真实情况 所以黄 脊竹蝗的遗传多样性还需进一步研究 参考文献 1 程良德 竹蝗综合治理对策初探 J 湖北林业科技 2003 23 1 41 42 2 Suneetha K B Dagle G Nevdal G Analysis ofmitochondrial DNA sequence from two Maurolicus taxa evidence for sepa rate species J Journal of Fisheris Biology 2000 57 1605 1609 3 Canapa A Barucca M Marinelli A et al M olecular data from the 16S rRNA gene for the phylogeny of Pectinidae Mol lusca Bivalvia J Journal of Molecular Evolution 2000 50 93 97 4 贺一原 朱道弘 赵吕权 ftsZ 基因和16S rDNA 特异引物检测 栗瘿蜂体内 Wolbachia 感染研究 J 湖南师范大学 自然科学 学报 2007 30 02 113 115 5 Simon C Frati F BeekenbachA et