7[实验七]植物基因DNA的提取及纯度与含量测定.doc

植物总DNA的提取和DNA纯度的测定 谌诚 董琳 马楠 （武汉生物工程学院 10级园林系本科一班） 摘要: 利用基因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组DNA的制备。Abstract: The use of genetically engineered plants by means of directional transformation, has become a new field of plant breeding today, plant genetic engineering can not be separated from the plant genomic DNA preparation.一、实验目的要求1. 了解核酸的存在形式及理化性质。2. 掌握CTAB法提取植物总DNA的原理及操作技术。3. 了解DNA的鉴定方法。4. 学习紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度。二、实验原理利用基因组较长的特性可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离，加入一定量的异戊醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。植物中的次生代谢产物一多酚类化合物可以介导 DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题。这些多糖能抑制限制酶，连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。应考虑去除多糖和酚类物质。三、实验材料1,7mol/ml Nacl溶液，紫外线可见分光光度计，离心机，75%乙醇。一、 操作方法1、取3m核酸提取缓冲液于离心管中，65水浴预热。2、称取水稻幼苗叶片0.5g，剪碎，置于65预热的研钵中，加入少许石英砂，并加入3ml预热到65的核酸提取缓冲液。快速研成匀浆，立即加入到预热离心管中，65恒温水浴1h，经常轻轻摇动。3、加入等体积氯仿-异戊醇-乙醇溶液,轻柔颠倒混匀（带手套防止损伤皮肤）后，室温静置分层10min 。4、室温下5000rpm离心5 min（弃沉淀）。5、仔细移取上清液至另一离心管中，加入3m平衡酚，轻柔顺倒混匀，静置15 min。6、仔细移取上清液至另一离心管中。加入1倍体积异丙醇混匀 后静置20 min，出现絮状DNA沉淀。7、4 5000 rpm离心5 min。8、将沉淀移入新的离心管中（若蛋白质和RNA未除干净可重复操作） 9、加入1.5ml氯仿与1.5ml平衡酚，轻柔顺倒混匀，室温静置15min10、4离心(12000rpm,10min)11、上清液转移到干净离心管中，加入3mL氯仿,颠倒混匀，室温静置10min12、4离心(12000 rpm,10min)13、转移上清液于新离心管当中，加入3mL氯仿,颠倒混匀，室温静置5min。14、4离心(12000rpm,10m in)。15、转移上清液于新的离心管当中加入2L Rnase(0.2g/L),室温放置10min。16、加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积-20预冷的无水乙醇。-20放置20min。17、4离心(5000 rpm,3min)收集沉淀18、70%乙醇洗涤沉淀,倒掉乙醇溶液,37干燥沉淀30min。让酒精完挥发。19、用1mL TE溶解沉淀，此即为水稻基因组DNA溶液。20、加RNA酶保温2030min。21、取100L水稻基因组DNA溶液，稀释1020倍用紫外分光光度计测定其A260、A 280及A230值，计算DNA浓度及A260、A 280、A230的值。22、取L DNA原溶液进行1%Agrose凝胶电泳检测纯度其结果（相对分子质量大小、纯度及质量）贴妥标签4保存备用。说明:如果蛋白质和RNA未驱除干净，重复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，继续用Rnase处理,乙醇沉淀和洗涤，重新溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。在DNA提取过程中应做到、根据不同的需要，保证结构的相对完整性；、尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。注意事项：1、裂解液要预热，以抑制DNase，加速蛋白质变性，促进DNA溶解。2、各步操作要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。3、取上清液时，不应贪多以防非核酸类成分干扰。4、异丙醇、乙醇、NaAc要预冷以减少DNA的降解，促进DNA和蛋白质的分相及DNA的沉淀。思考题：CTAB提取液中各试剂分别有什么作用？答：3%CTAB：裂解细胞膜释放DNP；1.4mol/l Nacl:提高DNA