植物细胞培养.doc

南京市秦淮中学校本教材第七章 植物细胞培养第一节植物细胞培养的理论基础一、植物细胞的全能性植物细胞全能性是指植物体的每一个活细胞具有发育成完整个体的潜在能力。即植物体的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息，在适当的内、外条件下，一个细胞有可能形成一完整的新个体。在植物的生长发育中，从一个受精卵可产生具有完整形态和结构机能的植株，这是全能性，是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。同样，植物的体细胞，是从合子有丝分裂产生的，也应具有像合子一样的全能性。但在完整植株上，某部分的体细胞只表现特定的形态和局部的功能，这是由于它们受到具体器官或组织所在环境的束缚，但细胞内固有的遗传信息并没有丧失。因此，在植物组织培养中，被培养的细胞、组织或器官，由于离开了整体，再加上切伤的作用以及培养基中激素等的影响，就可能表现全能性，生长发育成完整植株。二、植物细胞的脱分化和再分化通常，我们用于组织培养的植物材料，太多是已分化了的细胞。一个已分化有一定机构和功能的细胞要表现它的全能性，首先要经过一个脱分化的过程。脱分化：是指已分化的细胞在一定因素作用下，失去它原由的机构和功能，重新恢复分裂机能。细胞脱分化的机构通常形成愈伤组织。从外植体形成愈伤组织的过程，根据其群体细胞的形态、细胞分裂、生长活动和RNA相对含量的变动，大致可分起动期、分裂期和形成期三个时期。起动期是细胞准备进行分裂时期。外植体在外观上虽看不到多大变化，但代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进行，RNA的含量急剧上升，细胞核和核仁增大。分裂期的主要特征是被起动细胞进行活跃的细胞分裂。这时细胞比起动的细胞更小，核和核仁更大，RNA含量继续上升，出现高峰。由于细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加，开始出现可见的愈伤组织球体。紧接着进入形成期。愈伤组织进一步发展，细胞分裂较多地出现在愈伤组织的周缘近表面部分，且分割面较多的是平周的，因此构成一个所谓愈伤形成层，相应的内部细胞显著增大，核和核仁变小，RNA含量急剧下降。这时愈伤组织迅速长大，同时有薄壁组织分化。愈伤形成层的出现和薄壁组织的分化是愈伤组织建成的特征。用组织培养方法获得的愈伤组织，其质地有的疏松，有的致密。颜色也有不同，它们可以是五色、黄色（含有类胡萝卜素或黄酮类化合物）、淡绿色（含有少量叶绿素）、紫红色（含有花青甙）。显微镜下的观察表明：由完全一致的薄壁细胞组成的愈伤组织甚少。愈伤组织通常是由许多异质细胞集合而成的积聚体。生长旺盛的愈伤组织含有高比例的类似分升组织状的细胞群。高度液泡化的细胞可有各种形状、从圆形到细长形等。再分化：通过脱分化形成的愈伤组织，在一定的培养条件下，可经器官发生或胚状体发生进而发育成完整的植株。由于这是由原来分化状态的细胞脱分化培养后，再次分化，所以称为再分化。器官发生：是指植物组织培养中由培养形成芽或根的现象。器官发生可通过愈伤组织，在愈伤组织中形成一些分生细胞团，随后由其分化成不同的器官原基；也可不通过愈伤组织，由最初的外植体产生器官或由最初外植体通过拟分生组织产生器官。在组织培养中通过形成芽或根而再生植株的方式大致有以下三种：先产生芽，于芽伸长形成茎的基部长根而形成小植物；先长根，在根上长出芽来；在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，通过形成连接两者的维管束组织而形成一个轴，从而形成小植株。大量的研究结果表明：一般地说，植物组织培养中如先形成芽者，其基部多易生根。反之，如先形成根，则往往会抑制芽的形成。胚状体发生：胚状体是指在培养过程中由外植体或愈伤组织产生的与合子胚发育方式类似的胚状结构。它的发生和器官发生一样是以离体组织或细胞的脱分化开始，但以后的一些过程则与单极器官（如芽和根）的发育不同。胚状体的发生过程一般由单个细胞（胚状体原始细胞）进行一次不均等分裂产生两个大小不等的细胞，然后由较小的细胞进行连续分裂产生原胚，而较大的细胞也进行1-2次分裂构成胚柄。胚状体的一个主要特点是两极性，即在其发生的最早阶段就具有了根端和茎端。因此，胚状体一旦形成，即可长出小植株。三、植物激素的调控大量研究表明：在调节控制脱分化和再分化的过程中，除了植物材料本身的特性以及营养、光照、温度等条件完，植物激素起着十分重要的作用。其中影响最显著的是生长素和细胞分裂素。植物组织培养中常用的生长素类有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）等；细胞分裂素类有激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。通常，在外植体经脱分化形成愈伤组织的过程中，生长素和细胞分裂素是必要的。但由于植物种类及所取部分的不同，诱导其形成愈伤组织所需的激素浓度和组合不同。双子叶植物一般采用生长素/细胞分裂素比例高的配方；单子叶植物的细胞增殖比双子叶植物 要求较高的生长素浓度而对细胞分裂素无明显反应。在大多数情况下，只用2,4-D就可以成功地诱导愈伤组织。在再分化的过程中，激素的种类和浓度对培养中的再生方式和器官发生的类型可产生不同的影响。例如在矮牵牛茎、叶组织切块的培养中，用同一浓度（1mg/L）不同种类的生长素(IAA、NAA、2,4-D)处理，可得到不同的结构。IAA只引起愈伤组织的有限生长；NAA可引起根的大量形成；2,4-D则促进愈伤组织产生，培养两周后还有胚状体发生。用2,4-D作进一步浓度实验，发现0.1-0.5mg/L的浓度，可诱导材料形成胚状体，提高2,4-D浓度（2mg/L），促进愈伤组织生长，但抑制胚状体形成。生长素，特别是2,4-D是控制体细胞胚状体发生的重要因素。在不少材料中均可看到，2,4-D对促进胚状体的发生虽有良好效果，但对胚状体的形成和发育有抑制倾向。所以，为了促进培养物分化，应及时除去或减少培养基中2,4-D。激素的调控作用不但决定于激素的种类和浓度，而且还决定于激素的相互之间的配比和绝对用量。50年代，F.Skoog和C.O.Miller在烟草茎髓愈伤组织中发现激动素/生长素的比例高时，利于芽的分化；比例低时，利于根的分化；两者比例适中水平时，愈伤组织占优势。激动素/生长素比例控制器官发生的这种模式，以后大量的实验结果表明，它在组织培养中（特别对双子叶植物的器官发生）具有较普遍意义，但激素之间的配比控制器官发生的类型还受激素绝对用量的影响。例如在番茄叶愈伤组织培养中，用2mg/L IAA+2mg/L KT，发生根；茎芽则仅在用4mg/L IAA+4mg/L KT时发生。 第二节 花药和花粉的培养 花药的培养花药培养是指应用植物培养技术，把花粉发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育途径，形成花粉胚或愈伤组织，随后由胚状体直接发育成植株。花药培养技术在作物的遗传育种上具有多种用途，育种以及避免杂种后性状分离，从而大大提高育种的工作效率。一、花药培养的方法 花药培养产生花粉植株一般有两种途径：其一是花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株；其二是花药中花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导其分化成植株。两种途径并无绝对界限，主要取决于培养基中的激素种类及其浓度配比。有时在同一个花药内一些花粉脱分化成愈伤组织，而另一些花粉则分化成胚状体，在谷子和高粱上都观察到这种现象。花药培养时诱导花粉植株能否成功及诱导频率如何均受到多种因素的影响，其中主要有供试材料及培养方式及条件等。二、供试材料用作花药培养的亲本植株的基因型、生理状况以及接种时花粉所处的发育时期，对花粉植株的诱导频率有直接的影响，因此在接种时对所用的材料要进行严格的选择。1、材料的基因型材料的遗传背景对培养成败关系很大。2、生理状况亲本植株的生理状况，对诱导频率有直接影响。烟草开花早期的花药比后期的更易于产生花粉植株，开花后期的花药不易培养的原因可能是花粉的可育性有所下降。花粉植株的诱导频率还与亲本植株的生长条件密切有关。3、花粉发育时期选择合适的花粉发育时期是提高花粉植株诱导频率的重要因素。被子植物的花粉发育经历四分体时期、单核期、双核期和三核期。在花药早期的研究中发现，并不是任何时期的花粉都可以培养产生愈伤组织或胚状体，只有花粉发育到一定时期对离体的刺激才最敏感。对大多数植物而言，单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。在培养花药之前，要制片镜检以确定花粉发育时期，为方便起见可找出与花粉发育相对应的形态学指标。 检查花粉发育时期，最常用的有醋酸洋红染色制片法，对茄科、禾本科的大多数植物的花粉均可采用此法，但水稻、番茄、芸苔属和许多木本植物的花粉细胞核不着色，需采用培花青铬矾法，可使花粉细胞核染成蓝黑色。三、材料的预处理为提高花药培养的效率，需在接种前对实验材料进行预处理，实验结果证明下列几种处理有效。1、低温预处理：低温预处理可明显提高花粉胚的诱导率，有人将毛叶曼陀罗的花蕾连同总花梗一同采下，将其插在水中，于3下保存48小时，然后取花药接种，重复三次，实验均证明低温促进花粉胚的产生。2、离心法：将花药直接离心或在取出花药前将花蕾及幼穗进行短时间的离心可以提高花粉培养的效率。3、高糖处理：将花药置于高浓度糖溶液中进行短时间（68分钟）处理。4、激素处理：用乙烯喷施植株及加入培养基中也可以有效地提高花药培养的效率。四、材料的接种接种在培养基中花药一定要保证完全无菌，否则会引起严重污染，使培养彻底失败。接种时注意用具和接种环境的灭菌，同时尽量减少花药在空气中的暴露时间。花药接种密度较高为好。五、培养基培养基的种类影响培养效果：基本培养基的组成对花药的培养成功率有明显的影响。 不同的蔗糖浓度影响培养效果：培养基中蔗糖不仅是最好的碳源，而且还起到调节渗透压的作用。由于不同植物的花粉粒渗透压差异很大，因此在花药培养时适宜的蔗糖浓度也不同。对于烟草百分之二的蔗糖效果最好，花粉可经胚状体途径直接发育为花粉植株，小麦由花药诱导花粉愈伤组织用810较为适宜，愈伤组织分化成苗则用58为好。激素：激素对于绝大多数植物的离体花粉的发育常常起着关键作用。在实验过的植物种类中，只有烟草、水稻和小麦花药可在无激素的培养基上能产生花粉胚和植株。生长素：特别是2，4D促使禾谷类的花粉发育成愈伤组织。在含有高浓度的生长素的培养基上，茄科植物的花粉胚也会转化成愈伤组织。要使花粉愈伤组织分化为植株，需将他们转移到含低浓度生长素和较高细胞分裂素的分化培养基上。六、培养方式和培养条件1、培养方式花药的培养方式一般采用琼脂固化的培养基，但近年来许多研究者用液体培养基培养花药。采用液体漂浮培养的方法，花粉胚或愈伤组织的产量比在固体培养基上显著增加。用液体培养基时花药的生长诱导物质容易扩散到培养基中，从而诱发更多的花药对培养起反应。可排除琼脂中可能携带的微量生长抑制物。有些植物如烟草、水稻、小麦和大麦等用花药漂浮法培养、诱导愈伤组织的成功率虽高，但植株分化的频率却较在琼脂培养基上为低。在禾谷类中，液体培养虽可获得大量愈伤组织，但愈伤组织分化困难，白化苗显著增加，所以采用很少。2、培养条件培养条件中最主要的是温度，实验结果表明离体培养的花药对温度比较敏感，曼陀罗、小麦和油菜都是要求较高的植物，在3032下花粉胚的生成率或花粉诱导组织的诱导率较在2628下高得多。对大多数植物而言，培养室温度控制在2830是适宜的，但随着培养温度的提高，水稻花粉愈伤组织分化白化苗的频率也随之增加，因此，培养温度最好控制在2628。禾谷类植物的花药培养，其花粉愈伤组织的诱导频率黑暗下高于光照下。但当愈伤组织转移到分化培养基上之后，光照则有利于愈伤组织的分化和胚状体的发育。当植株分化后，光照对再生植株的健壮生长则更为重要。至于光质的研究很少，据报道，蓝光和紫光对芽的分化有促进作用，红光有抑制曼陀罗花粉胚胎发生的效应。3植株的诱导和移栽、诱导：植株看可以通过两种途径产生，一是来自花粉愈伤组织，两种发育方式所需要的外源激素的种类和浓度不同。在由花粉胚产生小植株的情况下，由于是从花药囊中长出，因此往往茎叶细弱、根系不发达，很难直接移栽到土壤中，需要将幼苗移到合成培养基上以壮苗，然后移栽到盆中或苗床上，盖上玻璃烧杯或塑料薄膜以保持一定的空气湿度，有利于小苗的成活。在由花粉形成愈伤组织的情况下，应把愈伤组织转移到分化培养基上诱导形成根和芽。花粉愈伤组织的年龄显著影响分化频率，这在禾谷类植物中尤其显著。愈伤组织及时转移是诱导分化的关键。当然过早的移栽，不利于愈伤组织的成活和生长。对于大多数植物而言，愈伤组织在分化培养基上生长1020天后，一般就可以看到芽的分化，然后在芽的基部长出不定根。有时芽的基部不能分化出不定根，或虽有根但苗太细弱，需要更换培养基进行壮苗培养。、移栽：移栽后的花粉植株能否成活和正常生长决定于栽培和管理措施。水稻性属喜高温，2530的温度和较强的光照对于幼苗的成活和生长是必须的。玉米幼苗在20左右条件下生长，除保湿外，还必须有足够的光照。而对于油菜和小麦等冬作物，宜控制在20以下，一旦花粉植株在夏秋高温季节形成，可将幼苗放入35冰箱中贮存，待气温转凉后，将幼苗取出照光使之转绿，再转入土中。 花粉的培养花粉具有单倍体和单细胞两个方面的特点，因为除了用作花粉培养深入研究以外，更是研究花粉细胞分化条件，胚胎发生和形态发生机理的较为理想的方法。建立花粉粒培养实验系统，也可以为深入开展细胞工程，遗传工程和分子生物学的研究提供技术基础。 离体花粉粒在培养基上培养一段时间以后，一些种如烟草，曼陀罗等就从花粉粒直接形成胚状而发育成苗，而另一些种如茄子，马铃薯，水稻，小麦和大大麦等则由花粉粒分裂形成愈伤组织，然后再分化成苗。 一、花粉的分离 1、压挤法将花粉置于液体培养基中，用平头的玻璃棒反复挤压花粉，挤出花粉后用镊子将花药空壳取出。此法的优点是操作简便，缺点是花粉中混有体细胞并且所得的悬浮液中花粉密度也不易控制。将经预培育过的花粉或从刚采下的花蕾或下花中取出的花药放入小烧杯中 ，加入一定浓度的蔗糖溶液或甘露醇液，用注射器内管轻压研磨花药挤出花粉，然后将得到的花粉与药壁残渣的混合液通过网筛（一定孔径的不锈刚筛或尼龙布筛，孔径应比花粉粒大10 左右）收集到离心管内，于是大块药壁残渣被留在网上,离心管中含有花粉与小块药壁残渣。离心管经500-1000转每分钟，花粉粒沉淀，小块药壁残渣留在上清液中，弃去上清液，再重复加悬浮液离心洗涤两次，最后再用培养液离心纯化一次。2、漂浮法利用一些植物的花药漂浮在液体培养基能自行开裂，脱落出花粉的特性建立了脱落花粉系列收集法。将花粉发育处于单核中，晚期的花药，经一定时间的低温处理后，按每升60-100枚的花药密度接种在适宜的液体培养基上，培养一定天数后，漂浮的花粉自动裂开，花粉脱落在液体培养基中，其间转移花药到相同的新鲜液体培养基中 ，供再脱落，连续收集之用。合并收集脱落花粉悬浮液于离心管中，通过离心重复清洗两次（1000转/分钟，1-2分钟），再悬浮于液体培养基，用血球记数板记数，使花粉密度达1000000个/ml左右。此法操作简便。3、磁拌法该法是将花粉接种于盛有培养液和渗透压稳定剂的三角瓶中,再放入一根磁棒,为提高其分离速度,可另加入几颗玻璃珠,置于磁力搅拌仪上,低速转至花药呈透明。此法分离花粉比较彻底，但对花粉有不同程度的损伤。二、花粉培养法1、直接培养法从未经任何预培养或预处理的新鲜的花药中分离花粉粒，直接接种到合成培养基中进行培养。这个方法在50年代就能诱导某些裸子植物如银杏等的花粉形成愈伤组织，但在 很长时间里没有取得进展。直到年才在普通烟草花粉直接培养上，经胚状体途径获得成功。其关键是取花粉处于二细胞阶段的花药在水中分离花粉粒，并在水中培养5-7天，再转到加有20%蔗糖和5mol/L谷氨酰氨的培养，既可通过形成花粉胚而长成花粉植株。稍后在黄化烟草花粉直接培养上，40%花粉粒经胚状体途径获得植株成功。统计表明，花粉在水或无糖培养基上培养存后活率高。含糖培养基基上培养存后活力迅速下降，此点可能是由于离体花粉不能获得胚状体发育的主要原因之一。更有可能是无糖饥饿效应促进了存活的离体花粉发育途径的改变。由蔓青的。花粉粒培养也能形成花粉胚并能发育成植株2、花药经预培养后分离的花粉培养有人采用花药预培养的方法，将花药在基本培养基中培养了3-6天，然后取出花粉，经离心冲洗后在液体培养基上进行培养，培养三周后可见到各个阶段的花粉胚，4-5周后可发育成小植株。 第八章 植物组织培养技术一、基本概念植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，统称为植物组织培养。由于是在试管内培养，而且培养的是脱离植物母体的培养物，因此也称离体培养和试管培养，根据外植体来源和培养对象的不同，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。二、培养方式 植物组织培养方式大致可分为固体培养和液体培养两类。 固体培养即将植物材料培养在加入一定量凝固剂的固体培养基上，最常用的凝固剂是琼脂，其用量为6-10g/L，以不液化为原则（半固体）。用量太高，培养基过硬，培养材料感好，生长不好；用量太少，则培养基太软，材料在培养基中不稳定，甚至下沉，从而影响组织的呼吸。培养基的硬度还可能受到所用琼脂的质量、培养基pH及无机盐浓度的影响。固体培养基的优点是简便，只要具备培养室（箱）、接种室（箱）以及一般是实验室的玻璃皿就可以开展工作。其缺点是被培养的材料只有一部分表面能与培养基接触，因此与组织接触处的营养物质很快被吸收掉，而其他区域补充又来得较慢，形成了培养基中营养物质浓度差异，影响组织的生长速率。液体培养即植物材料被培养在不加凝固剂的液体培养基中。液体培养基常用摇床或转床来振动培养容器，振动速度一般为50-100次分。液体培养基中培养物是被培养基所包围，培养基中的营养物质分布均匀，不会出现浓度差异现象，同时培养物的供氧情况也得到改善，有利于它的代谢、生长。因此，在液体培养中，培养物的生长速度要比固体培养快得多。三、培养基及配制（一）培养基的成分培养基是植物组织培养中离体植物材料赖以生存、生长发育的基地。培养基的合适与否是培养能否成功的关键因素之一。培养基的成分是根据被培养植物材料的生长发育所需要的营养而设计的。目前在植物组织培养中所采用的培养基成分除水（用蒸馏水）外，一般包括以下五大类：1、无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2EDTA（螯合剂）的混合。2、碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。3、维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。4、有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。5、生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。(2)细胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt）。(3)赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。（二）、几种常用培养基的配方及其特点在长期的组织培养中，根据不同的植物材料和不同培养目的对各种营养成分的不同要求，人们已设计出不同的培养基（表）。不同培养基的特点不尽相同，一般无机盐的变化较大，在氮的运用上，有的只用硝酸盐，也有硝酸盐和铵盐混用的。例如MS培养基是最广泛应用的培养基。其内无机盐的用量较合适，足以满足很多培养材料在营养和生理上的要求。一般情况下，不必加入蛋白质水解物、酵母提取物等有机附加物。MS培养基中硝酸盐、铵和钾的含量比其他培养基高，这是它的明显特点。LS培养基或称为RM-1965培养基，实在MS培养基的基础上修改而来的，只是去掉了甘氨酸、盐酸吡哆酸、烟酸，硫胺素提高为.4mg/L。White培养基与MS培养基相比，则是一个具有较低浓度无机盐的培养基。他的使用也较广泛，在根培养、胚胎培养及木本植物的组织培养上效果较好。B5培养基O.L.Gamborg等1968年为培养大豆的细胞而设计的。他的主要特点是含有低浓度的铵。而铵这一营养成分对有些培养物可能有抑制生长的作用。N6培养基适用于禾谷类植物的花药、花粉培养及某些植物的组织培养上。表几种常用植物组织培养培养基配方（单位：mg/L）培养基化合物MS（1962）White(1963)B5(1968)N6(1974)KCl65MgSO4.7H2O370720250185NH4NO31650(NH4)2SO4134463KNO319008025002830CaCl2.2H2O370720250185KCl65Ca(NO3)2.4H2O300Na2SO4200NaH2PO4.H2O16.5150KI0.830.750.730.8H3BO36.21.531.6MnSO4.4H2O22.374.4MnSO4.H2O10ZnSO4.7H2O321.5ZnSO4.4H2O8.6NaMoO4.2H2O0.250.25CuSO4.5H2O0.0250.025CoCl2.6H2O0.0250.025Na2-EDTA37.337.337.3FeSO4.7H2O27.827.827.8Fe(SO4)22.5肌醇100100烟酸0.50.510.5盐酸硫胺素0.10.1101盐酸吡哆素甘氨酸232蔗糖30000200002000050000pH5.8近年来，培养基都倾向于采用高浓度的无机盐。高浓度的无机盐能较好地保证组织生长所需的矿质营养，又可由于离子浓度高，在配制、贮存和消毒过程中，即使某种成分少有出入，也不至于影响培养基的离子平衡。 (三)培养基的配制方法1.制备母液为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。(1)大量元素。大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。制备时，按表中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1升，此即大量元素母液。(2)微量元素。因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或1000倍的母液。配制时，每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。(3)铁盐。铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO47H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培养基，加铁盐5毫升。(4)有机物质。主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量，分别配成所需的浓度(0.11.0毫克/毫升)，用时按培养基配方中要求的量分别加入。(5)植物激素。最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为0.0110毫克/升。可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用12毫升0.1N(克当量浓度)氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用少量0.5或1N的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。2.配制培养基的具体操作根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。将中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。成分单的格式与内容见表2。3.培养基的灭菌与保存培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，120灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。表MS培养基 成分 分子量 使用浓度 (mg/L) 大量元素 硝酸钾 KNO3 101.11 1900 硝酸铵 NH4NO3 80.04 1650 磷酸二氢钾 KH2PO4 136.09 170 硫酸镁 MgSO4.7H2O 246.47 370 氯化钙 CaCl2.2H2O 147.02 440 微量元素 碘化钾 KI 166.01 0.83 硼酸 H3BO3 61.83 6.2 硫酸锰 MnSO4.4H2O 223.01 22.3 硫酸锌 ZnSO4.7 H2O 287.54 8.6 钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O 241.95 0.25 硫酸铜 CuSO4.5 H2O 249.68 0.025 氯化钴 CoCl2.6H2O237.93 0.025 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA 372.25 37.3 硫酸亚铁 Fe2SO4.7H2O 278.03 27.8 有机成分 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素 VB1 0.1 盐酸吡哆醇 VB6 0.5 烟酸 VB5 或 VPP 0.5 琼脂 agar 7 g /L 蔗糖 sucrose 342.31 30g /L 经过灭菌的培养基应置于10下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在45低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。四、无菌操作（一）、培养材料的消毒植物体表面常附有各种各样的微生物，所以必须先将材料进行消毒。由于培养材料是活的植物组织，所以材料消毒的一个基本原则是既要把材料上附着的微生物杀死，又不要伤及材料，影响其生长。消毒剂的选择、药剂浓度和处理时间的长短要根据材料对消毒剂的敏感性来决定。一般采用消毒效果较好，而且在消毒后能够很容易去掉的药剂，例如用无菌水（即经高压灭菌的蒸馏水）冲洗几次后可把大部分药剂冲掉的或能自动分解变成毒性很低的物质。目前常用的消毒剂如次氯酸钠，它能分解出有杀菌效果的氯气，过后散失到空气中。低浓度的氯化贡（升汞）溶液，消毒效果很好，缺点是不易除去残留的汞，因此，消毒后必须用大量的无菌水反复冲洗。 材料的干净与否，影响着消毒的效果，因此在消毒前一般需将材料先用蒸馏水充分冲洗干净。较脏的材料要用中性肥皂水轻轻擦洗（注意勿损伤表皮细胞），再用清水反复冲洗。 对一些带茸毛的材料，由于茸毛间有空气，常使消毒液不易进浸入，影响消毒效果。可在材料放入消毒液之前，先在70%酒精中漂洗数秒钟，这样可使材料表面弄湿，从而使消毒液易于浸透材料，杀死微生物，而且酒精本身也是很好的消毒剂。材料消毒后放在无菌的培养皿中备用。（二）、无菌操作植物组织培养中除了培养基及材料本身消毒不彻底引起污染外，还可在操作过程中引起污染。为了减少或免除这种污染，全部操作过程都必须严格做到无菌操作，为此，必须要在接种室（箱）中进行接种。近年来，大多采用超净工作台代替接种室（箱）。由于超净工作台有机动滤尘设备，使进入台面的空气净化。接种前应先开机15分钟，保证接种空间的空气充分过滤消毒。接种前，工作人员的双手必须剪去指甲及用肥皂仔细洗净，再用70%酒精棉球擦拭，操作所用的用具和器皿，必须经过灭菌处理。金属用具（如刀、剪、镊子等）先用70%棉球仔细擦拭，再在酒精灯火焰上灭菌，冷却后使用。玻璃器皿用牛皮纸或废纸包好置于高压灭菌锅中120灭菌20分钟，也可在电热烘箱内150干烘40分钟或120干烘2小时灭菌。 接种时，要严格操作。例如在去掉培养容器上的橡皮筋和包纸时动作要轻，以免扬起带真菌孢子的灰尘，致使接种操作空间污染。打开瓶塞时必须在近酒精灯火焰处，瓶子拿成斜角（瓶口低，底部高），最好瓶口在酒精灯火焰的上方，这样可借助火焰上升的气流阻止空气中漂浮的孢子落入瓶内。接种过程中注意切勿让手或被手接触过的器具部分碰到植物材料，同时禁止谈话、咳嗽，以免呼吸排出的细菌引起污染。接种用的工具（刀、镊子等）在使用中可能会从空气、消毒不彻底的材料以及操作人员的身上等几方面又重新受到污染，因此这些工具每使用一次后，最好在酒精灯的火焰上再烧灼灭菌，但必须冷却后才能使用，为此需备两份同样的工具，交替使用。 材料接种好后，将瓶口放在酒精灯火焰上转动烧一遍，杀死留在瓶口的细菌。加盖封口。五、植物组织培养的应用 （一）、在植物育种上的应用目前，国内外把植物组织培养已普遍应用于作物育种，并在以下几个方面取得了较大进展：1、单倍体育种单倍体植株往往不能结实，在培养中用秋水仙素处理，可使染色体加倍，成为纯合二倍体植株，这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。单倍体育种具有高速、高效率、基因型一次纯合等优点，因此，通过花药或花粉培养的单倍体育种，已经作为一种崭新的育种手段问世，并已开始育成大面积种植的作物新品种。在单倍体育种方面，我国科学家做出了突出贡献。1974年就育成了世界上第一个作物新品种-单育1号烟草品种。随后又育成了中花8号水稻和京花1号、京单92-2097小麦等面积栽培的作物新品种，还获得了多种作物的大量花培新品系。河南省在花培育种方面卓有成效，培育出了花培28、花配2321、峡麦1号、豫麦1号、豫麦37号、花9、花特早、豫麦60号等优良品种(系)，已累计推广700多万亩，在全国名列前茅。2、胚胎培养在植物种间杂交或远缘杂交中，杂交不孕给远缘杂交带来了许多困难。而采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育并成功地培养出杂交后代，可以通过无性系繁殖获得数量较多、性状一致的群体，胚培养已在50多个科属中获得成功。远缘杂交中，可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株，此法称为“试管受精”。用胚乳培养可以获得三倍体植株，为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径。三倍体加倍后可得到六倍体，可育成多倍体新品种。3、细胞融合通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或育成优良品种，这是组织培养应用最诱人的一个方面，目前已获得40余个种间、属间、甚至科间的体细胞杂种、愈伤组织，有些还进而分化成苗。目前，采用原生质体融合技术已经能从不杂交的植物中如番茄和马铃薯、烟草和龙葵、芥菜等获得属间杂种，但这些杂种尚无实际应用价值。随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展，今后可望获得更多有一定应用价值的经济作物体细胞杂种及新品种。4、基因工程用基因工程的方法，把目标基因切割下来并通过载体使外来基因整合进植物的基因组是完全有可能的，这项研究如果获得成功，将克服作物育种中的盲目性，而变成按人们的需要操纵作物的遗传变异，育成优良品种，目前这项研究刚刚起步，加上植物的遗传背景比原核生物更为复杂，因此，要用基因工程实现作物改良，以增加产量和改善品质，将是21世纪需要解决的一个问题。5、培养细胞突变体无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时，处理细胞数远远多于处理个体数，因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来。例如植物抗