水培及生理指标的测定-.doc

水培前种子的处理把种子置于灭菌三角瓶中（第1天） （水洗1min）换成70%乙醇 （摇晃5min，不能太激烈）水洗2次，每次1min换成15%次氯酸钠（5min）水洗3次，每次1min培养皿（双层滤纸）室温等种子基本露白，放4度冰箱点种子注意：PEG处理的要多点种子，因为处理后的叶子变蔫，质量变小。Hoagland培养液100微量元素1L2LH3BO3309.2mg0.6184gMnCl.4H2O198mg0.396gZnSO4.7H2O23mg0.046 gCuSO4.7H2O9.98mg0.01996 g(NH4)6MoO24.4H2O2.48mg0.00496 g100铁盐（Fe2+）（以下用一个就行）C10H12O8M2Na2Fe1.954g/LC10H12O8M2NaFe1.839g/L1大量元素KH2PO4136.09mg/LKNO3505.5 mg/LCa(NO3) .4H2O1.18 g/LMgSO4.7H2O492.94mg/L20大量元素KH2PO42721.8 mg/LKNO310110 mg/LCa(NO3) .4H2O23.6 g/LMgSO4.7H2O9858.8 mg/L8大量元素 PH5.8_6.0(KOH调)1L2.5L4LKH2PO41.0887g2.72175g4.3549gKNO34.044g10.11g16.176gCa(NO3) .4H2O9.44g23.6g37.76gMgSO4.7H2O3.9435g9.8587g15.774g注意：KH2PO4、KNO3、Ca(NO3) .4H2O溶完后再加MgSO4.7H2O实验中常用酸碱的质量密度与浓度的关系名 称分 子 式相对质量质量密度（Kg / L）百分浓度（w/w）量浓度C（粗略） ( molL1 )配1升1molL1溶液所需数（ml）盐 酸硫 酸硝 酸冰乙酸乙 酸磷 酸氨 水氢氧化钠溶液HC1H2SO4HNO3CH3COOHCH3COOHH3PO4NH3H2O 36.47 98.09 63.02 60.05 98.06 35.05 40.0 1.19 1.18 1.10 1.84 1.18 1.42 1.40 1.20 1.05 1.075 1.71 0.90 0.904 0.91 0.96 1.5 37.2 35.4 20.0 95.6 24.8 70.90 65.3 32.36 99.5 80.0 85.0 27.0 25.0 10.0 50.0 12.0 11.8 6.0 18.0 3.0 16.0 14.5 6.1 17.4 14.3 15.0 15.0 14.3 13.4 5.6 19.0 84 56 63 59 69.93 67 67 70 53Pro含量的测定在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸（配20ml 6mol/L磷酸时，加8mL的磷酸）中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中；2. 3磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸； 4. 甲苯。实验步骤 1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100g。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（甲苯有毒，最好带口罩）（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至石英比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（换样品测量时，可用甲苯或乙醇润洗）（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。 2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下： 脯氨酸含量（g/g）X5/2/样重（g）。 测曲线的脯氨酸量2ug4ug6ug8ug10ug12ug需脯氨酸原液的量20ul40ul60ul80ul100ul120ul补水1.98ml1.96ml1.94ml1.92ml1.90ml1.88ml丙二醛含量的测定丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDATBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300g/g DW，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5mol/L。 A. 直线回归法 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖（025mmol/L）与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y5320.001980.088D450 B双组分分光光度计法据朗伯-比尔定律：DkCL，当液层厚度为1cm时，k=D/C，k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。 已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40，7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式：C1(mmol/L)=11.71D450 C2(mol/L)=6.45(D532D600)0.56D450 式中 C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度；D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。试剂： 10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英砂。（加10%TCA时，要缓慢加，避免形成沉淀。） 步骤 1. MDA的提取 称取剪碎的试材1g，液氮研碎，加入2ml 10TCA研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心（4000g）10min，上清液为样品提取液。 2. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。 3. 计算含量 (1) 直线方程法 按公式求出样品中糖分在532nm处的消光度值Y532，用实测532nm的消光度值减去600nm非特异吸收的消光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。 (2) 双组分分光光度法 按公式可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。 用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：MDA（mol/g FW）土壤含水量的测定烘干法烘干法是唯一可以直接测量土壤水分方法，也是目前国际上的标准方法。（1）取洗净的编有号码的有盖铝盒（或玻璃称量瓶），放在1052的烘箱中烘干，用坩埚钳取出放入干燥器中冷却，在天平（感量0.01g、0.0001g）上称得其恒重（A）。一般测定土壤自然含水量，使用感量0.01g天平，测定风干土样使用感量0.0001g天平。（2）用牛角勺将约5.0g土样，均匀地平铺在铝盒中，准确称重（B）.（3）将敞开盖子的铅盒放入1052的恒温烘箱中，铅盒盖放在铝盒的旁侧或倾斜放在称量瓶上。烘6h左右。（4）用坩埚钳将铝盒取出，盖上盖子，置铝盒于干燥器中2030min，冷却到室温，称重。启开铝盒盖，在烘2h，冷却，称至恒重（C）即前后两次称重之差不大于3mg。5.结果计算土壤吸湿水的含量（W）=100%式中 A铝盒的重量（g） B土样与铝盒的重量（g） C烘干土与铝盒的重量（g）注：平行测定结果的相差，水分小于5%的风干土样不得超过0.2%，水分为5%25%的潮湿土样不得超过0.3%，水分大于15%的大粒黏重潮湿土壤不得超过0.7%。土壤含水量 (water content of soil)是土壤中所含水分的数量。一般是指土壤绝对含水量，即100g烘干土中含有若干克水分，也称土壤含水率。用土钻采取土样，用 0.1g 精度的天平称取土样的重量，记作土样的湿重 M，在 105的烘箱内将土 样 烘 68 小 时 至 恒 重 ， 然 后 测 定 烘 干 土 样 ， 记 作 土 样 的 干 重 Ms土壤含水量=（烘干前铝盒及土样质量-烘干后铝盒及土样质量）/（烘干后铝盒及土样质量-烘干空铝盒质量）*100%植物可溶性糖(soluble sugar)测定:蒽酮比色法糖在硫酸的作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物。在低浓度时，625nm的OD值与糖含量成正相关。该实验方法简便，但没有专一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。实验用品721型分光光度计，分析天平，研钵，恒温水浴锅，烧杯，刻度试管，大试管，移液管，漏斗，玻璃棒，试管架，吸耳球，滤纸 试剂：活性炭，酒精（80%） 葡萄糖标准溶液： 称取已在80烘箱中烘至恒重葡萄糖100mg,配制成500mL溶液，即得每mL含糖为200g的标准溶液。蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000mL稀硫酸中即得。稀硫酸溶液由760mL浓硫酸（比重1.84）稀释成1000mL而成。实验步骤1.可溶性糖的提取：称取0.5g的新鲜植物叶片，于研钵中加80%酒精4ml，仔细研磨成匀浆，倒入离心管内，置于80水浴中不断搅拌30min，离心10分钟(5000转/min)，收集上清液于10ml的刻度试管中，其残渣加2ml80%酒精重复提1次，合并上清液。在上清液中加0.5g活性炭，80水浴脱色30min，定容至10ml，过滤后取滤液(稀释10倍或20倍后)测定。2.显色及比色：吸取上述糖提取液1mL， 放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中得糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。3.绘制标准曲线：取标准葡萄糖溶液将其稀释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每mL含糖0、30、60、90、120、150、180g。按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A625糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。试剂（ml) 管号 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖标准液 0 0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 0.980%酒精 1.0 0.85 0.7 0.55 0.4 0.25 0.1蒽酮-硫酸试剂 5 5 5 5 5 5 5葡萄糖浓度（ul/ml) 0 30 60 90 120 150 180样品中含糖量：设V为植物样品稀释后的体积（m L）；C为提取液的含糖量(g/ m L)；W为植物组织鲜重(