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第一章蛋白质化学 引言 蛋白质概述 蛋白质存在于所有的生物细胞中 是构成生物体最基本的结构物质和功能物质 蛋白质是生命活动的物质基础 它参与了几乎所有的生命活动过程 蛋白质分子量的变化范围很大 从大约6000到1000000道尔顿 Da 或更大 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基 多肽链 通过非共价结合而成的 称寡聚蛋白质 有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万 TMV 4x107 不同的蛋白质导致蛋白质功能的多样性 1酶类2结构蛋白类3转运蛋白类4收缩或运动蛋白类5保护和防御蛋白类6营养和储存蛋白类7调节蛋白类8其他蛋白 受体蛋白 毒素蛋白 激素蛋白等 综上所述 蛋白质存在于所有的生物细胞中 是构成生物体最基本的结构物质和功能物质 蛋白质是生命活动的物质基础 它参与了几乎所有的生命活动过程 在细胞结构 生物催化 物质传输 运动 防御 调控以及记忆 识别等各方面都起着极其重要的作用 2 氨基酸的分类 1 根据来源分 内源氨基酸和外源氨基酸 2 从营养学角度分 必需氨基酸和非必需氨基酸 IleMetValLeuTrpPheThrLys一家写两三本书来 3 根据是否组成蛋白质来分 蛋白质中常见氨基酸 蛋白质中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸 蛋白质中常见氨基酸的结构 甘氨酸Glycine 脂肪族氨基酸 氨基乙酸 氨基酸的结构 脂肪族氨基酸 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine 氨基丙酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine 脂肪族氨基酸 氨基异戊酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine 脂肪族氨基酸 氨基异己酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine 脂肪族氨基酸 氨基 甲基戊酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline 亚氨基酸 吡咯烷基 羧酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine 含硫氨基酸 氨基 甲硫基丁酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine半胱氨酸Cysteine 含硫氨基酸 氨基 巯基丙酸 氨基酸的结构 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine 氨基 苯基丙酸 氨基酸的结构 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine 氨基 对羟苯基丙酸 氨基酸的结构 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸TryptophanTrp 氨基 吲哚基丙酸 氨基酸的结构 碱性氨基酸 精氨酸Arginine 氨基 胍基戊酸 氨基酸的结构 碱性氨基酸 精氨酸Arginine赖氨酸Lysine 二氨基己酸 氨基酸的结构 碱性氨基酸 精氨酸Arginine赖氨酸Lysine组氨酸Histidine 氨基 咪唑基丙酸 氨基酸的结构 天冬氨酸Aspartate 酸性氨基酸 氨基丁二酸 氨基酸的结构 天冬氨酸Aspartate谷氨酸Glutamate 酸性氨基酸 氨基戊二酸 氨基酸的结构 丝氨酸Serine 含羟基氨基酸 氨基 羟基丙酸 氨基酸的结构 丝氨酸Serine苏氨酸Threonine 含羟基氨基酸 氨基 羟基丁酸 氨基酸的结构 天冬酰胺Asparagine 含酰胺氨基酸 氨基酸的结构 天冬酰胺Asparagine谷酰胺Glutamine 含酰胺氨基酸 1 根据氨基酸的结构 氨基酸可分为脂肪族氨基酸 芳香族氨基酸和杂环氨基酸 脂肪族氨基酸 一氨基一羧基氨基酸 GlyAlaVal Leu Ile 一氨基二羧基氨基酸 AspGluAsnGln二氨基一羧基氨基酸 Lys Arg含硫氨基酸 CysMet 含羟基氨基酸 SerThr 芳香氨基酸 TyrPhe 杂环氨基酸 HisProTrp 2 按氨基酸R基的极性性质 20种氨基酸可分为以下四组 非极性R基氨基酸 有8种氨基酸 即丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 蛋氨酸和脯氨酸 其中的丙氨酸的极性最小 介于非极性和极性之间 不带电荷的极性R基氨基酸 有7种氨基酸 即丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺 半胱氨酸和和甘氨酸 其中甘氨酸的侧链介于极性和非极性之间 而半胱氨酸和酪氨酸的极性最强 带正电荷R基氨基酸 这是一类碱性氨基酸 PH为7时携带正电荷 属于碱性氨基酸的有赖氨酸 精氨酸和组氨酸 其中组氨酸是一个弱碱性氨基酸 它含有一个弱碱性的咪唑基 在PH6时 组氨酸分子50 以上质子化 但PH7时 质子化的分子不到10 组氨酸是R基的PK值在7附近的唯一的氨基酸 带负电荷的R基氨基酸 属于这一类的是两种酸性氨基酸 即天冬氨酸和谷氨酸 两个氨基酸在PH6 7范围内 两个羧基都解离 因此分子带负电荷 除以上介绍的外 氨基酸还包括不常见的蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸 不常见的蛋白质氨基酸 即组成蛋白质氨基酸的衍生物 如4 羟脯氨酸和5 羟赖氨酸存在于纤维状蛋白质的胶原中 其次还有N 甲基赖氨酸 羧基谷氨酸等 非蛋白质氨基酸 除20种蛋白质氨基酸外 还有大约150多种其它氨基酸 蛋白质中几种重要的稀有氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸 通常称为不常见蛋白质氨基酸 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的 其中重要的有4 羟基脯氨酸 5 羟基赖氨酸 N 甲基赖氨酸 和3 5 二碘酪氨酸等 这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下 3 非蛋白氨基酸 广泛存在于各种细胞和组织中 呈游离或结合态 但并不存在蛋白质中的一类氨基酸 大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物 H2N CH2 CH2 COOHH2N CH2 CH2 CH2 COOH 丙氨酸 氨基丁酸 非蛋白氨基酸存在的意义 1 作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分 D GluD Ala2 作为一些重要代谢物的前体或中间体 丙氨酸 VB3 鸟氨酸 Orn 胍氨酸 Cit 尿素 3 作为神经传导的化学物质 氨基丁酸4 有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体 刀豆氨酸 5 调节生长作用6 杀虫防御作用绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚 返回 4 氨基酸的重要理化性质 氨基酸的晶形不一样 味道不同 熔点高 可溶于极性容溶剂 不溶于非极性溶剂 除甘氨酸外 都具有D 及L 型之分 且具有旋光性 在近紫外光区 220 300 酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸有吸收能力 物理性质 2 氨基酸的光吸收 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收 但在远紫外区 220nm 均有光吸收 在近紫外区 220 300nm 只有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 酪氨酸的 max 275nm 苯丙氨酸的 max 257nm 色氨酸的 max 280nm 化学性质 1 有氨基参与的反应a 与亚硝酸的反应R CH COOH HO ON N2 H2O R CHCOOH NH2OH此性质为VanSlyke氨基氮测定方法的原理 紫外吸收 上面提到 酪氨酸 色氨酸和苯丙氨酸具有紫外吸收能力 其吸收光谱分别为278 259 257 229 280 蛋白质含有这些氨基酸 所以也具有紫外吸收能力 一般最大吸收在280纳米处 因此能利用分光光度法定量蛋白质的含量 但在不同的蛋白质中这些氨基酸的含量不同 所以他们的消光系数是不完全一样的 分光光度法定量分析的依据是根据Lamber beer定律 A或D lgI0 I lg1 T CL 作用 多肽及蛋白质的N 末端氨基酸上面的游离氨基也能与2 4 二硝基氟苯作用 所以此反应常用于蛋白质一级结构氨基末端的测定 d 与异硫氰酸苯酯的作用 产物为苯硫乙内酰脲 PTH 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 亦称Edman反应 e 与酰化试剂反应 氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时 氨基即被酰基化 例如与苄氧 苯甲氧 甲酰氯 carbobenzyloxychlorride 反应 苯环 CH2 O C Cl H2N CH COONa 弱碱后酸化OR苯环 CH2 O C HN CH COOH Na Cl OR苄氧酰氨基酸这里 NH2中的一个H被苄氧甲酰基 可简写为Cbz 取代生成Cbz 氨基酸 除了苄氧甲酰氯外 酰化试剂还有叔丁氧甲酰氯 对 甲苯磺酰氯以及邻苯二甲酸酐等 这些酰化试剂在多肽的蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂 另一个酰化试剂是丹磺酰氯 dansylchloride 它是5 二甲基氨基萘 1 磺酰氯的简称 被用于多肽链NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定 与丹磺酰氯反应 用途 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 DNS AA多肽蛋白 弱碱 DNS AA多肽蛋白 酸 DNS AA 游离AA 乙醚抽提 有荧光 f 形成西佛碱反应 氨基酸的 氨基能与醛类化合物反应生成弱碱 即所谓西佛碱 Schiff sbase R RR R H2O C O H2N C COOH C N C COOH HHHH醛氨基酸西佛碱西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的中间物 g 与荧光胺反应 荧光胺可与 氨基酸中的氨基反应生成产荧光的化合物 且反应非常灵敏 它具有特定的激发波长 390纳米 和发射波长 475纳米 读取发射光的荧光强度即可测定氨基酸的含量 h 脱氨基反应 见氨基酸代谢 氨基酸的两性解离符合Bronsted Lowry的酸碱质子理论 即氨基酸在水溶液中的偶极离子既起酸 质子供体 又起碱 质子受体 的作用 氨基酸完全质子化时 可以看成是多元酸 侧链不解离的中性氨基酸可看作二元酸 酸性氨基酸和碱性氨基酸可视为三元酸 在这里同样可以利用Handerson Hasselbalch公式进行pH或氨基酸各种离子浓度比例的计算 质子受体 pH pK lg 质子供体 pK 为表观解离常数的负对数 可用测定滴定曲线的实验方法求得 其拐点处PH值即为PK 不同基团具有不同的PK 值 P92 20种氨基酸中 除组氨酸外 在生理PH PH7 下都没有明显的缓冲容量 因为这些氨基酸PK 都不在PH7附近 而缓冲容量只在接近PK 值时才显现出来 红细胞中运载氧气的血红蛋白含有较多的组氨酸 使得它在PH7左右的血液中具有显著的缓冲能力 这一点对红细胞在血流中起运输氧气和二氧化碳的作用来说是重要的 等电点计算公式的推导 在氨基酸完全质子化时 各种不同氨基酸的等电点可由下面的方法推导出来 对于中性氨基酸 一氨基一羧基氨基酸 以R表示带电情况 则 R R0 H K1 R0 H R 则 R R0 H K1 R0R H K2 R H R0则 R R0 K2 H 当在等电点时 R R 则有 H 2 K1 K2 即 H K1 K2 1 2等式两边取负对数得 pH 1 2 pK1 pK2 也就是pI 1 2 pK1 pK2 K1 K2 同样对于三个可解离的氨基酸例如天冬氨酸和赖氨酸来说 只要写出它的解离公式 然后取兼性离子两边的pK值的平均值 则得其等电点 如天冬氨酸的解离如下 R R0R R2 则pI 1 2 pK1 pK2 而赖氨酸的解离如下 R2 R R0R 则pI 1 2 pK2 pK3 pK1 pK2 pK3 pK1 pK2 pK3 K 1 K 2分别代表 COOH和 NH3 的表观解离常数 若侧链R基有可解离的基团 其表观解离常数用K R表示 酸性溶液中 两性离子状态 丙氨酸的滴定曲线 1 0 0 5 0 0 5 1 0 0 7 13 pK 1 2 34 pI 6 02 pK 2 9 69 Ala Ala Ala Ala AlaAla Ala A B pH HCl NaOH 丙氨酸的滴定曲线 当1mol L的丙氨酸溶于水时 溶液的pH约为6 此时丙氨酸为两性离子状态Ala 物质的表观解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得 小结 1 某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半 2 在氨基酸等电点以上任何pH AA带净的负电荷 在电场中向阳极移动 在氨基酸等电点以下任何pH AA带净的正电荷 在电场中向阴极移动 3 在一定pH范围中 溶液的pH离AA等电点愈远 AA带净电荷愈多 怎么办 怎么办 解 因Lys属于碱性氨基酸 所以 它的等电点为 pI pK2 pK3 2 8 59 10 53 2 9 56当pH为4 0时 pI大于pH 故是在酸性条件下 氨基酸本身带正电 在电场中向阴极移动 当pH为11 5时 pI小于pH 故是在碱性条件下 氨基酸本身带负电 在电场中向阳极移动 b 成肽反应 肽 peptide 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键 所形成的化合物称为肽 1 肽与肽键 由两个氨基酸组成的肽称为二肽 由多个氨基酸组成的肽则称为多肽 组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基 肽键 peptidebond 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用 组成肽键的原子处于同一平面 0 127nm键长 0 132nm0 148nm 肽键 肽键中的C N键具有部分双键性质 不能自由旋转 在大多数情况下 以反式结构存在 在多肽链中 氨基酸残基按一定的顺序排列 这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的 氨基 称为氨基端或N 端 在另一端含有一个游离的 羧基 称为羧基端或C 端 氨基酸的顺序是从N 端的氨基酸残基开始 以C 端氨基酸残基为终点的排列顺序 如上述五肽可表示为 Ser Val Tyr Asp Gln 肽链中AA的排列顺序和命名 四肽的结构 肽的重要理化性质 1 每种肽也有其晶体 晶体的熔点都很高 2 在pH0 14范围内 肽的酸碱性质主要来自游离末端 NH2和游离末端 COOH以及侧链上可解离的基团 3 每一种肽都有其相应的等电点 计算方法与AA一致且复杂 B2 B B B B2 K 1 K 2 K 3 K 4 pI pK 2 pK 3 2 4 原则 当溶液pH大于解离侧链的值 占优势的离子形式是该侧链的共轭碱 当溶液pH小于解离侧链的值 占优势的离子形式是该侧链的共轭酸 5 肽的化学反应 也能发生茚三酮反应 Sanger反应 DNS反应和Edman反应 还可发生双缩脲反应 肽的颜色反应 多肽可与多种化合物作用 产生不同的颜色反应 这些显色反应 可用于多肽的定性或定量鉴定 如黄色反应 是由硝酸与氨基酸的苯基 酪氨酸和苯丙氨酸 反应生成二硝基苯衍生物而显黄色 多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应 双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用 产生兰色的铜 双缩脲络合物 称为双缩脲反应 含有两个以上肽键的多肽 具有与双缩脲相似的结构特点 也能发生双缩脲反应 生成紫红色或蓝紫色络合物 这是多肽定量测定的重要反应 最简单的肽有两个氨基酸组成 称为二肽 含一个肽键 含三个氨基酸的为三肽 依次类推 含有多个氨基酸的一般称为多肽 又称为多肽链 肽和肽链的命名是根据参与其组成的氨基酸来确定的 规定从肽链的NH2末端氨基酸残基开始 称为某氨基酰某氨基酰 某氨基酸 HO肽链中的骨干是由 N C C 单位规则地重复排列而成 称之为共价主链 各种肽链的主链结构都是一样的 但侧链的R基的顺序即氨基酸残基的顺序不同 肽键可以看作是一种酰胺键 它和一般的酰胺键一样 由于酰胺氮上的孤电子对与相邻羰基之间的共振相互作用 表现出高稳定性 肽键的亚氨基 NH 在PH0 14的范围内 没有明显的解离和质子化的倾向 共振是在两种形式的肽键结构之间发生的 HR C N C C H O C C C N O H 在肽键中 肽键的键长是0 132纳米 而C N单键的键长是0 149纳米 C N双键的键长是0 127纳米 所以肽键的键长介于单键与双键之间 具有部分双键的性质 约为40 因为肽键具有双键的性质 所以肽键是一个平面 形成肽键的6个原子几乎在同一个平面内 肽键的平面性质在肽链折叠成三维构象时是很重要的 也由于双键的性质 肽键的旋转受到影响 在空间结构中一般是不能旋转的 肽键的物理化学性质 短肽的晶体是离子晶格 在水溶液中以偶极离子存在 在PH0 14范围内 肽键中的亚氨基不能解离 依次肽的酸碱性质主要确定于肽键中的游离末端的 NH2和 COOH以及侧链R基上的可解离功能团 在长肽或蛋白质中 可解离是基团主要是侧链上的 肽链中的游离氨基和羧基的间隔比一般氨基酸中的要大 因此它们之间的静电引力较弱 肽中的 COOH的PK值要比游离氨基酸中的大一些 而末端的 NH2的PK值要比氨基酸中的小一些 R基区别不大 小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似 随着电离基团的增加 滴定曲线变得复杂 以至很难用单个侧链基团的解离来分析 因为在同一PH范围内可以有几个侧链解离 但在给定的PH下 可根据Henderson Hasselbalch方程确定出占优势的电离态 我们只需应用这样一个规则 当溶液PH大于解离侧链的PK值 占优势的离子形式是该侧链的共轭碱 当溶液的PH小于解离侧链的PK值时 占优势的离子形式是它的共轭酸 即 PH PK HA A PH PK HA A 例如四肽甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸的解离情况 H3N C C N C C N C C N C COOH PK 3 7 HOHOHOH HHCH2HCH2HCH3 CH2CH2 COOHCH2 CH2 NH3 PK4 10 2 PK2 4 6 PK3 7 8 Gly Glu Lys Ala 结构中全为质子化的离子形式 溶液的PH 功能团解离 带电 状况 COOH侧连COOH NH2 NH2 占优势离子的净电荷 小于3 5 COOH COOH NH3 NH3 23 5 4 5 COO COOH NH3 NH3 14 5 7 8 COO COO NH3 NH307 8 10 2 COO COO NH3 NH3 1大于10 2 COO COO NH3 NH3 2 四肽甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸的酸碱性质所以此肽的等电点为 7 8 4 5 2 6 15 天然存在的活性肽 除了蛋白质部分水解可以产生长短不一的各种肽段之外 生物体内还有很多活性肽游离存在 如加压素 催产素 谷胱甘肽 脑啡肽 促肾上腺皮质激素 胆囊收缩素 胰高血糖素等激素 其中的谷胱甘肽是一种三肽 即 谷氨酰半胱胺酰甘氨酸 因为含有游离巯基 所以常用GSH来表示 还原型谷胱甘肽在红细胞中可作为巯基缓冲剂存在 维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态 另外 脑啡肽近几年来引起人们注意 它们在中枢神经系统中形成 是体内自己产生的一种类鸦片剂 有些抗生素也属于肽类或肽的衍生物 例如短杆菌肽S多粘菌素E和放线菌素D等 某些蕈产生的剧毒毒素也是肽类化合物 例如 鹅膏蕈碱 它是从鹅膏蕈属或称捕蝇蕈属的鬼笔鹅膏中分离出来的 是一个环状八肽 它与真核生物的RNA聚合酶 和 牢固结合而抑制酶的活性 因而使RNA的合成不能进行 但不影响原核生物的RNA合成 与真核生物的RNA聚合酶 和 牢固结合 H3N Tyr Gly Gly Phe Met COO H3N Tyr Gly Gly Phe Leu COO Met 脑啡肽Leu 脑啡肽 L Leu D Phe L Pro L Val L OrnL Orn L Val L Pro D Phe L Leu短杆菌肽S 环十肽 由细菌分泌的多肽 有时也都含有D 氨基酸和一些非蛋白氨基酸 如鸟氨酸 Ornithine 缩写为Orn CO NH CH CO NH CH2 COOH CH2 CH2 CHNH2 COOH CH2 SH 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热 氨基酸氧化脱羧产生酮酸 其酮酸脱羧生成醛 而茚三酮本身成为还原茚三酮 后者在与水合茚三酮和氨作用产生蓝紫色化合物 其反应过程如下 反应式见书p10 1 茚三酮 H2O 水合茚三酮加热1002 水合茚三酮 氨基酸 RCHO CO2 NH3 还原茚三酮pH5 03 水合茚三酮 NH3 还原茚三酮 3H2O 蓝紫色化合物 脯氨酸产生黄色物质作用 氨基酸的定性和定量 脯氨酸440nm 其它570nm波长 蓝紫色化合物 6 侧链基团的化学性质 1 巯基 SH 的性质 作用 这些反应可用于巯基的保护 6 侧链基团的化学性质 1 巯基 SH 的性质 作用 与金属离子的螯合性质可用于体内解毒 也是蛋白质结晶学中制备重原子衍生物最常用的方法 对羟汞苯甲酸 6 侧链基团的化学性质 1 巯基 SH 的性质 作用 氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或打开 胱氨酸 6 侧链基团的化学性质 1 巯基 SH 的性质 作用 可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量 二硫硝基苯甲酸 DTNB Ellman反应 硫硝基苯甲酸 在pH8 0时 412nm波长有强烈吸收 6 侧链基团的化学性质 2 羟基的性质 作用 可用于修饰蛋白质 二异丙基氟磷酸酯 6 侧链基团的化学性质 3 咪唑基的性质 组氨酸含有咪唑基 它的pK2值为6 0 在生理条件下具有缓冲作用 组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应 可以与ATP发生磷酰化反应 形成磷酸组氨酸 从而使酶活化 组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应 生成烷基咪唑衍生物 并引起酶活性的降低或丧失 作用 判断酶的活性中心 蛋白质的化学修饰 是指在较温和的条件下 以可控制的方式使蛋白质与某种试剂 称化学修饰剂 起特异反应 以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变 5 氨基酸的分析分离 为了测定蛋白质中氨基酸的含量 组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸 都需要对氨基酸混合物进行分析和分离工作 其方法较多 而目前使用较多的是层析法 1 分配层析的一般原理 所有的层析系统都有两个相组成 一个为固定相或静相 stationaryphase 一个为流动相或动相 mobilephase 混合物在两相中的分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况 一般用分配系数 partitionordistributioncoefficient 来描述 当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配时 在一定温度下达到平衡后 溶质在两相中的浓度比值为一常数 即分配系数 Kd 用下式表示 CA 表示某一物质在动相中的浓度Kd CB 表示某一物质在静相中的浓度物质分配不仅可以在互不相溶的两种溶剂即液相 液相系统中进行 也可在固相 液相或气相 液相间发生 其系统中的静相可以是固相 液相或固 液混合相 半液体相 动相可以是液相或气相 它充满于静相的空隙中 并能流过静相 在实际层析时 其层析行为一般并不直接决定于它的分配系数 而是取决于有效分配系数Keffo 某一物质在A相中的总量Keffo 某一物质在B相中的总量 对液相 液相层析系统来说 CA VAKeffo Kd RVCB VB这里 CA和CB的意义同前 VA和VB分别为A相B相的体积 RV为A B两相的体积比 由此可见 Keffo是RV的函数 溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变 利用层析法分离混合氨基酸 其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异 哪怕是很小的差异 一般差异越大 越容易分开 若是逆流分溶或逆流分配 当转移n次后 某一物质在 n 1 个管中分布的分数含量是 p q n 1展开式的相应项的值 这里p和q分别为某一物质在静相和动相中的分数含量 即p q 1 例如物质Y的Kd q 动相 静相 p 1即 p q 1 2 1 2 1转移n次后 在第k号管中某一物质的含量可由下式计算 n pn k 1 qk 1Tn k n k 1 k 1 怎么办 例题 当某一物质在一个层析系统中的分配系数为3时 物质被转移4次后在第四管中的含量是多少 解 根据分配系数公式可知 p q 1 4 3 4 1 即在静相中的分数含量为1 4 在动相中的分数含量3 4 则可由上述公式计算如下 4 1 4 3 4 3T4 4 27 643 假若该物质的总量为96 则该管中的含量应为 27 64 96 40 5 64 6 18 1 3 12 36 4 12 16 48 64 8 16 16 16 16 32 32 9 27 16 8 8 8 16 逆流分溶原理 分配系数为1 分配系数为3 上相为动相 A 下相为静相 B 246810121416管号 302010 Kd 1 Kd 3 管中物质的总量 分溶曲线 结论 分配系数大的物质沿一系列分溶管的移动速度快与分配系数小的物质 n 600 n 100 n 10 相对浓度 溶剂系统体积 分溶曲线与转移次数 理论板数 的依赖关系 2 分配柱层析层析柱中的填充剂或支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质 如纤维素 淀粉 硅胶等 支持剂表面附着一层不会流动的结合水作为固定相 沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂 如苯酚 正丁醇等 是流动相 由填充剂构成的柱床可以设想为由无数的连续的板层组成 每一板层起着微观的 分溶管 作用 当用洗脱剂洗脱时 在柱上端的氨基酸混合物在两相之间按不同的分配系数进行连续不断的进行分配移动 分部收集层析柱下端的洗脱液 然后分别用茚三酮显色定量 以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线 曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸 加洗脱剂 氨基酸样品 支持剂 层析柱 分部收集 1 00 50 1 光吸收值 20406080100120 流出液 毫升 3 滤纸层析滤纸层析也是分配层析的一种 这里的滤纸纤维素吸附水作为固定相 展层用的溶剂是流动相 层析时 混合氨基酸在这两相中不断分配 使它们分布在滤纸的不同位置上 层析时 将样品点在滤纸的一个角上 称为原点 然后将其放入一个密闭的容器中 用一种溶剂系统进行展层 层析后烘干滤纸 再将其旋转90度采用第二种溶剂系统进行第二相展层 由于各种氨基酸在两个不同的溶剂系统中具有不同的迁移率 Rf 因此它们就会彼此分开 当用茚三酮显色时 就会在滤纸上面出现各种氨基酸的斑点 当然 若氨基酸种类较少或一相就能分开 进行一相层析即可 溶剂前沿 氨基酸显色点 滤纸 原点 X Y 滤纸层析中的Rf值 Rf X Y 丁醇 醋酸 酚 甲酚 水 氨基酸的双向滤纸层析图谱 4 薄层层析 thin layerchromatography 该层析分