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第六章微生物菌种的分离筛选 第一节菌种分离的总体设计第二节分离样本的采样第三节含微生物样品的富集培养第四节微生物的培养分离 第一节菌种的分离简介 一 菌种的来源根据资料直接向有科研单位 高等院校 工厂或菌种保藏部门索取或购买 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 二 分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求 菌种的特性 采用各种筛选方法 快速 准确地把所需要的菌种挑选出来 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌 也必须重新进行分离纯化 有了优良的菌种 还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合 定方案 首先要查阅资料 了解所需菌种的生长培养特性 采样 有针对性地采集样品 增殖 人为地通过控制养分或培养条件 使所需菌种增殖培养后 在数量上占优势 分离 利用分离技术得到纯种 发酵性能测定 进行生产性能测定 这些特性包括形态 培养特征 营养要求 生理生化特性 发酵周期 产品品种和产量 耐受最高温度 生长和发酵最适温度 最适pH值 提取工艺等 三 新种分离与筛选的步骤 菌种筛选主要步骤 调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案 确定采集样品的生态环境采样 确定特定的增殖条件增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法平板分离 原种斜面 确定发酵培养基础条件筛选 初筛 1株1瓶 复筛 1株3 5瓶 结合初步工艺条件摸索再复筛 1株3 5瓶 3 5株 单株纯种分离 生产性能试验 毒性试验菌种鉴定 第二节分离样本的采样 1 采样对象以采集土壤为主 一般园田土和耕作过的沼泽土中 以细菌和放线菌为主 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中 酵母和霉菌较多 如一些野果生长区和果园内 采样的对象也可以是植物 腐败物品 某些水域等 从自然界筛选 2 采样季节 以温度适中 雨量不多的秋初为好 3 采土方式 在选好适当地点后 用小铲子除去表土 取离地面5 15cm处的土约10g 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中 扎好 标记 记录采样时间 地点 环境条件等 以备查考 为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化 宜将样品逐步分批寄回 以便及时分离 二根据微生物生理特点采样1 根据微生物营养类型2 根据微生物生理特性 三特殊环境下采样 第三节含微生物样品的富集培养 为了容易分离到所需的菌种 让无关的微生物至少是在数量上不要增加 可以通过配制选择性培养基 选择一定的培养条件来控制 一 控制培养基的成分例如碳源利用的控制 可选定糖 淀粉 纤维素 或者石油等 以其中的一种为唯一碳源 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长 而其它微生物就可能死亡或淘汰 这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多 二 控制培养条件pH值的控制细菌 放线菌 pH7 0 7 5酵母菌 真菌 pH6 5 7 0温度的控制通气量的控制 三抑制不需要的菌类如使用不同类型的抗生素 高温 高压等条件 抑制不需要的菌类 第四节微生物的培养分离 尽管通过增殖培养效果显著 但还是处于微生物的混杂生长状态 因此还必须分离 纯化 在这 步 增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用 而且控制得细一点 好一点 纯种分离的方法有划线分离法 稀释分离法 1 稀释平皿分离法 1 稀释平皿分离法 100ml 1g 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 1 100 1 1000 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 稀释 1 稀释平皿分离法 b 涂布平皿分离法 a 倾注平皿分离法 2 平皿划线分离法a 连续划线分离法b 分区划线分离法 四 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验 以求得适合于工业生产用菌种 五 毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的 将其作为生产菌种应当十分当心 尤其与食品工业有关的菌种 更应慎重 据有的国家规定 微生物中除啤酒酵母 脆壁酵母 黑曲霉 米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外 其他微生物作为食用 均需通过两年以上的毒性试验 培养分离 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤 到目前为止 还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株 在工业微生物筛选过程中 应及时调整检测方法 以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应 因此 建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的 一 成功的分离培养方法 1 认真考察所需产品的特征和生产过程 2 制订初步的筛选标准 3 将生态学方法运用到分离和筛选过程 三 将生态学方法用于培养分离的一般思路要点 1 罗列出所要分离的微生物类群 2 根据所采集样本的各种生态参数 描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地 3 将若干样本分成若干类型 如植物和植物各部 土壤 类型和土层 岩石 水 昆虫和发酵食品等 4 罗列出所要考察和测量的环境参数 如pH 盐分 水分 氧化还原电势及温度等 5 列出生物系统中有用的自然底物 如森林土壤中的几丁质 葡萄表皮的果胶 6 根据上述1 5项中所获得的数据 设计分离方法 即选择适宜的稀释液 底物 试样 天然浸出汁和培养条件 7 用标准方法作对照来评价生态学分离方法 8 根据待检材料的生态参数需要 修改已知的方法 9 运用特定的富集方法 富集那些可能具有筛选意义的微生物类群 四 自然界中细菌的分离 一 采样和采集方法 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群 特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时 必须十分重视样本的采集 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲 土样采集器 镊子 解剖刀 手套 无菌小塑料袋和塑料瓶等 采样的注意事项 1 采样时应尽可能保持相对无菌 2 所采集的样本必须具有某种代表性 3 采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期 地点以及采集地点的地理 生态参数等 4 应充分考虑采样的季节性和时间因素 因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的 5 采好的样应及时处理 暂不能处理的也应贮存于4 下 但贮存时间不宜过长 这是因为一旦采样结束 试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境 其内部生态环境就会发生变化 微生物群体之间就会出现消长 二 生态学参数及培养基的组成原则 1 加入培养基中的天然提取物种类和用量 环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类 2 就分离培养基的组成而言 部分培养基中必须含有10 50 的天然提取物 加入培养基中的天然提取物 部分培养基中则应含有多种碳 氮源 如几丁质 纤维素或果胶 3 所有分离培养基中都应含有抗真菌剂 如放线菌酮和制霉素 掺加浓度一般为50 g m1 以抑制真菌的生长 4 琼脂平板在使用前应置于37 培养箱中孵育l 2天 5 培养基的生物物理学参数 如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近 二 分离 目的微生物不纯 需分离纯化 采用简便迅速 有一定准确性的检出方法 提高筛选效率 常用平皿反应法 纸片培养显色法 浸有指示剂滤纸 透明圈法 混浊底物被分解后形成透明圈 如可溶性淀粉 碳酸钙等 变色圈法 直接用显色剂或指示剂 生长圈法 利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌 要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长 形成生长圈 抑制圈法 琼脂块培养法 用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物 抗生素筛选 检定菌培养 加上发酵液 五 放线菌的分离培养基的组成原则 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的 除嗜温性放线菌外 其他放线菌一般在培养4 20天内在分离平板上缓慢形成菌落 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮 以抑制真菌的繁殖 选择性地添加抗生素 分离琼脂平板制备好后 一般皆应在37 培养箱中存放3天 放线菌的分离 土样中放线菌的非选择性分离 土样风干 磨碎 无菌海绵压印土样后压印平板后培养 植物体上放线菌的分离 无菌取植物组织 干燥以减少细菌数量 剪碎植物材料后植入平板表层后培养 也可洗下微生物后振荡培养 水中放线菌的分离 为使所要分离的放线菌的数量种类增多 一般将水样离心或滤纸过滤 取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布 次代培养及纯化 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异 作初步的鉴定和区分 通过高倍放大进行镜检 可了解气生和营养孢子形成情况 成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基 而肉眼识别不同的生长形态 从而初步地加以鉴定 在分离放线菌时显得尤为重要 将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取 点接到琼脂平板上进行影印培养 以进一步筛选和分离 放线菌菌落形态 六 真菌分离 1 利用低碳 氮比的培养基可使真菌生长菌落分散 利于计数 分离和鉴定 这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢 并由此限制真菌的迁徙生长 2 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离 3 有时 真菌子实体形成必须有光线 这在分离培养时应加以考虑 4 选择性富集 是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术 富集可以是种水平的 如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌 也可以是组成群水平的 如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物 5 在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成 真菌的分离方法 土中真菌的分离 稀释法 混入法 压贴法 粘附法 浮选法 注射器采集法 土过筛法 庶糖密度梯度离心法 植物材料中真菌的分离 植入法 压贴法 洗涤法 浸泡法 水中真菌的分离 水样稀释后涂布分离 饵诱技术常用于水中真菌的富集 子实体直接分离培养担子菌 新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养 微生物菌种分离实例 分解纤维素的微生物的分离实验目的从土壤中分离能分解纤维素的微生物 纯化得到1 5株菌 并通过此次实验 培养以下三方面的能力 1 基本技术训练 在目前专业课程学习基础上进一步练习培养基的配制 干湿热灭菌 以及微生物分离纯化技术 2 初步的科研训练 练习科研过程中查阅资料 设计实验方案 动手实施方案 综合安排实验 解决临时实际困难等方面的基本能力 认识科研程序 感受科研乐趣和困难 3 培养实事求是的工作作风 科学严谨的工作态度 实验原理纤维素与纤维素酶纤维素酶是一种复合酶 一般认为至少包含三部分 C1 Cx 和葡萄糖苷酶组成 前两种使纤维素分解成纤维二糖 第三种将纤维二糖分解成葡萄糖 正是在这三种酶的协同作用下 纤维素最终被分解成葡萄糖 为微生物的生长提供营养 纤维素分解菌的筛选纤维素 刚果红混合培养基 刚果红染色法常用的刚果红染色法有两种 一是先培养微生物 再加入刚果红进行颜色反应 二是倒平板时就加刚果红 方法一是传统的方法 缺点是操作繁琐 加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂 其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 方法二的优点是操作简便 不存在菌落混杂问题 缺点是由于实验材料和琼脂都含有淀粉类物质 可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应 但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊 无明显影响 方法二的另一缺点是 有些微生物具有降解色素的能力 它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈 与纤维素分解菌不易区分 短时间培养也无大碍 1 实验材料及方法1 1样品 从校园找到的竹子下的土壤 松树下的土壤 混合土 熊猫粪 牛粪 1 2实验所用的器材 培养皿 250mL锥形瓶 无菌称量瓶 滤纸 药匙 1mL和10mL的移液管 电子秤 无菌培养皿 涂布器 解剖镜 显微镜 接种针 温箱等 1 3实验用培养基配方及配制注意事项1 3 1 选择培养基 纤维素分解细菌 赫奇逊培养基 CMC KH2PO41 0g MgSO4 7H2O0 3g NaCl0 1g FeCl30 01g NaNO32 5g 水1000mL pH7 2 7 4 琼脂20g 刚果红 纤维素分解放线菌培养基 CMC KNO31 00g KH2PO40 50g MgSO4 7H2O0 50g NaCl0 50g 10 FeSO42滴 H2O1000mL pH7 2 7 4 琼脂20g 刚果红 纤维素分解真菌培养基 CMC 马铃薯200gKH2PO43 00g MgSO4 7H2O1 50g 蛋白胨0 50g VB12丸 琼脂20 00g H2O1000mL pH6 0 6 5 琼脂20g 纤维素分解菌 混合 的选择培养基 纤维素粉5g NaNO31g Na2HPO31 2g KH2PO30 9g MgSO40 5g KCl0 5g 酵母膏0 5g 水解酪素0 5g 以上物质溶解后蒸馏水定容到1000ml1 3 2 鉴别及纯化培养基 半固体 鉴别培养基的成分 NH4 2SO42g MgSO40 5g K2HPO41g NaCl0 5g 刚果红0 4g 水1000mL 琼脂5g 自然pH值 刚果红 滤纸片 去淀粉 注 需无菌操作 配制时先配含无机盐的半固体培养基 灭菌倒平板后 平铺入用刚果红染色的无菌去淀粉滤纸片 1 4实验方法与步骤 取样 菌悬液的制备 将菌悬液涂布到有选择与鉴定作用的培养基 含刚果红 上 挑选单菌落纯培养 对纯培养物制片镜检 有条件的话查出菌的种属类别 将纯培养接种到无菌试管内保藏 1 4 1土样采集土样的采集选择富含纤维素的环境 这是因为在纤维素含量丰富的环境 通