中性耐温植酸酶对青鱼生长_养分表观消化率及血清生化指标的影响.doc

中 性 耐 温 植 酸 酶 对 青 鱼 生 长 、养 分 表 观 消 化 率 及血 清 生 化 指 标 的 影 响植酸酶是近几年来发展很迅速的饲用酶制剂之一，市场上常见植酸酶一般在酸性环境下能发挥较大酶活性，可在畜禽等酸性环境的消化道内发挥较好作用，因而在畜禽饲料生产中已为人们接受。常规淡水鱼饲料主要由菜粕、棉粕、麦类等植物原料构成，植酸含量较高，一般占配方 0.4%以上。据研究，植酸含量与水产动物采食量、生长速度呈负相关（Vegard Denstadli等，2006），而水产动物不能分泌降解植酸的植酸酶，对植酸中的磷利用率较低，磷随排泄物进入水中，造成水体富营养化（Correll，1999），最终影响养殖效益。饲料中添加植酸酶是提高水产动物对磷的利用率和生产性能、降低磷污染的有效途径。据报道，中性植酸酶发挥作用的适合 pH 值在 7.0 左右（Kim 等，1998；Tye 等，2002），适合在消化道环境为中性的无胃鱼中发挥作用。近年来，国内中性植酸酶在鱼中的应用效果也已经得到证实（曾虹等，2002；罗琳等，2007）。从缓解饲料资源短缺、提高水产养殖业经济效益和利于环保等功效来看，中性植酸酶在水产料中具有重要的价值和良好的应用前景。本试验旨在研究中性耐温植酸酶对青鱼生长、血液生化指标及养分消化率的影响，为中性植酸酶在无胃鱼中的应用提供参考。1 材料与方法1.1 试验鱼和试验酶试验青鱼购自武汉东西湖渔场，初始体重 27.3 g左右。正式试验前在动物营养与饲料科学湖北省重点实验室（武汉工业学院动物科学与营养工程学院）暂养池（2 m1.5 m1.5 m）饲养驯化 1 周。中性耐温植酸酶由武汉新华扬生物股份有限公司提供，活性 2 500 HYU/g（酶活性单位定义：在温度30 、pH 值 6.00 条件下，每分钟从浓度为 5.0 mmol/l植酸钠溶液中释放 1 mmol 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以 HYU 表示。）1.2 试验分组及日粮处理选择体质健康、大小基本一致的试验鱼，经药物浸洗后随机分为 5 组，每组设 3 个重复，每个重复 15尾鱼，随机放入已经消毒的室内圆形水族箱（直径80.0 cm，高 60.0 cm）中饲养。采用牧羊颗粒饲料机-180（DDC 调质器）生产2 mm 粒径的试验日粮，调质温度控制（852）。试验分组及日粮配方分别见表 1、表 2。饲料工业2010 年第 31 卷第 8 期项目对照组试验组试验组试验组试验组处理基础日粮试验配方 1试验配方 2试验配方 3试验配方 4描述对照组配方对照组配方降低 0.75% Ca(H2PO4)2，同时添加植酸酶 500 HYU/kg 饲料对照组配方添加植酸酶 500 HYU/kg 饲料对照组配方降低 0.75% Ca(H2PO4)2，同时添加植酸酶 1 000 HYU/kg 饲料对照组配方添加植酸酶 1 000 HYU/kg 饲料表 1 试验分组及日粮处理1.3 饲养管理试验于 2008 年 9 月 9 日至 11 月 25 日在动物营养与饲料科学湖北省重点实验室进行，试验期 77 d，采用循环水养鱼，24 h 充气增氧，每天投喂 2 次，时间分别为 9:00 和 16:00，投喂率为鱼体重的 2%3%。保持水中溶解氧大于 6 mg/l，NH3-N 小于 0.2 mg/l，试验期间保持水温为 2530 ，pH 值为 7.07.5，光照周期为 12 h光照和 12 h 黑暗（8:0020:00）。1.4 试验指标1.4.1 生长性能试验结束前 1 d 停食以重复为单位对试验鱼称重，计算增重率和饵料系数。酶 制 剂12增重率（%）=(试验末鱼均重-试验初鱼均重)/试验初鱼均重100；饵料系数（F/G）=摄取的饲料总重量/(试验末鱼总体重-试验初鱼总体重)。1.4.2 养分表观消化率采用虹吸管收集鱼粪便，具体方法如下：饲喂含0.1%Cr2O3饲料 7 d 后，每天喂料后 2 h 用虹吸管收集粪便，再挑选外表带有包膜的完整条状粪便于 65 烘箱中烘干备用。采用二苯碳酰二肼丙酮法测定 Cr2O3含量，常规方法 水分测定采用冷冻干燥机干燥测定法、粗蛋白采用凯氏定氮法（GB643286）、粗脂肪采用索氏抽提法（GB643386）、粗灰分采用高温灼烧法（GB643886）、钙的测定采用 EDTA 法、磷的测定采用磷矾钼酸比色法 检测饲料及粪便干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙和磷含量，计算饲料干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙和磷的表观消化率。干物质表观消化率（%）=（1-饲料 Cr2O3含量/粪便Cr2O3含量）100；某养分表观消化率（%）= （1-饲料 Cr2O3含量粪便 Cr2O3含量粪便某养分含量饲料某养分含量）100。1.4.3 血液生化指标血液送武汉市第七医院检测血清碱性磷酸酶（AKP）、血钙及血磷含量。1.5 数据分析结果用平均数标准差表示。数据采用 SPSS16.0软件进行 ONE-WAY ANOVA 分析，并以 LSD 作多重比较，以 P0.05 作为差异显著性判断标准。2 结果与分析2.1 中性耐温植酸酶对青鱼生长的影响（见表 3）表 3 中性耐温植酸酶对青鱼生长的影响项目对照组试验组试验组试验组试验组初均重(g)27.361.0427.351.2527.313.0627.362.3127.351.90末均重(g)57.636.2358.378.6563.337.8060.669.5367.638.35增重率(%)110.498.79a113.426.27a131.935.57b121.717.28ab147.369.48b饵料系数2.010.132.050.251.850.322.030.391.790.17注：同列数据肩标小写字母不同者表差异显著（P0.05），下表同。从表 3 可以看出，配方中直接添加植酸酶（试验组、试验组）增重率相对对照组显著提高 19.4%和 33.4%（P0.05）；植酸酶替代配方 0.75%的磷酸二氢钙（试验、组）增重率与对照组相比分别提高了 2.7%和 10.2%（P0.05）；饵料系数方面，直接添加植酸酶的组饵料系数有所降低（P0.05），试验、组饵料系数有所增加，但各处理组差异不显著（P0.05）。2.2 中性耐温植酸酶对青鱼饲料表观消化率的影响（见表 4）从表 4 可见，日粮中使用植酸酶均提高了青鱼对干物质的消化率，其中试验、和组相对对照组差原料次粉(%)大豆粕(%)菜籽粕(%)棉仁粕(%)进口鱼粉(%)豆油(%)盐(%)Ca(H2PO4)2(%)氯化胆碱(%)鱼用多维(%)鱼用多矿(%)Cr2O3(%)抗氧化剂(%)植酸酶(HYU/kg)营养水平（%）粗蛋白粗脂肪水分粗灰分钙磷对照组23.8637.8215.0012.006.002.000.301.500.300.300.800.100.02034.072.4110.028.211.300.81试验组24.5137.8215.0012.006.002.000.300.750.300.300.800.100.0250034.112.4010.058.150.910.61试验组23.7637.8215.0012.006.002.000.301.500.300.300.800.100.0250034.092.4210.048.201.310.82试验组24.4137.8215.0012.006.002.000.300.750.300.300.800.100.021 00035.112.4510.068.160.910.60试验组23.6637.8215.0012.006.002.000.301.500.300.300.800.100.021 00034.092.4110.048.231.310.82表 2 试验日粮配方及营养水平舒秋艳等：中性耐温植酸酶对青鱼生长、养分表观消化率及血清生化指标的影响酶 制 剂13异显著（P0.05）；植酸酶替代配方 0.75%的磷酸二氢钙（试验和组），青鱼对磷的表观消化率显著提高了 9.3%和 9.4%（P0.05）。2.3 中性耐温植酸酶对青鱼血清生化指标的影响（见表5）表 5 中性耐温植酸酶对青鱼血清生化指标的影响项目对照组试验组试验组试验组试验组碱性磷酸酶（U/l）160.5513.90a155.224.35ab144.1119.45ab160.518.72a135.897.56b血钙(mmol/l)3.040.293.090.713.050.353.030.133.290.16血磷(mmol/l)3.010.462.910.433.110.123.020.413.140.44由表 5 可知，相对对照组，植酸酶替代配方 0.75%的磷酸二氢钙（试验和组）青鱼血清 AKP 有所下降，差异不显著（P0.05），直接添加植酸酶（试验和组）也降低了青鱼血清 AKP 含量（P0.05），试验组AKP 含量显著低于试验组和对照组（P0.05）。直接添加植酸酶有提高青鱼血磷含量的趋势，但差异不显著（P0.05），植酸酶替代配方 0.75%的磷酸二氢钙也没有显著影响青鱼血磷含量（P0.05）。3 讨论3.1 中性耐温植酸酶对青鱼生长的影响磷是水产动物生长必需营养素，中性植酸酶可水解鱼配方原料中植酸释放磷从而有助促进鱼的生长（罗琳等，2007）。Schafer 等(1995)在以大豆粉、鱼粉和大麦为基础的饲料中添加 500 和 1 000 FIU/kg 植酸酶饲喂鲤鱼，结果鱼体增重加快。罗琳等（2007）研究中性植酸酶在花鲈豆粕型饲料中替代磷酸二氢钙使用时发现，经 8 周的养殖试验后，在饲料中用 1 000 或1 500 FTU/kg 的中性植酸酶替代不同比例（60%、80%和 100%）的磷酸二氢钙后对花鲈的末均重、特殊生长率、饲料系数、蛋白质效率以及成活率均没有显著影响(P0.05)。曾虹等(2002)报道，在饼粕含量为 65%的鲤鱼料中，添加 1 000 U/kg 的中性植酸酶可以替代部分磷酸二氢钙而不影响体增重，并得出结论：饲料中添加中性植酸酶对鲤鱼日增重的影响与添加 0.85%1.28%的磷酸二氢钙相当，即添加中性植酸酶可替代 0.17%0.27%的有效磷。高春生等(2006)研究表明，饲料中添加植酸酶可提高草鱼的平均日增重、平均日采食量，降低饵料系数和病死率。Soares(1994)在鲈鱼饲料中添加 2 400 U/kg 植酸酶发现鱼的生长与添加 1.3的磷酸二氢钙的鱼生长相同。本试验研究发现，饲粮中植酸酶替代配方 0.75%的 Ca(H2PO4)2使用没有影响青鱼生长性能，与他人报道类似（杨林等，2000；罗琳等，2007）；饲料中直接添加中性植酸酶提高了青鱼生长性能，表明配方有效磷水平可能未满足青鱼生长需求，植酸酶释放出原料植酸中的磷有助于青鱼发挥生长潜能。3.2 中性耐温植酸酶对青鱼饲料表观消化率的影响植酸酶可提高水产动物对常规养分的表观消化率（Cheng 等，2002），主要原因是植酸对内源胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性有抑制作用（白东清等，2004），会降低蛋白质、淀粉、脂肪这些营养物质的消化吸收（Bitar K 等，1972），而植酸酶的添加可以解除植酸与内源酶等的结合，提高内源酶的活性，从而提高养分消化率（杨林等，2000）。本试验发现，使用植酸酶后，青鱼对粗蛋白、粗脂肪、粗灰分及钙表观消化率有提高的趋势，但试验各处理未表现出明显差异（P0.05），可能原因是植酸酶的作用效果与底物-植酸的含量、鱼的大小及消化道发育程度有关（Baruah 等，2004）。植酸酶可提高鱼类对磷的利用率。Schafer 等（1995）研究发现，鲤鱼豆粕型日粮中添加植酸酶 500或 1 000 U/kg 可释放 20%和 40%的植酸磷；余丰年等（2000）研究发现，异育银鲫饲料中添加 500 U/kg 的植酸酶可分解 60%的植酸磷，添加 1 000 U/kg 的植酸酶表 4 中性耐温植酸酶对青鱼养分表观消化率的影响（%）项目对照组试验组试验组试验组试验组干物质66.452.34a70.243.01ab75.034.22b72.590.89b76.942.61b粗蛋白87.902.7188.803.3789.083.3989.110.4787.930.67粗脂肪82.982.6182.444.6782.595.4483.984.6282.570.92粗灰分62.533.6065.395.0164.896.2565.436.2164.496.51钙44.243.2547.135.6347.874.6350.143.9448.590.91磷63.232.69a69.094.54b66.213.55ab69.154.71b65.452.67ab舒秋艳等：中性耐温植酸酶对青鱼生长、养分表观消化率及血清生化指标的影响酶 制 剂14可分解 80%的植酸磷。Riche 等(1996)发现，1 000 IU/kg的植酸酶可提高虹蹲对豆粕中磷的表观利用率，并且在很大程度上减少了磷的排泄量。周萌等（2004）研究表明，饲料中添加 1 000 IU/kg 植酸酶能有效改善南美白对虾的磷利用率。罗琳等（2007）研究表明，在饲料中用中性植酸酶替代磷酸二氢钙能显著提高花鲈对饲料中磷的利用，并推荐用中性植酸酶 1 000 U/kg 饲料替代 80%左右的磷酸二氢钙。Furuya 等（2001）、杨雨虹等（2006）在罗非鱼和鲤鱼中也分别发现日粮中添加植酸酶能提高磷的利用率 2555。本试验发现，植酸酶替换配方 0.75%的磷酸二氢钙后，青鱼对磷的表观消化率显著提高了 9.3%和 9.4%，差异显著（P0.05），表明试验处理并未改变青鱼对 Ca 和 P 的吸收利用。碱性磷酸酶（AKP）是广泛存在于动物血液和各种器官内（骨骼肌、肝脏、肠粘膜）的一种糖蛋白，在成骨过程中水解磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸，其浓度反映了成骨细胞的代谢活性，即当血磷浓度降低(缺磷)时，成骨细胞活动增强，合成大量碱性磷酸酶释放入血。陈新宇等（2005）研究在对虾中应用植酸酶时发现，添加植酸酶有降低对虾血清碱性磷酸酶活性、提高血清磷浓度的趋势，同时对血清钙浓度影响不大。郑涛等（2006）研究无鱼粉饲料中添加磷和植酸酶对奥尼罗非鱼生长性能及体成分的影响时发现，添加植酸酶显著降低了罗非鱼血清碱性磷酸酶活性（P0.05）。Shuenn-Der Yang 等（2005）研究日粮磷水平对澳洲银鲈生长的影响时也发现，当日粮磷缺乏时，银鲈血清碱性磷酸酶含量会升高。本试验发现，相对对照组，植酸酶替代配方 0.75%的磷酸二氢钙（试验组和试验组）青鱼血清 AKP 有所下降，但差异不显著（P0.05），同时也没有显著影响青鱼血磷含量（P0.05），表明青鱼并未因植酸酶替代配方磷酸二氢钙而表现出缺磷，植酸酶释放出原料中的磷弥补了减少的磷酸二氢钙的磷的下降；直接添加植酸酶也降低了青鱼血清AKP 含量（P0.05），可能原因是植酸酶没有影响血磷含量（P0.05），成骨细胞代谢活性没有变化导致 AKP不变，这些结论与陈新宇等（2005）研究结论类似。4 结论饲料中直接添加中性耐温植酸酶5001000HYU/kg可有效促进青鱼的生长，提高青鱼对常规养分的表观消化率（P0.05）；饲料中磷酸二氢钙的用量降低 0.75%同时使用中性耐温植酸酶青鱼生长不受影响，同时磷的表观消化率显著提高（P0.05）。参考文献1 Bitar K, Reinhold J G. Phytase and alkaline phosphatase activities inintestinal mucosae of rat, chicken, calf, and manJ. Biochim BiophysActa, 2006,253(3):592-601.2 Cheng Z JHardy RWApparent digestibility coefficients and nutritional value of cottonseed meal for rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)J . Aquaculture, 2002,212:361-372.3 David L, Correll. The Role of Phosphorus in the Eutrophication ofReceiving Waters: A ReviewJ. J. Environ. Qual., 1998, 27:261-266.4 DENSTADLI Vegard, SKREDE Anders, KROGDAHL Ashild,et al.Feed intake, growth, feed conversion, digestibility, enzyme activitiesand intestinal structure in Atlantic salmon (Salmo salar L.) fed graded levels of phytic acidJ. Aquaculture, 2006, 256, 365-376.5 Furuya W M, G. S. Goncalves , V. R. B. Furuya , et al. Phytase asfeeding for Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Performance and digestibilityJ. Revista Brasileira de Zootecnia, 2001,30:924-929.6 Johanne Dalsgaard, Kim Sch覬n Ekmann, Per Bovbjerg Pedersen etal. Effect of supplemented fungal phytase on performance and phosphorus availability by phosphorus -depleted juvenile rainbow trout(Oncorhynchus mykiss), and on the magnitude and composition ofphosphorus waste outputJ. Aquaculture, 2009(286):105-112.7 K. Powers Hughes, Soares J r. Efficacy of phytase on phosphorus utilization in practical diets fed to striped bass Morone saxatilis J.Aquaculture Nutrition，1994:133-140.8 Relicardo M. Coloso, Kim King, John W. Fletcher, et al Hendrix,Mark Subramanyam, Peddrick Weis and Ronaldo P. Ferraris. Phosphorus utilization in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed practical diets and its consequences on effluent phosphorus levels J.Aquaculture, 2003,220:801-820.9 Schafer A, W. M. Koppe, K. H. Meyer-Burgdorff, et al. Effects of amicrobial phytase on the utilization of native phosphorus by carp ina diet based on soybean meal J. Water Science and Technology,1995,31:149-155.10 Shuenn-Der Yang, Tain-Sheng Lin, Fu-Guang Liu, et al. Influenceof dietary phosphorus levels on growth, metabolic response andbody composition of juvenile silver perch (Bidyanus bidyanus)J.Aquaculture, 2006:592-601.11 Tye A J, Siu F K, Leung T Y C, et al. Molecular cloning and thebiochemical characterization of two novel phytases from B. subtilis168 and B.licheniformis J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 59:190-197.舒秋艳等：中性耐温植酸酶对青鱼生长、养分表观消化率及血清生化指标的影响酶 制 剂15酸性 -甘露聚糖酶作为一种新型酶制剂，近年来的研究日益受到重视，已在饲料、食品、医药、造纸、纺织、石油开采等领域得到了广泛的应用1-3。-甘露聚糖酶(-1,4-D-mannan mannohy-drolase,EC 3.2.1.78)是一类能水解含 -1,4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖 (包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纤维素酶，具有一般非淀粉多糖（NSP）酶类的作用降解 NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外，还可以促进类胰岛素生长因子（IGF-I）的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的 甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆饼的能量消化率4。酸性 -甘露聚糖酶可用作油井压裂液的优质生物破胶剂,效率高,成本低,适用范围广,对地层伤害小，是天然多糖结构分析和植物细胞破壁的良好工具酶。-甘露聚糖酶广泛存在于动植物和微生物中，其中微生物来源的 -甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及比动植物来源有更宽的作用 pH 值、温度范围等特点。本文初步研究了对黑曲霉进行发酵生产的酸性 -甘露聚糖酶的酶学特性及分解实验，研究结果表明，这种酸性 -甘露聚糖酶的温度适用范围广，在饲料行业有很好的发展空间，并且能够耐受极低的 pH 值环境，能够使其避免胃酸的破坏在最佳的环境即小肠中发挥作用。本文重点研究了酸性 -甘露聚糖酶在饲料行业及石油开采方面的应用实验，为酸性 -甘露聚糖酶在这些领域中的应用提供指导。1 材料与方法1.1 材料样品 A：肇东市日成酶制剂有限公司生产的酸性-甘露聚糖酶；样品 B、样品 C：国内某公司生产的 -甘露聚糖酶。1.2 酶活力测定方法12 Young-ok Kim, Hyung-Kwoun Kim, Kyung-Sook Bae, et al. Purification and properties of a thermostable phyta