2014细胞工程复习.doc

细胞工程任课老师：金裕华Email：教材及参考书一、教材杨淑慎.细胞工程.科学出版社，2009.二、参考书目（1）周维燕. 植物细胞工程原理与技术. 中国农业大学出版社， 2001.（2）谢从华，柳俊植物细胞工程高等教育出版社，2004.（3）第1章 绪论1.1 细胞工程的定义和基本内容 细胞工程是应用细胞生物学和分子生物的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。 核心技术：细胞、组织培养与繁殖,细胞融合等 目的：获得新性状、新个体、新物质学科交叉：研究范围：根据研究水平：根据研究对象：1.2 细胞工程的基本技术和内容 器官、组织和细胞培养 原生质体培养 染色体工程 动物胚胎工程 胚胎干细胞 植物胚胎培养 转基因生物与生物反应器1. 器官、组织和细胞培养 是指对生物体的器官、组织或细胞进行离体培养，研究所需培养系统和条件，研究器官、组织和细胞的形态发生规律，或使之形成组织或有机体的技术。2.原生质体培养 原生质体培养是将植物细胞去壁使之游离成原生质体，有利于细胞操作，比如，原生质体融合，在适宜条件下使其细胞壁再生，进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。3. 染色体工程 染色体工程是指借助物理化学等方法，使生物染色体数目、结构和功能发生改变的技术。1.3 细胞工程发展史1.3.1 植物细胞工程的发展1、探索阶段-细胞及细胞全能性的认识（20世纪初-30年代） Schleiden and Schwann 提出了细胞学说（主要内容） Haberlandt认为植物任何细胞都具有发育成为完整个体的潜在能力，从而提出植物细胞全能性。 植物细胞工程三个研究方向的发展： （1）植物组织培养的发展 （2）植物细胞融合研究 （3）单倍体植株培养研究（1）植物组织培养的发展 1934年荷兰植物学家温特（F. W. Went）发现生长素（吲哚乙酸），并证实了其在植物细胞培养中的作用。 1937年法国科学家高特里特（R. J. Gantheret）和诺比考特（Nobercourt）几乎同时离体培养了胡萝卜组织，并使细胞增殖。 1948年斯库格（Skoog）等较好解决了从离体组织或器官中诱导植物再生的问题，确定腺嘌呤/生长素的比例为调控芽和根形成的一个重要条件。 1953年，缪尔（Muir）由无菌冠瘿组织的悬浮培养物及易碎的愈伤组织中分离得到单个细胞，并通过看守培养使细胞分裂生长，开创了单细胞无性繁殖的工作。 1958年施图尔德（Steward）等从胡萝卜根韧皮部愈伤组织获得单细胞，并且经诱导形成胚状体再生了植株，成为世界首次通过实验证实了植物细胞具有全能性的科学家。（2）植物细胞融合研究 1960年英国诺丁汉大学科金教授创造性应用酶解方法首次成功从番茄幼苗根部制备到大量的原生质体。 1972年美国的卡尔森等人用NaNO3作为融合诱导剂将来自不同种的两个烟草原生质体进行融合，获得了世界上第一个细胞杂种植株。（3）单倍体植株培养研究 1974年格雷沙夫（Greshoff）从葡萄花药培养中得到单倍体愈伤组织。 1975年罗萨蒂（Rosati）从草莓花药培养中获得小孢子发育的单倍体植株。（3）单倍体植株培养研究 1921年，伯格纳在曼陀罗中发现了单倍体植株。 60年代，许多人工诱导单倍体植株的方法问世，大大地缩短了杂交育种的时间。 从1970年开始中国应用单倍体育种方法，已成功地培育出小麦、小黑麦、小冰麦、玉米、辣椒、油菜等花粉植株 。曼陀罗花药培养获得单倍体植株 1.3.2 动物细胞工程发展简史动物细胞培养方法的建立细胞融合（自然现象人工融合）动物胚胎移植体处受精动物克隆转基因动物胚胎干细胞动物细胞工程的发展 三项关键技术的发展: （1）动物细胞融合、 （2）动物细胞组织培养、 （3）动物克隆 （1）细胞融合现象的发现和发展 1838年马勒（Muller）在脊椎动物肿瘤细胞中观察到了多核现象。在此间前后，施旺（Schwann）在天花、水痘等病理组织中观察到了多核现象； 1849年罗宾（Lobing）在骨髓中也发现了多核现象的存在； 1855-1858年科学家在肺组织等多种正常组织和坏死部位都发现了多核现象。 1859年巴里（A. Barli）在研究黏虫生活时发现，某些黏虫存在着由单个细胞融合形成多核原生质团的情况。 另外，1965年哈里斯和沃特金斯证明了某些灭活的病毒在一定条件下可用来诱导动物细胞融合。 这些发现为细胞融合研究提供了初步的研究线索、依据和方法。 当前细胞融合技术已日渐成熟。例，单克隆抗体。 1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室的科莱尔（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）合作将体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成了的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：像骨髓瘤细胞体外无限快速增殖，又持续分泌特异性抗体，通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系，由此可获得特性完全相同的高纯度抗体-单克隆抗体(McAb)。两位科学家因此贡献，荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。（2）动物组织细胞培养技术的建立 1885年，卢克斯（Roux）发现鸡的神经元在生理盐水中可以存活，并使用了组织培养一词。 1907年美国胚胎学家哈里森（R. Harrison）采用盖玻璃片悬滴培养蛙胚神经管区组织于蛙的淋巴组织液凝块中，存活数周，且观察到细胞生长现象（从细胞中长出了神经纤维细胞）。 表明了利用体外培养存活的动物组织进行实验研究的可能性。 1911年卡雷尔（Carrel）发现鸡胚浸出液对某些细胞生长具有很强的促进效应，并将无菌操作引入组织培养技术中。他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次。 证明了动物细胞有可能在体外无限地生长。 并与1923年设计了卡氏动物细胞培养瓶。 1914年汤姆森（Thomson）创立了体外组织器官培养方法。 1951年葛瑞（Gay）建立了第一个人体细胞系人体宫颈癌细胞系Hela细胞系。至今，各国还常用此种细胞株系进行实验研究，如研制抗癌药物等。（3）动物克隆技术的建立 1891年希普（Heape）等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们将安哥拉家兔的胚胎移植到比利时兔，得到了4只安哥拉家兔。其后陆续有家畜胚胎移植成功地报道。 1952年，美国费城癌症研究院的2名生物学家布里格斯（RW Briggs）和金(TJ King) 等成功将豹蛙的胚胎细胞核移植到同种蛙的成熟去核卵子中，并获得了发育正常的胚胎。 1962年，英国学者格鲁登（Grudon）报道了首例动物克隆成功，他把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵（经紫外线照射杀死卵细胞核）中，约有1%的重组卵发育成为成熟蛙。 从而实验证明了分化的动物细胞仍然具有全能性；并初步建立了体细胞核移植的实验体系。 1978年，童第周等将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移入未受精的去核卵内，卵子也发育成正常的蝌蚪。 1997年2月，英国科学家伊恩威尔穆特 （I. Wilmut）等在世界权威杂志Nature上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。 实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套的遗传物质。 威尔穆特领导培育的世界上第一只体细胞克隆动物-克隆羊“多利”于1996年7月5日出生，于2003年2月因肺部感染而死亡。 细胞工程对于在细胞学、遗传学、发育学等领域的基础理论研究也极具价值。 对改善农业生产技术；保护自然资源，维护生态平衡；推进生物医药研究、开拓能源资源等多方面均具有积极意义。 1.4 细胞工程的重要应用1、优质植物快速培育与繁殖 基于植物细胞全能性，在人工条件下，利用植物胚胎或器官离体培养，再生新植株（试管苗）2、动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种。人工受精、胚胎移植第2课第一节 细胞工程实验室组成1、超净工作台（二）培养仪器设备1、光照培养箱 液氮温度：196 不断挥发，及时补充1、水纯化装置三、细胞培养的基本条件： 无菌条件：净化工作室、高效过滤器、超净工作台、紫外灯、高压灭菌器、抗生素、生物安全柜； 细胞生长条件：纯水蒸馏器、CO2培养箱、纯水仪、培养板、培养瓶、培养基，血清； 细胞检测条件：倒置显微镜、高速离心机、酶标仪 ，微孔板震荡器、移液器； 细胞保存条件：液氮罐； 实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全。第二节 无菌操作技术（一）玻璃器皿的清洗一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤（1）浸泡 使附着物软化或被溶解掉。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，烤干，然后用稀盐酸液（5%）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。 要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。 浸泡一般要求过夜，甚至更长。浸泡完成后要用清水冲洗5遍左右。 二、常用灭菌方法及原理 消毒：是指用物理或化学的方法，杀灭物料中、物体表面及环境中的部分微生物。 灭菌：是指用物理或化学的方法，彻底杀灭物料、容器、用具和空气中的所有微生物。 防腐：是指用物理或化学的方法，暂时抑制微生物的生长。 除菌：是一种用机械的方法除去液体或气体中微生物的方法。 热力灭菌主要是利用高温使菌体变性或凝固，酶失去活性，而使细菌死亡。 DNA单螺旋的断裂可能是主要的致死因素。细菌蛋白质、核酸等化学结构是由氢键连接的，而氢键是较弱的化学键，当菌体受热时，氢键遭到破坏，蛋白质、核酸、酶等结构也随之被破坏，失去其生物学活性，与细菌致死有关。 高温亦可导致胞膜功能损伤而使小分子物质以及降解的核糖体漏出。 包括湿热灭菌和干热灭菌法。 热力灭菌中的相关定义： 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。1）湿热灭菌 （1）高压蒸气灭菌 压力指标：1.1Kg/cm2 或0.11*106pa ；30分钟；温度达l21126 湿热灭菌的优点： 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； 蒸汽有很大的潜热； 操作方便，易管理。（2）常压灭菌 常压灭菌设备 灭菌方法： 100 灭菌时间： 68小时（3）常压间歇灭菌 条件和方法： 100 热蒸气30 120分钟， 20 25 条件培养24小时，诱发菌丝，30分钟，连续3次。 细菌的繁殖体在干燥状态下，80100 1小时可被杀死；芽胞需要加热至160170 2小时才杀灭。 干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。 火焰灭菌法 是指用火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便，适合于耐火焰材料（如金属、玻璃及瓷器等）物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌，温度可达200摄氏度。 干热空气灭菌法 是指用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂（如油性软膏机制、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。 在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。因此。干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。为了保证灭菌效果，一般规定：135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；180-200摄氏度灭菌0.5-1h。 电离辐射是一切能引起物质电离的辐射总称，其种类很多，高速带电粒子有粒子、粒子，不带电粒子有中子以及X射线、射线。 应用上述离子或射线发生的高能量电子束进行灭菌。适用于忌热物品的常温灭菌方法。又称冷灭菌。在细胞工程中可以用于一些器皿的灭菌。 紫外线是一种低能量的电磁辐射，其能量只有5eV，穿透力很差。 紫外线可分为长波段(320.0400.0 nm)、中波段(275.0320.0nm)与短波段(180.0275.0 nm)三组,短波段中240.0280.0 nm波长的紫外线杀菌力较强， 一般多以253.7nm作为杀菌紫外线波长的代表，由于紫外线灯使用较方便，并有一定杀菌作用，所以在卫生防疫、医疗和工业消毒中使用均较普遍。 杀菌时间一般为2030分钟。 过滤除菌法（filtration） 是用物理阻留的方法将液体或空气的细菌除去，以达到无菌目的。所用的器具是含有微小孔径的滤菌器（filter）。主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品及空气的除菌。 需要过滤除菌的液体量大时，常用较大型号的金属滤器配以过滤泵使用；液量小时，常用注射器推动直径为2.5cm的微孔滤膜滤器过滤。微孔滤膜一般采用0.45m和0.22m孔径的两种，后者有效去除细菌。 使用前将滤膜装入滤器中一同高压灭菌后备用。过滤时将待过滤的液体装入注射器中，套上滤器，推压注射器，溶液压出滤膜，获得无菌溶液。 使用化学消毒剂进行消毒，称为化学消毒法。 化学消毒剂的分类方法：根据化学消毒剂对病原体蛋白质的作用可分为以下几类：（1）重金属盐：重金属盐类可以使蛋白质变性，致死微生物。最常用的是：升汞（氯化汞），硝酸银；剂量：升汞剂量一般为0.10.2%;硝酸银剂量一般为0.10.5；（2）氧化剂：通过氧化左右是蛋白和酶变性失去活性而杀死微生物。常用的有：高锰酸钾，过氧化氢，臭氧，次氯酸钠，漂白粉，过氧乙酸。（3）表面活性消毒剂：通过改变渗透性及原生质的结构状态使蛋白质凝固变性。常用的有：新洁尔灭，7075酒精，石炭酸等。跟蛋白质氨基结合，使蛋白质变性。（4）甲醛：3740%的甲醛溶液（福尔马林）。 化学试剂消毒的使用方法有：1.熏蒸消毒 加热焚烧、氧化反应，使化学药剂变为气体扩散到空气中，以杀死空气中和物体表面的微生物。常用的熏蒸剂是甲醛与高锰酸钾，熏蒸时按（2ml甲醛+1g高锰酸钾）/立方米，处理后1-3天后可达到空气消毒空气的目的。2.药剂喷雾消毒 物体表面常用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如，桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用75%的酒精反复涂擦消毒。三、无菌操作室消毒 常用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒，消毒期间不宜进入消毒空间。消毒后通风换气，气味散尽后再出入。使用前用20%的新洁儿灭对接种室内的墙壁、地板及设备擦洗，用75%乙醇喷雾（使灰尘迅速沉降），紫外灭菌30min。 每周一次检测无菌室的无菌状况，方法为在灭菌后的接种室内桌上和桌下各放一套培养基平皿，暴露15min，盖上盖子，37培养24h，每个平皿的菌落4个，认为效果良好。（一） 无菌操作注意事项 体外培养细胞和组织缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而为在一切操作中为最大可能的保证无菌每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 1、培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后囚物品不全往返拿取而增加污染机会。 2、操作视野消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 3、洗手和着装 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 4、火焰消毒 金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 5、操作 进行操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。手臂不在打开的容器上方过。 操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。第3课影响植物离体形态发生的因素知识点: 基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？ 植物体细胞胚胎发生有哪些途径？ 影响植物离体形态发生的因素有哪些？第一节 植物细胞全能性和细胞分化n 植物组织培养的核心理论：植物细胞全能性理论（Haberlandt, 1902）。 定义：1902年由Haberlandt提出，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。 20世纪80年代，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。 植物细胞全能性的证明是通过1958年Steward等胡萝卜根段细胞体胚发生试验及1964年Guha等进行的曼陀罗花药培养。 细胞全能性的相对性: 细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物; 动植细胞全能性的表现程度存在明显的差异.细胞按照分裂能力分为三类: 第一类是始终保持分裂能力,如茎尖、根尖及形成层细胞； 第二类是永久失去分裂能力的终端分化细胞，如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞； 第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。 根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心形成层薄壁细胞厚壁细胞（木质化细胞）特化细胞（筛管、导管细胞） 根据细胞所处的组织不同从强到弱： 顶端分生组织居间分生组织侧生分生组织薄壁组织（基本组织）厚角组织辅导组织厚壁组织 1、定义：n 分化（differentiation）：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。n 细胞分化：指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。是基因选择性活化或阻遏的结果。n 细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。2、植物细胞分化的某些规律和机理（1） 细胞分化分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。（2）植物中细胞发育的途径一旦被“决定”（determination），通常不易改变。而离体培养可以通过脱分化而丧失这种“决定”。（3）分化与极性（Polarity）关系密切。 （4） 细胞分裂对细胞分化具有重要作用。特定环境条件下进行的细胞分裂可以导致特定的细胞分化，由不等分裂形成的分化细胞说明了细胞质在细胞分化中的作用。 （5）植物生长调节剂有明显调节作用。如生长素与分裂素比值，高，促进生根；低，促进长芽。（6）染色体和DNA的变化对细胞分化影响比较大。如核内多倍体的形成。三、细胞脱分化n 1、脱分化（Dedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。n 如叶柄基部的薄壁细胞成为离层细胞；伤害导致局部细胞形成愈伤组织。 脱分化诱导期间会导致细胞膜透性改变，细胞核增大，内质网范围扩大，多核糖体形成，过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃等。但目前对于脱分化的机理尚未完全阐明。（1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。 （2）在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时配合细胞分裂素的效果可能更好。 （3）弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。 （4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。（5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。（6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。三、愈伤组织（callus）培养、愈伤组织的形成 在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。u 诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。u 分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。u 分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。2、愈伤组织的生长 （1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织， 细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。 （2）质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。 （3）生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。 3、愈伤组织的保持 转接 在多数情况下，随着继代培养代数增加和培养时间的延长，Callus长势下降、褐变、分化和形态发生能力下降、降低甚至死亡。所以在此之前，应及时转接至新鲜培养基上。 主要原因：遗传因素，染色体畸变、基因突变； 生理因素，细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生长物质的敏感性改变。后者可以通过调控培养条件而恢复。4、愈伤组织形态发生 （1）过程：外层细胞分裂，逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成微管化组织和瘤状结构。 （2）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎发生。 四、细胞再分化（redifferentiation） 1、概念 ：指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。组织培养中的再分化包括下面4个水平：n 细胞水平的再分化n 组织水平的再分化n 器官水平的再分化（器官发生）n 植株水平的分化（植株再生）n 细胞水平的再分化：愈伤组织生长、不断分裂，分化出不同的细胞类群。主要有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、石细胞、纤维细胞等。n 组织水平的再分化：在高水平生长素条件下，最常见的是微管束（Vascular tissue）的分化。松散的愈伤组织内含大量拟分生组织或瘤状结构；致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。 n 器官水平的再分化：由分化出的不同组织形成各种器官，如芽、茎、叶、根等。根据起源不同，分为两种类型： 直接器官发生（器官型）：直接从外植体的细胞形成器官原基，然后发育成器官。 间接器官发生（器官发生型）：先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。n 植株水平的再分化（植株再生）：根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。离体培养中再生植株的主要途径有： 器官发生 胚胎发生第二节 离体条件下植物器官发生 一、器官发生再生植株的方式： A 先形成芽，芽的基部后产生后根； B 先形成根，根上再出芽； C 愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束组织把两者结合起来. 二、器官发生的过程： 分为两种：n 经过愈伤组织的器官发生n 不经过愈伤组织的器官发生经过愈伤组织的器官发生过程愈伤组织形成不经过愈伤组织的器官发生过程第三节 植物体细胞胚胎发生 一、什么是植物体细胞胚胎发生？ 定义：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。 体细胞胚胎发生具有普遍性，目前已在200多种被子植物上观察到体胚发生过程。 合子胚与体胚比较 1、发生过程： 一般分为5个阶段：胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗。 双子叶植物：体胚经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚到子叶胚等阶段。单子叶植物：与双子叶植物诱导发生过程类似，只是在形态上无鱼雷形胚等阶段，成熟体胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等结构。 （1） 胚性愈伤组织，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁，并高度染色，胞质浓厚。典型的胚性愈伤组织外表呈松脆颗粒状。 （2）胚性细胞DNA、RNA以及蛋白质的合成更活跃，淀粉、可溶性糖含量增加，内源多胺含量升高，同工酶和内源激素合成变化明显。 如胡萝卜胚性愈伤组织淀粉含量高出非胚性愈伤组织的1540倍。3、体细胞胚胎发生的基因表达机理 植物体胚发生的过程非常复杂，牵涉到4000多个相关基因，以体胚发育后期，表达的基因可达1000多个。 在植物体胚发生过程中，会出现与基因表达有关的一系列生物大分子的有规律变化. 如蛋白质含量变化和特异蛋白质（胚性蛋白）出现与消失。 由于其复杂性，目前对体胚发生的机制了解不多。三、植物体细胞胚胎发生途径1、直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。 2、间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。通常包括2个阶段： （1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。（2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。四、体细胞胚胎发生的机理 1、体细胞胚胎的起源： 起源存在争论，但绝大多数体细胞胚胎起源于单细胞。细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现遗传信息的表达。 2、体细胞胚胎发生机理： 体胚具有两个明显特点：极性和生理隔离 极性：单个胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。极性获得的诱因是激素和外界刺激。生理隔离：在早期胚性细胞与周围细胞存在胞间连丝，但是随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞（类似小孢子发生）。第四节 影响植物离体形态发生的因素一、植物种类和基因型1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。2、同一物种不同基因型间存在较大差别。二、培养材料的生理状态1、发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高；2、培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好；3、培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。三、 培养基1、营养成分 一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。 茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。 茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。 碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。2. 植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用）（1）生长素：促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。2，4 D诱导体细胞胚胎发生。（2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。（3）赤霉素：GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。（4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用（5）脱落酸：对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。3、培养基的性质（1）愈伤组织诱导：在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏）。（2）细胞和胚状体的诱导：在液体培养基上。（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：渗透压，要求高.四、培养条件1、光照 培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。昼夜光照有利于极性的建立及形态发生。 光强一般要求1000-5000lx。植物间有所差别。 光照周期为1016h/日。不同波长光质作用不同，蓝光有利于芽的分化，红光有利于根系发生。2、温度： 大多数培养温度为252. 花药培养低温或高温预备处理。3、气体： 氧气、二氧化碳以及乙烯等气体的浓度和通气状况。思考题: 基本概念：植物细胞全能性、细胞分化、 脱分化、再分化 植物离体培养中再生植株有哪些途径？ 愈伤组织是如何形成与生长的？ 植物体细胞胚胎发生有哪些途径？ 影响植物离体形态发生的因素有哪些？第4课第四章 植物离体无性繁殖和脱毒技术第一节 植物立体无性繁殖技术第二节 植物脱病毒技术 要点概述 理解：脱毒苗的意义； 了解：1、病毒在植物体内的分布及危害。 2、植物脱毒苗的鉴定、保存、 应用与繁殖。 掌握：1、无病毒苗概念； 2、植物脱毒的原理和方法。无病毒苗 是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。 病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。 潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危险。 国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病毒苗，实施农作物无病毒化栽培。一.病毒在植物体内的分布、传播及危害 1.分布 在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。 老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高 根尖、茎尖生长点约0.11mm区域内，几乎不含病毒。(原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。)2.传播及危害: 病毒在植株个体间的传播分为介体和非介体传播两类 在无性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。 病原菌的侵染不一定会造成植物的死亡, 却会大大降低植物的生长发育及产量和质量,从而影响其栽培的经济效益。 因此, 脱除病毒及其他病原菌对植物栽培生产是非常必要的。三、植物病毒的检测及无病毒苗的保存和繁殖3、抗血清鉴定法 利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类，常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸附法。其中酶联免役吸附反应（ELISA）是常用的一种方法。5、分子生物学鉴定法 第5课第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产 主要内容： 第一节 植物单细胞培养技术 第二节 植物细胞的大规模培养 第三节 植物细胞生物反应器 第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物 学习的目标与要求： 掌握单细胞分离和培养的方法，了解植物大规模培养方法，了解植物细胞生物反应器的设计与要求。了解利用植物细胞培养生产次生代谢产物的流程。植物细胞培养和次生代谢产物生产 植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源之一。80%的天然产物来自于高等植物。 资源的过度采掘，造成了许多植物资源的日益枯竭。 通过植物细胞培养是弥补这方面的重要研究方向植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产 什么是植物细胞培养?与组织培养的区别? 植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。 1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议： 组织培养 ：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。 细胞培养 ：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养的应用 获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。 同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞的特点： 植物细胞直径一般约会10-200微米，平均直径比微生物细胞大30-100倍。 植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。 植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。 与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月 植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难 植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养的方法 按培养规模：小规模培养和大规模培养 按培养方式：平板培养法、悬浮培养、看护培养、 微室培养等； 按培养基类型：固体培养和液体培养 按要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。一、植物单细胞培养技术 固体培养： 是在微生物培养基基础上发展起来的植物细胞培养方法。一般添加一定比例的琼脂起固化作用。 固定化培养： 属于固体培养，指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制备的网状支持物中，培养液呈流动状态的无菌操作技术。 液体培养： 也是在微生物培养基础上发展起来的。 可分为: 振荡培养、旋转培养、静止培养、纸桥培养 细胞悬浮培养： 属于液体培养，指植物细胞或小细胞团在液体培养基中大规模进行培养。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术1.单细胞的分离 1)机械法 ：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。 优点：细胞不受酶伤害。 缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。 1969 年，Gnanam 和Kulandaivelu 用该方法分离出几种成熟叶片叶肉细胞。一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离机械法一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离机械法一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离 2）酶解法 ：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等） 在温和条件下分解胞间层，分离细胞。 优点：最有效的一种方法。 缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。 1968 年，Takebe 等用该方法分离烟草叶肉细胞成功。 一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术1.单细胞的分离3）由培养组织分离单细胞： 指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶有利。 这是分离单细胞通常采取的方法。 诱导产生愈伤组织； 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性； 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物 一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 2.单细胞培养技术 1）平板培养法 指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。 此法是Bergman ( 贝格曼，1960) 首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察, 选择单细胞株和筛选突变体。 一、植物单细胞培养技术 2.单细胞培养技术 1）平板培养法 a.步骤 u 制备单细胞悬浮液 v 调制悬浮培养液中的细胞密度 w 倾倒平板(植板) x 密封、标记和培养 b.优劣 平板培养法的优点在于单细胞在培养基中分布较为均匀，也便于定点观察，缺点是容易造成培养细胞的通气不良。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术2.单细胞培养技术1）平板培养法 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。 每个平板形成的细胞团数 植板率 每个平板接种的细胞总数 一、植物单细胞培养技术 2.单细胞培养技术 2）看护培养与饲养层培养法 看护培养： 是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。 谬尔（Muir ，1953 ）首创此法。该方法的优