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生物技术制药1.大分子和小分子药物的区别大分子：多肽蛋白，来源于生物体，不容易提纯；小分子：为化学小分子，来源于化学合成，容易提纯。2.有哪些方法合成第二链cDNA。1）selfpriming；2）Replacementsynthesis。3.有哪些引物用来合成cDNA第一链1）oligodT(n=1218)，它引导的cDNA合成必须从3开始；2）随机引物（n=6），随机合成610寡核苷酸片段作为引物；3）基因特异性引物（n=1825），当RNA序列或部分序列已知时。4.与RTPCR相比，建立的cDNA文库有什么好处。1）cDNA文库是以mRNA为材料，排除了真核基因组内含子的干扰，而且对于一些RNA病毒来说，cDNA文库是研究它们的唯一可行的方法；2）cDNA基因文库的筛选简单易行；3）由于每一个cDNA克隆都代表一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的几率比较低；4）cDNA是双链可以克隆到载体上，能无限扩增，可以随时满足需要，RTPCR的产物第一链cDNA为单链，不能扩增，一旦用完就没有了。5.在哺乳动物细胞中表达常用的启动子。SV40、CMV、MLP6.逆转录病毒载体的主要结构。1）2个LTR（长末端重复序列）（其插入宿主基因组作用，5还有启动子作用）；2）（装配信号，指导结构蛋白表达）；3）MCS（多克隆位点）；4）backbone（大肠杆菌中增殖必备部分）。7.哺乳动物细胞表达载体的主要表达元件。启动子、载体的转录终止信号和高效多聚腺苷酸（ploy(A)）加尾信号、选择标记基因。8.什么是转染？在完成基因克隆之后，大多数的研究人员希望重新把这个基因的自然体和突变体导入到各种细胞来分析它的功能特点，这个过程称之为转染。9.有哪些转染哺乳动物细胞的方法？（一)非病毒介导转染法：1）钙转染法（沉淀）；2）脂质体转染法（形成双层质膜包埋DNA）；3）DEAE葡聚糖转染技术促进哺乳动物细胞捕获外源DNA）；4）电转染（在高压电脉冲作用下使细胞膜上出现微小孔洞，促使细胞吸收）；5）压缩DNA转染法（将DNA压缩成为小颗粒）；6）利用细胞周期转染法（利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的空隙增大）；7）显微注射法（直接将目的基因通过注射器注入受体细胞中）；8）提高转染率（提高细胞内的激酶的pH）；（二）病毒介导转染法：逆转录病毒介导法，病毒介导法（通过感染宿主细胞将外源基因整合到染色体中）。10.什么是装配细胞？指细胞中含有逆转录病毒结构蛋白基因，能够表达病毒的结构蛋白，是逆转录病毒载体转染入细胞后能够合成具有感染型的病毒粒，这种细胞称为装配细胞。11.举例两个报告基因并说明原理。1）半乳糖甘酶基因（lacZ）：利用它可以进行蓝白斑筛选，大肠杆菌产生的半乳糖甘酶能够催化乳糖水解为单糖，是xgal第五变蓝色；2）萤火虫荧光素酶基因：在Mg2+、ATP、O2的参与下催化荧光素氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550580nm的荧光，通过测定荧光酶基因表达检测各种启动子活性，它可以克隆启动子下游，定量测定启动子效率；3）细菌荧光酶：以脂肪醛为底物，在还原型黄系单核苷酸及氧的作用下，在脂肪醛氧化成脂肪的同时发出光子，产生490nm的荧光。12.胰岛素的结构。胰岛素含有51个氨基酸，有两条多肽连组成，即A链（21aa）和B链（30aa）,两个多肽链间由两个二硫键连接，这两个二硫键分别位于A7B7和A20-B19，第三个二硫键由A链之间的A6A11组成。13.胰岛素的主要功能。主要为促进合成代谢，调节血糖稳定，主要靶器官为肝脏、脂肪组织、骨骼肌。1）对糖代谢的调节：吸收血糖，合成糖原；2）对脂肪代谢的调节：加速葡萄糖转变为脂肪酸；3）对蛋白质代谢的调节：增加蛋白质合成，抑制蛋白质分解。14.干扰素的三个主要亚型。1）干扰素：白细胞是主要合成场所，其主要功能为：增强免疫力，预防和治疗；2）干扰素：有成纤维细胞合成，其主要功能为：抗病毒，免疫调节；3）干扰素：有淋巴细胞合成，其主要功能为：较强的抗病毒作用，抗细胞增殖和免疫调节作用。15.干扰素的三大功能。1）抗病毒；2）抗肿瘤；3）免疫调节。16.红细胞生成素的主要生理功能。EPO能调节红素祖细胞，红细胞的生成，治疗作用：1）治疗因慢性肾功能衰竭引起的成年和儿童贫血症病人贫血症；2）治疗由叠氮胸苷处理HLV感染所致的贫血；3）治疗非骨髓恶性肿瘤病人因化疗引起的贫血症。17.ADCC解释抗体依赖的细胞介导细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc端直接杀伤被抗体包被的靶细胞。18.名词解释：VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3、CDR。VL：为轻链的可变区，位于IgL链N端月1/2处，约含108111个氨基酸，其氨基酸组成和排列顺序在不同抗体间有很大变化。CL：轻链恒定区，位于IgL链C端1/2处，约含105个氨基酸，氨基酸组成和序列无大的变化。VH：重链可变区，位于IgH链N端1/51/4相互，约由118个氨基酸组成，在不同抗体间氨基酸组成和排列顺序变化很大。CH1：重链第一恒定区，重链恒定区的一个球状结构域，是重链正链的第二个亚单位。遗传标记所在区。CH2：重链第一恒定区，重链恒定区的一个球状结构域，是重链正链的第三个亚单位。补体结合所在区，抗体糖基化部位。CH3：重链第一恒定区，重链恒定区的一个球状结构域，是重链正链的第四个亚单位。能与细胞表面的Fc受体结合行使抗体功能。CDR：互补决定区。VH和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，故高变区又称为CDR，分别用CDR1、CDR2、CDR3表示。19.CDR的数量和功能。1）数量：Ig轻链有三个CDR：LCDR1、LCDR2、LCDR3，Ig重链有三个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3；2）功能：CDR的Aa顺序决定抗体的特异性，CDR是Ig的抗原结合部位。20.Fab和F(ab)2的区别。1）Fab是由木瓜蛋白每水解IgG铰链区二硫键连接的2条重链的近N端而得到的，F(ab)2是由胃蛋白酶水解IgG铰链区二硫键连接的二条重链的近C端而得到的；2）Fab片段为单价，F(ab)2片段为双价；3）Fab片段与抗原结合后，不能形成凝集反应或沉淀反应，F(ab)2片段与抗原结合后，可以发生凝集反应或沉淀反应。21.抗体糖基化的部位。CH222.什么叫HAMA的反应。人抗鼠抗体反应，由于鼠抗体对人体而言具有较强的免疫原性而产生的。23.为什么要人源化鼠抗体？1）鼠单抗对人而言具有较强的免疫原性，可产生较强的人抗鼠抗体反应，而人源化鼠抗体可以最大强度降低抗体的鼠原性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；2）鼠单抗的生产成本较高，难于大规模普及应用，而鼠抗体人源化后可采用原核细胞、真核生物或植物等多种表达系统大量生产，成本大大降低。24.抗体可变区的结构。1）高变区，又称互补决定区，在轻链和重链上各分为三个区域，分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3；2）骨架去，VH和VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3、FR4表示，它们夹持着CDR，可变区3个CDR分别被FR1、FR2、FR3、FR4隔开。1.用逆转录病毒介导DNA的过程。病毒基因编码在一条单链RNA分子上，进入细胞后逆转录为双链DNA并整合在细胞染色体，以此为模板合成病毒基因及子代RNA，再装配成病毒颗粒。2.调节胰岛素分泌的主要物质。1）血糖；2）氨基酸和脂肪酸；3）激素；4）神经调节。3.有哪些办法解决HAMA反应。1）减少单克隆抗体多鼠源部分；2）嵌合抗体；3）单克隆抗体的人源化；4）改型抗体；5）CDR移植；6）鼠源性抗体的改造即鼠抗体的人源化。4.重组抗体与单克隆抗体的区别。5.在噬菌体展示中那些蛋白可与展示多肽融合，并说明道理。抗体基因与p或p基因相融合。转染表达F菌毛的大肠杆菌，抗体融合表达在p的N端，在辅助噬菌体超感染后p融合蛋白被包装于噬菌体尾部。6.Etanercept/Enbrel/可溶性TNF受体的设计和治疗机理。表皮生长因子受体是跨膜糖蛋白，属于型受体酪氨酸激酶，不断有许多正常上皮组织如皮肤和毛囊上皮组织所表达出来。可特异性的与正常肿瘤细胞的表皮生长因子结合，阻断磷酸化作用和与受体相关联激酶的活性，抑制细胞生长，诱导细胞死亡，并减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的生产。7.发现药物基因和靶标的策略。1）通过筛选同源基因的方法发现新的药物基因或药物靶基因；2）通过RNA的表达筛选新的药物基因和靶基因；3）蛋白组学；4）使用寡核苷酸技术证实药物分子；5）基因功能的系统分析；6）使用生物模型发现新药。8.研究中流显像抗体制剂，有哪些方法可将抗体与同位素连接？9.自然状态的胰岛素易发生沉淀，用什么方法解决的？链第28，第29位的脯氨酸和赖氨酸发生了转换。这些变化导致胰岛素间的自我集合性降低，因此皮下注射吸收快，与正常的人胰岛素相比，效应峰出现早，滞留时间短，持续时间长。10.InsulinGlargine（甘精胰岛素）的设计与作用原理。重组人胰岛素类似物，作用时间长达24小时，它利用重组DNA技术，以实验室的大肠杆菌为生产菌。它与人的胰岛素的不同之处在于A链第23位上的氨基酸以甘氨酸替代丙氨酸并且在B链的C端加上两个精氨酸。它的分子量大约为6.1kD。在生理pH条件下，InsulinGlargine与天然胰岛素相比，溶解性略差，在Lantus注射液中，它是全溶的。当皮下注射到组织后，有一定超过24h的稳定的浓度/时间值，并且没有明显的峰值；它的特点是皮下注射后吸收慢，胰岛素血浆浓度值平缓，吸收模式与在皮下注射是相似的。11.InsulinAspart（门冬胰岛素）的设计与作用原理。来自rDNA，是速效人胰岛素类药物，通过重组DNA技术在Saccharomycescerevisiae（baker酵母）中生产的，分子量为5.8kD。主要用于调节葡萄糖的代谢。在人体该胰岛素类似物的皮下注射于普通的胰岛素相比，作用起效快、作用时间短。在B28位上以天冬氨酸替代脯氨酸，降低了该分子像通常胰岛素那样形成六聚体的能力。Novolog与普通胰岛素相比，两者吸收基本上相同。12.基因工程疫苗的种类。1）合成多肽疫苗；2）亚单位疫苗；3）基因缺失疫苗；4）重组活载体疫苗；5）核酸疫苗；6）其他疫苗。13.谈谈核酸疫苗的原理和优缺点。（一）原理：模拟了病毒的自然感染过程。DNA质粒在注射部位被肌细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节合成所编码的蛋白质，合成的蛋白质被细胞内蛋白酶复合体降解成含抗原表位的肽段，进入内质网与MHC类分子结合，然后被转运系统递呈到细胞膜表面，此复合体共同激活CD8+CTL，部分被分泌或释放到血的蛋白质，激活特异性B细胞，从而产生保护性抗体，另外分泌的蛋白质被巨噬细胞或树突状细胞等专职抗原递呈细胞俘虏，被加工成肽段，进入溶酶体/内体区与MHC类分子结合，激活手MHC分子限制的CD4+Th细胞，被激活的Th细胞分泌IFN、IL2等细胞因子，进一步促使和强化体液免疫和细胞免疫；（二）优缺点：1）基因疫苗能在宿主细胞中产生外源基因；2）具有共同的理化性质，可在同一载体上构建表达多种抗原；3）核酸疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内，可直接与MHC类和MHC类分子结合，引起广泛的细胞免疫和体液免疫，且不存在返祖的危险；4）安全性好，由于核酸疫苗一般采用表达载体在细胞内进行抗原表达，与病毒活疫苗相比避免了病毒本身存在的毒力反强和病毒基因组整合到宿主染色体的危险；5）设备简单；6）由于核酸疫苗作为重组值里，能在工程菌内快速大量增殖，且提取方便、可是生产成本降低，并能加工干燥，便于运输和储藏。14.a-alfacon(infergen)的设计原理。一种重组的非天然的型干扰素。IFNcon1的166个氨基酸序列是通过若干天然IFN亚型的序列，将各个相应位置最常出现的氨基酸组合设计而成。额外改变了4个氨基酸以促进分子构建，其相应的DNA序列采用化学合成法构建。15.a-n1(Wellferon)的设计原理。用Sendai感染成淋巴细胞系而合成的干扰素。16.蛋白药物聚乙烯二醇化作