western前蛋白样品的准备.doc

Western blot前蛋白的准备1、 取得组织或细胞后，下面用细胞举例：2、 贴壁细胞先用预冷的PBS洗两遍，之后加入适量的强RIPA（300ul）（里面加入100的PMSF）（RIPA的量不能太多，不然所得蛋白浓度太低），加入RIPA后，将细胞刮下来（组织的话，先研磨碎，在加RIPA）；（悬浮细胞：先离心，再用PBS重悬后，离心）3、 将细胞在RIPA中刮下来后，转移至离心管中，置冰上，裂解20min；4、 之后，离心，4度、12500转，10min；5、 然后，吸取上清，即为所提的粗蛋白；6、 蛋白浓度的测定，之后将蛋白储存于-80；7、 从上述所提蛋白中取出一部分，如40ul，加入10ul的5loading buffer（蓝色），尽量算出稀释后蛋白的浓度；（高浓度利于储存！）8、 之后将该50ul的蛋白煮沸10min，储存于-20/-80待用；Western之前蛋白样品的处理：因为做Western时，各组蛋白上样量，及上样体积都应该一致；故，根据所用蛋白的浓度来确定样品处理：如：一个蛋白的浓度为：20ug/ul；一般上样量为20-100ug，上样体积为10-30ul(一般10/20ul)（视情况而定，如果所跑的蛋白本来表达较高，可以减少上样量；而如果所跑蛋白表达较少，可以提高上样量），下面以50ug，10ul为准，故要取出2.5ul蛋白，然后加入1 loading buffer将体积补到10ul即可。是根据上样量，算出所需的蛋白样品体系，之后用1loading buffer补齐到上样体积。Western Blot蛋白样品制备（一） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、 每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01MpH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、 按1ml裂解液加10 l PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、 每瓶细胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、 于4下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于20保存。（二） 组织中总蛋白的提取：1、 将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、 加400 l单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。（三） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3、 用枪洗干上清后，加100 l裂解液（含PMSF）冰上裂解30min