细胞培养技术.ppt

细胞培养技术 赵培荣郑州大学肿瘤中心 一 体外培养的定义 在体外模拟一个体内的微环境 使离体的器官 组织 细胞在体外存活 可用于药物的筛选 细胞周期 细胞代谢 细胞分化的研究 体外培养包括 器官培养 组织培养 细胞培养 二 细胞培养技术的优点 1 便于应用各种物理 化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律 2 便于应用各种不同的技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化 3 可长期研究和观察细胞的遗传行为的改变 4 可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究的对象 耗费少 比较经济 三 细胞的类型 贴壁型 贴附型 细胞悬浮型细胞 一 贴壁型细胞 这类细胞在培养时能贴附在支持物上生 绝大多数细胞培养时 皆呈贴壁型 细胞帖附生长后 常失去原有的形态 出现类似 返祖 现象 分类 成纤维细胞型 上皮细胞型 游走细胞型 多形性细胞型 1 成纤维细胞型 形态 与成纤维细胞相似 胞体呈梭形或不规则三角形 中央有圆形核 胞质向外伸出2 3个长短不同的突起 细胞群常借原生质突起连接成网 生长时呈放射状 凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞 如血管内皮 心肌 平滑肌 成骨细胞等 也多呈成纤维细胞形态 但无分泌纤维的能力 只是一种习惯上概括的称法而已 2 上皮细胞型 形态 本型细胞呈扁平的不规则多角形 中央有圆形的核 生长时常彼此紧密连接成单层细胞片 起源于外胚层和内胚层的组织细胞 如皮肤表皮及衍生物 汗腺和皮脂腺等 肠管上皮 肝 胰和肺泡上皮细胞培养时 皆呈上皮型 3 游走细胞型 在支持物上散在生长 一般不连接成片 细胞胞质经常伸出伪足或突起 呈活跃的游走和变形运动 速度快而且方向不规则 此型细胞不稳定 难与其它型细胞相区别 4 多形性细胞型 如神经组织的细胞 难以确定它们的稳定形态 以上划分 主要是根据细胞的一般形态特征和描述上的方便 但实际上 环境改变 形态也会改变 如HELA细胞 人宫颈癌细胞 本属上皮细胞型 但在过酸或过碱的培养液中 可变成长梭形 在适宜的PH值时细胞又可复原 二 悬浮型细胞 细胞在培养时不贴附于支持物上 而是悬浮状态生长 如某些肿瘤细胞和血液白细胞既呈悬浮型 细胞体呈圆形 四 细胞的形态结构 呈悬浮状态生长时 不论原来属于哪种类型的细胞 由于存在液体环境中 胞体回缩 基本呈圆形 如附于支持物表面之后 开始仍为圆形 但为时很短 经过形态过渡 恢复成原细胞形态 细胞形态过渡的过程 一般附于支持物上数分钟后 既由球形移行成圆饼形 有人把这种状态的细胞称为发射延展细胞 过一段时间后 延展细胞过渡为极性细胞 成纤维细胞不经放射延展 而上皮细胞经过延展细胞后进入极性细胞时 细胞相互连接成一片 五 细胞周期 细胞分裂间期 G1期 S期 G2期 细胞分裂期 前期 中期 后期 末期 按5 104 2 105个 ml细胞接种 到在支持物上生长满 从一瓶细胞分成两瓶细胞 叫传代 一般习惯上称做一代 但实际上细胞能增殖6 7代 六 细胞的生物特性 1 正常的细胞离体培养后 可维持2倍体性质 但在一般情况下 2倍体细胞只能传30 50代 生长一年左右 以后停止生长 衰老死亡 2 肿瘤细胞则可生长时间长 获得无限的生长能力 3 胰酶可使细胞衣性质改变 使细胞易从支持物上脱离下来 七 细胞生存条件和代谢 一 温度 36 38 通常为37 细胞对低温度的耐受力比对高温的耐受力强 45 1小时死亡 41 42 10 24小时死亡 25 35 长时间不死亡 4 数小时后37 仍能存活 196 长期保存 二 气体和氢离子浓度 主要有O2和CO2 O2参与三羧循环 产能供细胞所有 有些无氧时也能存活 但大多数不能生存 CO2既代谢的产物 也是细胞生存的所需气体 它主要维持培养基的PH值 PH7 2 7 4最适宜 低于6 8或高于7 6 对细胞不利 但不同的细胞对PH要求也不同 总之偏酸环境比偏碱环境更利于细胞生长 处代培养和细胞数少时对PH变动耐受力差 CO2高或CO2低对细胞都不利 保持CO2恒定的浓度 5 即可维持培养基中氢离子浓度 密闭瓶口的培养方法 随CO2浓度的升高 PH不断变化 开放的瓶皿中培养 能保持氢离子的浓度 有利于细胞生长 三 基本营养物质 与体内相同的三大物质 蛋白质 脂肪 糖 培养基 血清 八 细胞的死亡 细胞在培养过程中 常见的死亡现象有 群体死亡 因素衰老 污染 缺乏营养 PH值 温度 个体死亡 可能由于不适应性淘汰和异常细胞分裂引起 在接种和传代之前死亡 细胞不贴壁 生长过程中死亡 胞体变圆形 细胞间隙增大 形态轮廓明显 整个细胞可能崩溃成数块 最后液化失望 实验室操作 一 清洗 酸液的配置 次强酸120g重铬酸钾200ml浓硫酸1000ml水配制时 先将重铬酸钾溶于水 再将浓硫酸缓慢加入 注意过急易产热发生危险 应边加入边搅拌 或在下面放一盆冷水 使溶液冷却 酸液一般为棕红色 水分增多或变成绿色 表明失效 不能与电泳 免疫组化公用 浸泡时 将水分空干或干燥 使器皿充满酸液 勿留气泡 浸泡24小时 玻璃器皿的清洗步骤 1 培养后器皿立即用自来水浸泡过夜 新使用的器皿用5 的稀盐酸浸泡过夜或煮沸30分钟 2 用毛刷和洗涤剂刷洗 注意边角 3 自来水冲洗干净 凉干 4 酸液浸泡过夜 5 自来水冲洗若干遍至干净 6 蒸馏水漂洗三遍 凉干或烤干备用 塑料器皿的清洗 先用清水充分浸泡和冲洗 再用2 NaOH溶液浸泡过夜 自来水冲洗 然后用5 的HCL浸泡30分钟 自来水冲洗 最后用蒸馏水洗三遍 凉干或烤干后备用 瓶塞的清洗 每次用过用自来水浸泡 然后用2 NaOH煮10 20分钟 自来水冲洗 再用1 HCL浸泡30分钟 最后自来水冲洗 蒸馏水洗三遍 晾干备用 滤器的清洗 1 玻璃滤器的清洗 清洗用抽滤法 使用后 立即用清水注入滤器抽滤5次 干净酸液抽滤1次 再用清水抽滤10次 蒸馏水抽滤3次 备用 蔡氏滤器的清洗 使用后 金属部分刷洗干净 最后用蒸馏水洗3遍 干后备用 金属器械的消毒 用自来水洗 蒸馏水洗净 酒精擦干备用 包装 消毒前要进行包装 以防消毒后二次污染 可用纱布 牛皮纸和棉花 不能用报纸和污染的纸 线绳打活结 便于使用 也可直接用饭盒包装 二 消毒 物理灭菌法 1 紫外线 照射30分钟 可达灭菌效果 优点 方便 效果好 缺点 产生臭氧 污染空气 2 干热消毒法 仅用于玻璃器皿 160 保持90 120分钟 注意 消毒后不要立即打开箱门 以防冷空气进入 影响消毒效果和损坏器皿 3 湿热消毒 所有物品均可用 消毒时 箱体内不能装的过满 上气后20分钟 通常120 15磅 4 过滤消毒 用0 22u的微孔滤膜 速度不要太快 过滤后要分装 化学消毒 消毒剂 1 新洁而灭 75 酒精 培养用液的配制 要求 1 配置浓度要准确 2 都要标注日期 浓度 PH 名称 消毒于否 3 存放地点固定 对水的要求 三蒸水 去离子水 贮存时间不能超过两周 最好是新鲜的 胰酶溶液的配制 浓度0 25 0 125 PH6 8 7 2左右 方法 1 用少量D Hanks液先将胰酶调成糊状 2 补充D Hanks液 摇匀 4 过夜 3 次日溶解后 用滤纸滤 4 无菌过滤 5 分装 20 保存 用时用调PH至7 0