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药敏试验简介 卢先雷 本节课程需要掌握的内容 什么是药敏试验 什么时候需要做药敏试验 即药敏试验的临床指征是什么 药敏试验方法学 怎么做药敏试验结果的正确判读与解释 怎么观察药敏结果的正确报告药敏试验的室内质量控制 药敏试验的概念与适应征 通过模拟体内环境条件 测试分离自病人体内感染部位的病原菌对常用抗生素的敏感性 即抗生素对目标细菌的抑制能力 从而预测抗生素治疗效果的一种体外试验方法 药敏试验适应征 分离菌是感染菌而不是定植菌或污染菌 常规经验治疗效果不佳或有较高失败风险时 对感染菌的耐药性无法估计时 需要了解微生物耐药性变迁时 药敏试验方法学 纸片扩散法稀释法 MIC法 肉汤稀释法常量稀释法微量稀释法琼脂稀释法E test法 药敏试验方法学指南 美国CLSIM2 A10DiskDiffusion 2009 M7 A8MIC 2009 M11 A7Anaerobes 2007 M24 AMycobacteria Nocardiae andOtherAerobicActinomycetesM27 A2FungalMIC 2002 M44 AFungaDiskDiffusion 2004 M45 AInfrequentlyIsolated FastidiousBacteria 2006 M2 M7updatedevery3years 其他标准 法国CASFM标准 梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准英国BSAC标准 欧洲应用比较广泛的标准德国DIN标准 纸片扩散法 原理一定药物含量的碟形抗生素纸片贴在涂布一定浓度菌液的琼脂上 过夜培养后抗生素扩散到纸片周围的琼脂中 形成一定浓度区域 越靠近纸片的浓度越高 反之越低 当低到一定程度 MIC以下 时药物无法抑制细菌的生长 从而形成界限分明的抑菌环通过抑菌环大小与MIC值高低之间的统计学分布关系 经过回归处理可以求出细菌对某种抗生素的MIC折点范围对应的抑菌环大小值 由此可知 MIC与抑菌环大小之间存在负相关 试验方法与条件 CLSI推荐培养基 普通营养要求细菌使用水解酪蛋白琼脂 MHA 平板肺链使用含5 绵羊血的含血MHA嗜血杆菌使用HTM培养基淋球菌使用含1 生长因子 不含L 半胱氨酸 补充剂的GC培养基平皿大小 最小90mm 通常使用150mm平板琼脂厚度4 1mm菌液浓度0 5McF 约1 5 108CFU ml 涂布方法 无菌棉签浸透菌液后稍微挤干 棉签与平板呈30 左右的倾角密集左右来回涂布 完成一遍后旋转120 后再涂 如此三次 最后绕边缘一次纸片之间最佳间距30mm 不得低于25mm培养温度 35 重叠时不超过3个碟子气体环境 普通细菌大气环境 嗜血杆菌 淋球菌 肺链置CO2环境培养时间 18小时 测量方法 透射光葡萄球菌利奈唑胺苯唑西林万古霉素肠球菌万古霉素 反射光测量其他细菌与药物时 变形杆菌忽略环内的迁徙生长 测量肉眼可见的明显抑菌区忽略环边缘的微弱生长 环内生长现象 大肠药敏 被肠球菌污染 铜绿假单胞菌耐药亚群 特殊处理方法 当受测抑菌环与旁边的融合时 选择完整部分测量当受测抑菌环部分变形时 选择正常部分测量 扩散法药敏影响因素 培养基pH值7 2 7 4营养程度 肠球菌能生长 厚度抗生素拮抗剂含量 用29212监控 钙镁离子含量 锌离子含量 用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控 菌悬液浓度高抑菌环缩小浓度低则扩大 细菌纯度气体环境普通细菌放CO2时由于碳酸的影响 药物活性受到影响 形成假敏感或假耐药苛养菌放普通环境生长不良 导致假敏感培养时间粘液性铜绿需48小时测量方法 稀释法 MIC法 MIC法 分为常量法和微量法常量法 肉汤稀释法 琼脂稀释法微量法 微量肉汤稀释法简化双浓度折点法ATB药敏简化常规浓度分布MIC法BD 德灵药敏动力学计算MIC法VITEK32 VITEK2药敏 试验方法与条件 CLSI推荐培养基 普通营养要求细菌使用补充阳离子MH肉汤肺链使用含2 冻融马血的MH肉汤嗜血杆菌使用HTM肉汤厌氧菌和微需氧菌使用布氏肉汤淋病奈瑟菌推荐强化GC作琼脂稀释法菌液浓度 5 104CFU ml 初始菌液0 5McF 约1 5 108CFU ml 盐水稀释200倍 加入0 1ml菌液到含有0 1ml双倍浓缩的MH肉汤的微孔板中 或预先用标准浓度的MH肉汤稀释后再加到微孔中 接种后应充分混匀 但不能有气泡产生静置培养培养温度 35 气体环境 所有细菌 包括苛养菌 均置大气环境 厌氧菌置厌氧环境 微需氧菌置微需氧环境 淋菌琼脂稀释法置CO2培养时间 18小时结果读取 见后面的幻灯 常量稀释法 药敏试验的参考方法 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中 过夜培养 MIC即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值 琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50 的MHA中再倾制平皿 接种物为一定大小的斑点 浓度也为104CFU ml 解释标准 SorR 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上 微量肉汤稀释法 商品化药敏系统 MicroScan Sensititre Phoenix Vitek2compact 微量肉汤稀释法结果读取技巧 磺胺类药物容易出现弱生长 只要满足70 以上抑菌率即可视为未生长真菌药敏三唑类药物容易出现拖尾现象 即低浓度孔易出现弱生长 判读时以对照孔为参照 80 的抑菌率即可视为未生长大于三孔不同梯度浓度的抗生素测试中 出现的高浓度生长 而低浓度不生长现象叫跳孔 造成跳孔的主要原因 菌悬液乳化不充分 细菌分散不足 以及药敏卡某些孔被污染跳孔的解决方法 根据其他药理学特征类似的抗生素的敏感性以及分析其他同类不同种抗生素的敏感性进行推断性修正修正低浓度 耐药修正高浓度 敏感 肉汤稀释法注意事项 生长缓慢微生物 形成肉眼可见生长 1周 不适合用MIC法在肉汤中发育不良的微生物不适合用MIC粘液性铜绿假单胞菌 只能用扩散法 48小时观察结果淋病奈瑟菌 CLSI无肉汤稀释法药敏指南注意微弱生长导致的假敏感 结果需要修正 例如铜绿对磺胺 四环素 头孢噻肟 曲松鲍曼不动杆菌对氨曲南肺克 阴沟 变形杆菌对呋喃妥因 稀释法药敏影响因素 培养基pH值7 2 7 4营养程度抗生素拮抗剂含量钙镁离子含量 钙10 25 镁10 12 5 g ml 菌悬液 5 104CFU ml 接种效应浓度高MIC抬高浓度低MIC压低 细菌纯度气体环境所有需氧细菌均放普通大气环境 如果放CO2 由于碳酸的影响 药物活性受到影响 形成假敏感或假耐药培养时间真菌需48小时奴卡菌需5天 MIC值标注于试条的光面 Etest试条 毛面贴于MHA上 Etest操作程序 按照扩散法标准操作涂布接种 贴上试条并培养15 18小时 读取抑菌浓度并按标准解释 肺炎链球菌青霉素MIC 3 g ml 结果读取 药敏解释标准 CLSI标准 全球性每年更新非强制性学术机构FDA标准 全球标准 建立在CLSI基础上6 8年更新一次官方机构 标准带有强制性法国CASFM标准 梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准英国BSAC标准 欧洲应用比较广泛的标准德国DIN标准 CLSI药敏解释标准 CLSI ClinicalLaboratorystandardinstitution 药敏指南 CLSI CLSI药敏文件 M100 S22常见菌 2012 M11 A7厌氧菌 2007 M39 A3积累抗菌谱 2009 M24 A分枝杆菌 奴卡菌 以及其他需氧放线菌M27 A2酵母样真菌MIC法 2002 M44 A真菌纸片扩散法 2004 M45 A低频分离菌与苛养菌 2006 M100updatedyearly M2 纸片法操作方法 M7 MIC法操作方法 M100 解释标准 作为共识标准即 参考方法 临床实验室通常这样使用使用CLSI方法记录采用其他方法时使用CLSI做参照方法进行比对 更新信息 M2表格扩散法 M7表格MIC法 附录 词汇表I II III CLSIM100 表格 内容 抗生素的测试与报告SIR折点质控 M100 抗生素的测试与报告SIR折点质控 CLSIM100 S22更新信息 CLSIM100 S22GlossaryI Part1 CLSIM100 S22词汇表IPart1 例如 CLSIM100 S22词汇表II例如 我们应该如何测试和报告 CLSIM100 S22 Table1A 点击放大 分组测试与选择性报告 在做药敏时每组中不同类药物只选用一种抗生素用于测试 药理作用特殊者单独测试 这些抗生素称为代表药物 按CLSI规定 由FDA根据抗生素在临床实践中表现出来的安全性 有效性 和医学经济学原则将抗生素分为A B C三组 报告时按照A B C的次序进行报告 关于抗生素分组 A组药物是首选药物 属于最经济有效 最安全的抗生素类别B组是在A组药物无效时 或者感染不单纯需要扩展微生物覆盖范围时选用的药物 耐药性一般较A组药物低 但可能价格较贵或者安全性处于考察期内C组药物是A组和B组药物都耐药时需要选用的备用抗生素 通常用于治疗高耐药菌株和严重的复杂性感染 耐药性最低 但价格昂贵或者安全性差 适合于治疗尿路感染的抗生素被归入U组可考虑选择性应用但其适应症或适用范围不属于常规报告范畴的抗生素归入O组处于考察过程中的某些新药和某些老药在扩展应用范围时归入Inv组 关于代表药物 微生物室选取用于测试和报告的抗生素是可以代表一类抗菌原理相同 抗菌效能相仿 抗菌谱基本一致 并且耐药机制相同的药物 即只需测试一种药物就可以推测出该类药物中其他几种药物的敏感性 在根据药敏结果选用抗生素时只需选用效果相同的即可 关于代表药物 需要注意 代表药物的代表作用只能针对同一类别的微生物 即位于表1A中同一框内的几个药物选取其中一个即可代表该类 或亚类 药物如果一类中有几个药物分别位于不同框中 则说明这几个药物抗菌活性或耐药谱有所不同 需要分别测试 我们如何理解 选择性报告 首先报告窄谱 低毒性 最便宜的药物如果有下列情况 则报告其他药物 对一线药物耐药时 A组药物 分离菌来自特殊部位病人对一线药物过敏或不耐受多种微生物感染混合感染不同微生物导致的多部位感染 铜绿假单胞菌 头孢他啶8S环丙沙星1S庆大霉素2S哌拉西林 他唑巴坦16S MIC g ml 选择性报告例如 GroupB GroupB 阿米卡星8S头孢他啶 32R环丙沙星1S庆大霉素 16R亚胺配能4S哌拉西林 他唑巴坦 128R妥布霉素 16R MIC g ml 选择性报告例如 铜绿假单胞菌 GroupB GroupB GroupB 我们应该使用分级报告规则吗 是 这个规则是经过国际医疗组织众多医务工作者一致通过的是 这将有助于临床医生在开处方时 将范围集中于 窄谱抗生素低毒抗生素廉价抗生素也许不是 如果在我们所在的医疗机构中我们能有更好的办法激励临床医生 谨慎处方 的话 粘质沙雷菌 氨苄西林R头孢唑林R头孢曲松S庆大霉素S亚胺配能R哌拉西林 他唑巴坦S复方新诺明S 报告偶然发现的亚胺配能耐药现象 通常情况下 一般实验室在哌拉西林和头孢曲松测定敏感时 不会报告亚胺配能的结果 多数情况下该药是敏感的 但需要注意如果测定出耐药时 就必须报告 例如 金属酶 修正为R 修正为R CLSIM100表1的解读 注意 方框 的含义 或 字的含义 警告 评述的含义 Rx 评述的含义认真阅读脚注叙述的内容 例如这张幻灯 CLSIM100 S22 Table1A No or or CLSIM100 S22 Table1A 表1对于分组测试与报告推荐药物表格的注释说明 同一框中无 或 字相连 例如 铜绿假单胞菌 亚胺配能美罗培能 每个框中包含的多个药物 测试结果解释 S I R 时类似临床疗效类似并且 只需选择其中一种药物用于测试即可 当然所选的药物在你所在的机构应是恰当的 不能从一个药推导到另一个药 CLSIM100 S22 Table1A 框中有 或 字相连的 例如 葡萄球菌 阿奇霉素 或 克拉霉素 或 红霉素 在一个框中各个药之间有 或 字相连 几乎具有完全相同的交叉耐药和交叉敏感临床疗效也是相同的 可以从一个药推衍到另一个药 CLSIM100 S22 Table1A 或 字相连的应用实例 例如 葡萄球菌 阿奇霉素 或 克拉霉素 或 红霉素 CLSIM100 S22 Table1A 金黄色葡萄球菌 克林霉素S红霉素R苯唑西林S青霉素R万古霉素S MLSb 金黄色葡萄球菌克林霉素应修正为耐药 耐药结果推衍实例 推衍出阿奇霉素及克拉霉素耐药 金黄色葡萄球菌 克林霉素S红霉素S苯唑西林S青霉素R万古霉素S 敏感结果推衍实例 推衍出阿奇霉素及克拉霉素敏感 CLSI 警告 评述 有些药物或复合药物制剂测试结果为 S 但临床治疗无效 禁止根据测试结果就报告 敏感 体外测试敏感但体内无效的药物或药物复合制剂 微生物沙门菌 志贺菌李斯特菌ESBL阳性的肠杆菌 禁止报告 S 一二代头孢头霉菌素氨基糖苷类所有头孢类氨曲南一二代头孢菌素三四代头孢修改折点的除外青霉素类 CLSIM100 S22 Table1A 体外测试敏感但体内无效的药物或药物复合制剂 微生物MRSA MRCNS肠球菌 禁止报告 S 所有 内酰胺类头孢类克林霉素复方新诺明氨基糖苷类 高浓度除外 CLSIM100 S22 Table1A 警告 评述举例 Warning Foroxacillin resistantstaphylococci MRS allpenicillins cephems carbapenems andother lactamssuchasamoxicillin clavulanicacid ampicillin sulbactam ticarcillin clavulanicacid piperacillin tazobactam andimipenemmayappearactiveinvitrobutarenoteffectiveclinically Resultsforthesedrugsshouldbereportedasresistantorshouldnotbereported ThisisbecausemostcasesofdocumentedMRSinfectionshaverespondedpoorlyto lactamtherapy orbecauseconvincingclinicaldatahaveyettobepresentedthatdocumentclinicalefficacyfortheseagents 警告 对于MRS而言 无论你在实验中测得的结果如何 所有 内酰胺类在临床治疗中均是无活性的 应该报告所有的 内酰胺类药物耐药 因为在临床治疗观察中对MRS测试 敏感 的这类抗生素不是反应差就是无令人信服的数据证明其有效性 CLSIM100 S18 观点的历史沿革与发展 Oxacillin resistantstaphylococciareresistanttoallcurrentlyavailable lactamantimicrobialagents withtheexceptionofthenewercephalosporinswithanti MRSAactivity Thus susceptibilityorresistancetoawidearrayof lactamantimicrobialagentsmaybededucedfromtestingonlypenicillinandeithercefoxitinoroxacillin Routinetestingofotherpenicillins lactam lactamaseinhibitorcombinations cephems orcarbapenemsisnotadvised 苯唑西林耐药葡萄球菌 MRS 对除开新型的具有抗MRSA活性的头孢菌素之外的所有 内酰胺类均耐药 对众多 内酰胺类抗生素而言 只需要通过检测青霉素 与苯唑西林或头孢西丁中的任意一个即可预测其他抗生素的敏感与耐药 无须常规测试其他青霉素类 头孢类 复合制剂 碳青霉烯类 CLSIM100 S22 金黄色葡萄球菌 头孢唑林SR 克林霉素R红霉素R苯唑西林R青霉素R万古霉素S 警告 举例 分离自脑脊液中的菌株不要报告这里所例举的任意一种药物 仅仅用于口服的药物一二代头孢菌素 头孢呋辛钠除外 头霉菌素类克林霉素大环内酯类四环素类氟喹诺酮类 CLSIM100 S22 Table1A 尿液中的分离菌 不要报告下列抗生素 阿奇霉素氯霉素克拉霉素克林霉素红霉素报告CLSIM100 S22Table1A中位于U组的抗生素 例如 呋喃妥因 等 CLSIM100 S22 这些药物不通过肾脏排泄 因而在尿液中达不到应有浓度 对感染的治疗无贡献 CLSI Rx 评述 该处评述 或者修订评述 的建议是针对临床医生在处方过程中应该理解并注意的 微生物室应附在报告中提示医生 Rx 评述举例 Rx 利福平在抗菌治疗中不能单独应用 CLSIM100 S22 金黄色葡萄球菌 克林霉素R红霉素R苯唑西林R青霉素R利福平S万古霉素S Rx 利福平在抗菌治疗中不能单独应用 Rx 举例 CLSIM100 S22Table2A解释标准 折点 例如 肠杆菌科细菌 CLSIM100 S22解释标准覆盖的细菌类别 肠杆菌科铜绿假单胞菌不动杆菌属洋葱伯克霍尔德菌嗜麦芽窄食单胞菌其他非肠道杆菌葡萄球菌属肠球菌属 流感嗜血杆菌与副流感杆菌淋病奈瑟菌肺炎链球菌 溶血链球菌草绿色链球菌脑膜炎奈瑟菌厌氧菌 不同细菌适用的药敏方法 部分细菌同时具有扩散法标准和MIC标准 但具有扩散法标准的药物相对较少部分细菌 某些药物 只有MIC标准其他非肠道细菌所有药物葡萄球菌万古霉素 托达霉素肠球菌托达霉素肺链除苯唑西林以外的其他 内酰胺类 溶血链球菌除青霉素 氨苄青霉素 头孢吡肟 噻肟 曲松外的其他 内酰胺类草绿色链球菌除头孢吡肟 噻肟 曲松外的其他 内酰胺类厌氧菌所有药物淋菌只有扩散法和琼脂稀释法 无肉汤稀释法标准 表2中没有列举的抗生素或者目前为止尚无解释标准的抗生素 毫无疑问这些都是不用测试的例如 铜绿假单胞菌对头孢西丁 因为该药对铜绿是没有活性的 只有 S 无 I 或 R 药物的定义 罕见 CLSIM100 S22 表2E 综合评述 7 Forsomeorganism antimicrobialagentcombinations theabsenceorrareoccurrenceofresistantstrainsprecludesdefininganyresultscategoriesotherthan susceptible Forstrainsyieldingresultssuggestiveofa nonsusceptible category organismidentificationandantimicrobialsusceptibilitytestresultsshouldbeconfirmed 对于某些细菌而言 某些抗生素敏感以外的结果是不存在或罕见的 当产生不敏感结果时 其鉴定或药敏结果应该经过其他途径确认 肺炎链球菌 万古霉素MIC g ml 敏感中介耐药万古霉素 1 0 CLSIM100 S22 Table2G 研究任何产生不敏感结果的菌株 重复鉴定药敏 保留菌株 送往参考实验室 用CLSI标准MIC法复核 CLSIM100S22包含的其他信息 特殊耐药机制检测方法推荐给药方案质控方案天然耐药谱不常见耐药表型介绍以及确认方法脆弱拟杆菌抗生素积累敏感性 统计 其他厌氧菌抗生素积累敏感性 统计 质量管理系统简介 少见菌和苛养菌的特殊药敏 参考方法 M45 A乏养菌与颗粒链菌 稀释法嗜水气单胞菌复合群 稀释法与扩散法弧菌属细菌 霍乱除外 稀释法与扩散法芽孢杆菌属 炭疽除外 稀释法空肠 大肠弯曲菌 稀释法与扩散法棒状杆菌 稀释法 可用的药物标准比BSAC标准提供的多 MethodsforAntimicrobialDilutionandDiskSusceptibilityTestingofInfrequentlyIsolatedorFastidiousBacteria Approvedguideline 猪红斑丹毒似菌 稀释法HACEK组苛养性G 杆菌 稀释法卡他莫拉菌 稀释法产单核细胞李斯特菌 稀释法巴斯德菌 稀释法其他 如乳杆菌 片球菌 无色藻菌 稀释法 分枝杆菌 奴卡菌 以及其他需氧放线菌药敏 参考方法 M24 A结核分枝杆菌复合群 比例法缓慢生长非结核分枝杆菌 稀释法快速生长分枝杆菌 稀释法奴卡菌等需氧放线菌 稀释法 SusceptibilityTestingofMycobacteria Nocardiae andOtherAerobicActinomycetes ApprovedStandard 真菌药敏 M27 A2用于酵母样真菌的稀释法药敏 只有氟康唑 伊曲康唑和氟胞嘧啶有解释标准 其他药物的测试结果报告MICM44 A用于酵母样真菌的扩散法药敏 只有氟康唑有解释标准M38 P用于丝状真菌的稀释法药敏 只有操作方法 报告MIC值 但无解释标准 药敏试验质量控制 意义 保障药敏结果的可靠性 准确性和精密度控制环节 重要的五大环节 质控1 人员操作能力质控2 菌液浓度 比浊 质控3 培养基质量质控4 药敏试剂 纸片或MIC试卡 板 读取药敏结果的仪器设备 质控5 异常结果的发现与修正参照指南 CLSI文件 质控1 人员 标准操作指南 扩散法参照CLSI M2文件 MIC法参照M7文件考核内容 基本操作步骤的熟练程度结果的正确读取 人员 操作步骤的熟练程度 按照标准程序操作 能在15分钟内完成单个分离菌的药敏试验操作操作过程 菌落的挑取手法菌液的配制操作与菌液混匀操作扩散法中菌液涂布操作MIC法中菌液的稀释操作仪器法中仪器的标准操作手法菌悬液纯度和浊度的验证性操作 人员 结果的正确读取 抑菌环的正确测量 忽略边缘的微弱生长环内生长的检测 污染菌的发现或耐药亚群的分离确认MIC值的正确读取包括跳孔现象的发现与纠正微弱生长孔的发现与结果修正 磺胺 四环 氯霉素 氨曲南 拖尾现象的正确忽略 磺胺 真菌 生长不良的确认与补救措施 重做 延长 质控2 菌液浊度控制 目测法控制内容 主要是0 5McF浊度的感知能力参照物 0 5McF硫酸钡比浊管 对应1 5 108CFU ml参考方法 菌液稀释后菌落计数法允许误差 1 5 107 1 5 109CFU ml仪器法控制内容 同上校准品 0 5 4McF硫酸钡比浊管参考方法 同上允许误差 同上 质控3 MH培养基质量控制 pH值7 2 7 4营养程度 不加血的情况下就能支持ATCC29212的生长抗生素拮抗剂含量 使用ATCC29212监测 扩散法有抑菌环出现 并且环内只允许微量小菌落出现 MIC法抑菌