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遗传学实验指导山东农业大学遗传学教研室二OO五年目 录实验一 植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察实验二 植物花粉母细胞减数分裂制片技术实验三 植物根尖压片技术实验四 染色体组型分析实验五 基因的分离、独立分配和互作实验六 连锁基因的遗传分析实验七 果蝇的形态鉴别和饲养管理实验八 辐射对植物染色体的诱变作用实验九 植物DNA的提取与定量分析实验十 植物的RAPD分析实验一 植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察一、实验原理减数分裂是性母细胞在分裂形成配子过程中一种特殊的细胞分裂方式。在这个过程中，染色体复制一次，细胞分裂两次，最终形成的配子染色体数目比母细胞减少一半。雌雄配子受精结合后代又恢复正常的染色体数目，从而保持了物种在遗传上的稳定性；同时由于减数分裂中同源染色体的非姊妹染色单体的交换为后代的变异提供了基础。减数分裂包括减数第一次分裂和减数第二次分裂两个连续变化的阶段。每个阶段根据细胞和染色体的变化特点分为前期、中期、后期和末期四个时期。由于减数第一次分裂的前期较长，染色体变化也比较复杂，所以又常常将前期I分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变（浓缩）期。染色体是遗传物质的载体，在减数分裂中的行为对遗传物质的分配和重新组合具有重大影响，因此了解染色体在减数分裂中所表现的特殊变化，可以从细胞学水平加深对遗传学基本规律的理解。本实验通过在光学显微镜下对供试材料永久制片的观察熟悉性母细胞和染色体在减数分裂过程中各个时期的变化特点，对减数分裂的具体过程和意义有深刻的了解。二、实验材料和实验用品玉米、小麦等花粉母细胞减数分裂的永久制片和照片，以及显微镜、擦镜纸等。三、实验内容与步骤利用玉米、小麦等花粉母细胞的减数分裂永久制片，参考减数分裂各个时期的显微照片，在显微镜下进行系统地观察，掌握各个时期的特点。减数分裂各个时期的主要特点简述如下：1前期I（1）细线期：细胞核内开始出现细而长交织成一团的线状物，难以找到两端，无法计数，这是初期形成的染色体。核仁和核膜清晰可见。（2）偶线期：同源染色体配对联会形成“二价体”。由于此时每条染色体已经复制，因此每个二价体包含四条染色单体。由于同源染色体联会的行为在光学显微镜下看不到，并且这一时期时间较短，染色体又很细长，难以同细线期明显区分开来。这一时期核仁和核膜仍清晰可见。（3）粗线期：染色体进一步螺旋化呈粗线状。染色体的个体性逐渐明显。非姊妹染色单体之间的“交换”就发生在该时期，但“交换”的行为不能直接在显微镜下观察到。核仁和核膜在这一时期仍然可以看见。（4）双线期：染色体进一步缩短变粗，每个二价体的一对同源染色体相互排斥，并开始彼此分开。但由于非姊妹染色单体的交换，每个二价体出现了数目不定的交叉结使二价体仍然维持在一起而不完全分开。该时期核仁和核膜仍然可见。（5）终变期：染色体高度浓缩，交叉结端化，每个二价体只在末端相连，核仁和核膜仍然可见。此时所有二价体分散在整个核内，可以进行染色体计数，某生物有多少对染色体此时就有多少个二价体。2中期I：核仁和核膜的消失，标志着前期的结束，中期的开始。此时，所有二价体排列在纺锤体的赤道面上。每个二价体两条染色体的着丝点分别趋向纺锤体的不同极。如果从纺锤体的一极向赤道面观察，仍可计数染色体。由于一对同源染色体两个成员的着丝点朝向细胞的哪一极完全是随机的，因此在不同性母细胞中，此期染色体的排列具有多种可能性。3后期I：每个二价体的两条染色体都以着丝点为先导，由纺锤丝牵引分别向细胞的两极移动。结果细胞的每一极只分到了一对同源染色体中的一条，从而使每一极分到的染色体数只有原来的一半。此时分到每一极的每条染色体的两条姊妹染色单体仍然由共同的着丝点连在一起。4末期I：染色体到达细胞两极后，细胞的每一极又重新形成核膜和核仁，随之胞质分裂（有的植物此时胞质不分裂），形成两个子细胞，称为“二分子”。减数第一次分裂结束后，经过一个短暂的间期，很快进入减数第二次分裂，第一次分裂是染色体数目减半的过程。5前期II：细胞核内又重新出现染色体。每个染色体的两条姊妹染色单体仍由同一个着丝粒连在一起，但两臂已彼此分开。6中期II：每个子细胞内的染色体都以自己的着丝点排列在细胞的赤道面上，染色单体的两臂自由地散开。7后期II：每条染色体的着丝点纵裂，两条姊妹染色单体在两极纺锤丝的牵引下，相背移向两极。8末期II：染色体分到两极后，细胞的每一极又重新形成核仁和核膜，然后胞质分裂。整个减数分裂过程使原来的一个母细胞分裂成四个子细胞，每个子细胞内只含有母细胞染色体数目的一半。分裂刚完成时四个子细胞彼此靠在一起，称为“四分子”。四、思考题1玉米的体细胞中有10对染色体，中期时可能的排列方式有多少种？2以玉米为例说明在减数分裂过程中，染色体数目怎样从2n=20变为n=10。五、作业绘制减数分裂粗线期、终变期、中I、后I、中II、后II的图像。实验二 植物花粉母细胞减数分裂制片技术一、实验原理减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂，它包括连续两次的细胞分裂，第一次分裂是减数的，第二次是等数的。第一次分裂的前期较长，染色体变化较复杂，可细分为5个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。染色体在减数分裂的行为对遗传物质的分配和重组产生重大影响。高等植物在形成雄配子的过程中，花药内的小孢子母细胞（2n），经过减数分裂最终产生四个小孢子。每个小孢子内的染色体数目已减半为n。以后每个小孢子进一步发育为花粉粒。由于植物花药取材容易，操作方便，一般作为减数分裂制片材料。在适宜的时期采集植物的花蕾，经固定液杀死固定，使细胞保持活体时形态。然后进行压片染色等处理，制成减数分裂玻片标本，在显微镜下进行观察，可以看到小孢子母细胞的减数分裂过程（即染色体由双倍变为单倍体的过程），研究染色体在形态和数量上的动态变化特点。二、实验材料和实验用品1实验材料 玉米雄花序2实验用品显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、酒精灯、吸水纸、纱布、刀片、滤纸、火柴、等。3实验药品无水乙醇、95%乙醇、重铬酸钾、浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸、二甲苯、加拿大树胶和洋红（或苏木精）。三、实验方法与步骤1取材：选取适当大小的花蕾，是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。不同植物取材时期不同。玉米：在抽雄前两周左右（大喇叭口期），用手指从喇叭口处向下挤捏叶鞘，触到有松软感处，即是雄花序所在部位。在该处用刀片纵向划一切口，用镊子取出花序分枝。此时雄花序先端小穗颖长4mm左右，花药长23mm，每一分枝中上部小穗发育最早。取材时间一般在上午9时10时，不同材料间稍有差异。2固定：取下的材料应立即放入固定液中杀死固定。在415条件下，一般固定时间为24小时。固定后的材料先用95%酒精漂洗至无醋酸气味，再移到70%酒精中置于冰箱内保存。常用的固定液是法氏固定液，在使用这种固定液时应注意现配现用，固定时不要在阳光下暴晒。3染色和压片：先将已固定的材料置于培养皿内并倒入少许保存液。用镊子摘取一个适当大小的小穗或花蕾放在吸水纸上吸掉多余的酒精，然后放在载玻片中央。用解剖针挑出23个花药，并立即滴醋酸洋红或醋酸铁矾苏木精染色液于花药上。用解剖针将花药横向切断，并从一端向切口轻轻挤压花药，使花粉母细胞从切口处逸出。然后用镊子除尽花药壁等杂物。这是压片优劣的关键步骤之一，如不去净残渣，则不容易把分裂的细胞压平，使染色体不容易分散开，并且在制作永久片的过程中，细胞会从载玻片上大量脱落。去净残渣后，在低倍镜下进行初步镜检，如果花粉母细胞处于减数分裂时期，即可加上盖玻片。加盖玻片时，先使盖玻片的一边放在载玻片上，待染液布满整个边缘时，左手握镊子顶住盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片轻轻放下。加上盖玻片以后，如有多余染色液，可用吸水纸吸去；如染色液不能布满盖玻片，则在盖玻片一边稍加染色液，然后在酒精灯上烤片。烤片时，用手平持片子在酒精灯上方来回移动，并经常将片子放在手背上试温，以片子不烫手为宜，可反复进行多次。烤片是制片过程中的一项很重要的步骤。通过烤片可使细胞质颜色变浅，而染色体能得到充分鲜明的着色。烤片以后可在盖玻片上加一小块吸水纸，以拇指或用带橡皮头的铅笔轻压盖片。应注意不要使盖片移动。如果镜检发现染色体染色太浅，可在盖玻片周围稍加染色液再烤；如果染色太深，可从盖玻片一边滴加45%冰醋酸，在另一边用吸水纸吸，让冰醋酸从盖玻片下流过直至细胞质颜色较浅而染色体着色明显清析为止。4制作永久片：要使片子能长期保存应用，可制成永久片。永久片的制作主要包括分片、脱水透时和封片三个步骤。首先用培养皿（内置U型玻璃管或一根短玻棒）若干套编号，配制多级脱水剂（常用脱水剂见附录二）。（1）分片：准备制成永久片，首先使其翻转让盖玻片朝下浸入第一级培养皿内分片。让载玻片的一端搭在短玻棒上，另一端和皿底接触，使盖玻片自然脱落，并标记载玻片和盖玻片原来相对应的方向和位置。（2）脱水透明：用一端劈开的去磷头火柴棒夹住盖玻片（方向不变，材料朝上），放入第二级培养皿中。而载玻片要翻转使有材料的一面朝上。然后依次逐级脱水，一般每级约12分钟。如用第三种脱水剂每级约2030秒钟。为了防止在脱水过程中细胞从片上脱落，在制片时可先在盖玻片上涂一层蛋白甘油胶，在酒精灯上烘烤至冒出轻烟后，稍凉片刻盖在有材料的载玻片上。（3）封片：片子从最后一级培养皿内取出后稍凉，于载玻片上原来加盖玻片的位置中间滴一滴完整的加拿大树胶，然后翻转盖玻片（使有材料的一面朝下），按原来的方向和位置轻轻盖在树胶上。要使盖玻片随着胶的扩展自然下沉，不要施加压力或移动盖玻片。然后平放在阴凉处晾干再镜检。对于镜检符合要求的片子，在载玻片右端贴上标签，注明标本名称，制片日期。附冷冻分片法：这种方法快速简单。对准备制作永久片的玻片，先用液态二氧化碳干冰冷冻，或用冰冻致冷器进行冷冻，待完全冷冻结冰后，用刀片将盖玻片同载玻片分开，将载玻片和盖玻片放在37左右的温箱内烘干。取出后放在二甲苯内浸泡1020分钟，滴加树胶封片即可。四、作业和思考题1写出制片步骤流程图。2制作两张质量较好的临时片（有条件可制作永久片），并绘出自己所制作片子的分裂相，说明其时期和特点。实验三 植物根尖压片技术一、实验原理有丝分裂是植物细胞分裂、体细胞增殖的主要方式，在有丝分裂过程中，细胞核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中，使子细胞和母细胞具有同样数目和形态结构的染色体，保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间分生组织、愈伤组织等，细胞常进行着旺盛的有丝分裂。在细胞分裂的适当时期取材，通过对供试材料进行一定的处理，就可以在显微镜下观察染色体的变化特点和染色体的形态特征，并进行染色体计数。由于在有丝分裂的中期染色体具有典型的形态特征，并易于计数，因此为了获得更多的中期染色体图像，可以采用药物处理或冰冻处理的方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。同时通过处理还可使染色体缩短，易于分散，便于进行观察研究。另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酶处理除去细胞之间的果胶层，并软化细胞壁，使细胞容易彼此散开，有利于压片和染色。二、实验材料和实验用品1材料：圆葱、大蒜、黑麦、玉米、小麦和蚕豆。用品：显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、滤纸、量筒、培养皿、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签等。多媒体系统（附显微演示）。2药品：无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8羟基喹啉、1mol/L盐酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶混合液。三、实验内容和实验步骤1取材：可在室内培养根尖，也可以直接从田间挖取刚长出的幼嫩根尖。室内培养的方法是：（1）圆葱和大蒜根尖：发根前先将圆葱以根部向上在光下晒两天，然后置于盛清水的小烧杯口上，使根茎部与水接触,或将圆葱半埋于湿沙内。在2025光照条件下培养23天，待根长12cm时，选健壮根自尖端约1cm处剪下备预处理用。大蒜作材料可先将蒜瓣扒去皮，然后用细铁丝串起放在盛清水的培养皿内培养，其它要求同上。剪取根尖的时间以上午10时左右为好。（2）玉米（或黑麦、小麦、蚕豆）根类：先将种子浸泡一天，待吸水膨胀后再转移到铺有几层滤纸（或吸水纸）的培养皿内，加水湿润，然后将种子均匀地摆放在滤纸上，盖上盖。放在1820黑暗条件下培养，待根长到12cm时，选健壮根尖于上午10时左右取下备用。田间从植株上直接取根的方法适用于大部分禾本科植物，例如在麦类作物生长季长出的大量不定根，比种子萌发的根更健壮，是观察有丝分裂的很好材料。2预处理：为了阻止纺锤体的活动，获得更多的中期分裂相，同时使染色体相对缩短，便于染色体分散和计数，可对根尖进行预处理。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态，可以不进行预处理。预处理的方法有冰冻预处理和药物预处理两种。（1）冰冻预处理：将根尖浸泡在蒸馏水中，置于14冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻24小时。这种方法对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，效果良好，简便易行，各种作物都适用。（2）药物预处理：常用的药物有0.050.2%秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8羟基喹啉等。预处理时，将根尖直接浸泡在药液中，在适宜的温度下处理一定的时间（表1）。这些药物都能使染色体缩短，但同时对染色体也有一定破坏作用。使用时应注意处理的时间，小麦、黑麦、大麦、圆葱和大蒜等处理4小时左右，棉花和水稻等处理2小时左右。处理的时间长短同温度有很大关系。表1 常用药液预处理时间药 品条 件圆 葱玉 米小 麦0.1% 秋水仙素溶液温度（）15室温25处理时间（小时）432饱和对二氯苯溶液温度（）室温室温处理时间（小时）440.002mol/L 8羟基喹啉温度（）18室温处理时间（小时）43固定或前低渗：固定的目的是利用化学药品将生活细胞迅速杀死，并使构成染色体的核蛋白变性和沉淀，以保持染色体的固有形态和结构。固定液一般采用卡诺氏固定液，配配制方法为无水酒精：冰醋酸3：1，也可用95 乙醇代替无水乙醇。操作时将预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次（约5分钟），然后转移到卡诺氏固定液中。在415条件下固定2024小时，即可进行观察。如果需要长期保存，可先用70%酒精冲洗2次然后转入70%酒精中保存。4解离：解离的目的是使细胞壁之间中层的果胶物质以及部分细胞质分解，而使细胞易于分散。同时也可使细胞壁适度软化而易于压片。解离的方法主要有以下几种。（1）将根尖用蒸馏水冲洗2次，然后放入已经在60水浴锅中预热的1mol/L盐酸中。在60恒温条件下处理1015分钟，当根尖透明呈米黄色时取出。（2）将根尖置于95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理210分钟。或将根尖放在5ol/L盐酸内处理510分钟。（3）将根尖置于2.5%果胶酶和2.5%纤维素酶等量混合液中（PH 55.5），在室温1828条件下处理23小时。5后低渗：将根尖放在蒸馏水中冲洗23次（约10分钟）。酶解后的根尖可浸泡10分钟，然后再冲洗一次。根尖一定要冲洗干净，否则影响染色。低渗后的根尖放入70%酒精中备用。6染色与压片：染色与压片的方法常用的有以下几种。（1）醋酸洋红染色法：取一根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在一张干净的载玻片中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片（越薄越好），滴1滴2% 醋酸洋红染色液，盖上盖玻片，进行压片。压片时用一手固定盖玻片，另一手用镊尖或解剖针柄轻敲盖玻片，使材料溃散。用火轻烤载玻片背面，然后继续轻敲，待材料呈云雾状即可镜检。加热的目的是使染色体充分染色和软化，以及破坏细胞质的染色。如发现有较理想的分裂相，可再轻烤一下片子，然后在盖玻片上盖一张吸水纸，用大拇指用力压片（不可使盖玻片移动），然后镜检。也可以采用十字交叉压片法。即：取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在干净的载玻片中央。用刀片将分生组织切下，将其切成薄片。取另一张干净的载玻片，呈十字形交叉盖在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸，并用大拇指压片，使材料压成一薄层。然后将两载玻片分开，各滴加1滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片，在酒精灯上轻烤一下片子，一手固定盖玻片，另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打，使根尖细胞分散均匀。（2）改良卡宝品红染色压片法：将根尖置于干净的载玻片中央，切下根尖分生组织，将其切成薄片，滴一滴改良卡宝品红染色液，盖上盖玻片压片。（3）铁矾苏木精染色压片法：先将根尖放入4%铁矾水溶液中媒染24小时。然后流水冲洗20分钟，再将根尖放入0.5%苏木精染液中避光染色40120分钟，取出后放入蒸馏水中备用。其制片方法，取一染色后的根尖放在干净载玻片的中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片（越薄越好），滴1滴45%冰醋酸，加盖玻片，具体压片方法同上。7镜检：压好的片子先在低倍镜下镜检，找到分裂细胞后转换高倍镜观察。如果染色体分散较好，图象清晰，就可以脱水封片，制成永久片。四、思考题和作业1在你所观察的根尖中，哪些分裂时期最多，为什么？2解离的目的是什么？固定液的作用是什么？3对于一些不易取到根尖的材料，如何观察它们的有丝分裂和染色体数目？4制作两张合格的有丝分裂玻片。5绘出在显微镜下观察到的各期有丝分裂图象。实验四 染色体组型分析一、实验目的分析植物细胞有丝分裂中期染色体数目、大小、着丝粒位置和随体等形态特征，学习染色体组型分析的方法。为物种起源和进化提供依据，为遗传育种研究提供细胞学证据。二、实验原理各种生物染色体的形态，结构和数目都是相对稳定的。每一生物细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析也称核型分析。通过一定的方法制得染色体有丝分裂的玻片标本，经显微照相，冲洗放大等步骤获得染色体照片。从染色体玻片标本和染色体照片的对比分析，进行染色体分组，并对组内各染色体的长度，着丝点位置，臂比和随体有无等形态特征进行观测和描述，从而阐明生物的染色体组成，确定其染色体组型，这种过程称为染色体组型分析。三、实验材料蚕豆（Vicia faba, 2n=12），洋葱（Alliums cepa, 2n=16），大麦（Hordeum sativum 2n=14），黄麻（Tiliaceae Corchorus, 2n=14）。四、实验仪器及用具显微镜，显微照相系统，相片冲洗放大整套设备，目镜测微尺，镜台测微尺，4放大纸，135黑白胶卷，计算器，透明尺，剪刀，坐标纸，胶水以及制作有丝分裂玻片所需的用具。五、药品和试剂制作有丝分裂玻片所需的药品和试剂（见实验一）以及显微摄影冲洗放大所需的药品和试剂：米吐尔，无水亚硫酸钠，几奴尼（对苯二酚），无水碳酸钠，溴化钾，硫代硫酸钠，硼酸，钾矾（硫酸铝钾），28醋酸六、实验方法与步骤（一）染色体标本玻片的制作染色体组型分析一般用有丝分裂中期的分裂细胞，通常采用植物根尖细胞。有丝分裂中期的染色体具有典型的形态特征，便于进行分析，具体制作方法见实验一。（二）镜检和测量当染色体玻片制好后，放在显微镜下观察，选出符合染色体组型分析要求的细胞，这些细胞是处于有丝分裂中期，染色体分散良好，没有重叠，数目完整，随体和着丝点明显，没有断裂，着色鲜明，形态清晰，且各条染色体处于同一平面上。选择染色体较平直的一条或几条，用目微尺（目镜测微尺）测量其长度。（三）显微照相、冲洗和放大将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行显微照相（可用10100倍的油镜），然后冲洗，选取图像清晰的底片，放大、洗印出染色体形态清晰的照片。在显微照相的同时，对镜台测微尺进行同样倍数（油镜10100倍）拍摄，放大，然后根据照片上的实际长度，计算放大倍数。（四）测量和计算染色体的照相长度 1测量在放大的照片上用透明尺准确地量出各条染色体的总长度和每条染色体两臂的长度（分别量到着丝点的中部），并将结果填入表15。随体的长度可计入或不计入染色体长度之内，但应注明。染色体弯曲不能用直尺测量时，可先用细线量取染色体相等的长度，再用尺量出细线的相应长度。2计算：（1）放大倍数的计算：计算放大倍数是利用在显微镜下直接测得的某平直染色体的实际长度（），除以放大照片上的相应染色体的照相长度（）。（2）绝对长度计算：（3）相对长度的计算（4）臂比的计算（五）染色体形态测量数据表染色体序号放大相片长度（mm）绝对长度（）相对长度臂比染色体类型备注长臂短臂全长长臂短臂全长123456789101112（六）剪贴和配对将放大照片上的各条染色体剪下，根据目测和染色体的相对长度、臂比、着丝粒位置、次缢痕的有无和位置、随体的有无和形态大小等特征，进行同源染色体配对。（七）排列和粘贴将配对好的染色体按照由大到小的顺序依次排列起来。排列时把各对染色体的着丝粒排在一条直线上，并且使短臂在上，长臂在下。等长的染色体，把短臂较长的染色体排在前面。随体染色体排在最后，性染色体和额外染色体单独排列。已排好的同源染色体按染色体编号先后顺序粘贴在绘图纸上，粘贴时着丝粒要处在同一直线上。（八）分类根据着丝点的位置，确定染色体的形态类型，臂比是反映着丝点在染色体上的位置。臂 比染色体类型符号1.0正中着丝粒染色体M1.01.7中着丝粒染色体m1.73.0近中着丝粒染色体sm3.07.0近端着丝粒染色体st7.0以上端着丝粒染色体t具随体染色体（sat）用*标出。（九）绘图和翻拍将剪贴排列的染色体组型图用座标纸绘制成染色体模式图并进行翻拍。七、实验作业1. 提交植物染色体组型剪贴图2. 植物染色体组型的模式图3. 染色体形态测量数据4. 简述本实验的染色体组型结果。实验五 基因的分离、独立分配和互作一、实验原理孟德尔定律包括“分离定律”及“独立分配定律”。根据分离规律，位于一对同源染色体上的一对等位基因在减数分裂形成配子时，要彼此发生分离，互不干扰地分到不同的配子中去。因此对于一对基因的杂合体，在完全显性条件下，其自交子代和测交子代的表现型分离比例分别为3:1和1:1。独立分配规律（自由组合规律）进一步揭示了位于非同源染色体上的多对独立遗传基因分离和组合的关系。按照这个规律，位于非同源染色体上的两对基因在减数分裂的过程中，每一对基因都分别按照分离规律进行分离，两对基因之间又可以发生自由组合，结果产生的四类配子比例相等。因此对于两对基因的杂合体，在完全显性条件下，其自交子代和测交子代的表现型分离比例分别为9:3:3:1和1:1:1:1。基因互作研究的是位于非同源染色体上的两对或两对以上独立遗传共同控制一对相对性状的基因，互作的方式有互补、重叠、积加、上位、抑制作用等。上述互作方式尽管表现型的分离比例不同，但基因分离和组合仍然遵循独立分配规律。玉米曾经是遗传学研究的重要材料，籽粒性状的遗传是玉米遗传研究的一项基本内容。通过具有各种籽粒相对性状的玉米杂交，对于籽粒进行遗传分析，有助于我们对分离、独立遗传规律和不同的基因互作方式更深入的理解。玉米籽粒由果皮、胚乳和胚三部分组成（如图所示）。它们的世代和遗传基础都不相同，果皮是由子房壁形成的果皮和珠被形成的种皮愈合而成，是母体组织的一部分，为二倍体（2n），基因型与母本相同。胚乳和胚是双受精产物，胚为二倍体（2n），胚乳是三倍体（3n），分为糊粉层和淀粉层。果皮、糊粉层和淀粉层均呈现一定的颜色，最终影响籽粒的颜色。图 玉米种子外形和解剖图玉米糊粉层色素的形成涉及以下几对基因：花青素基因 Alal、A2a2、A3a3；糊粉粒色基因Cc、Rr、PrPr以及色素抑制基因Ii所控制。这几对基因控制籽粒颜色的机制为：只有当显性基因Al、A2、A3、C、R同时存在、而抑制基因又呈隐性纯合ii时，色素才能形成；而色素形成的类别是由Prpr决定的，当显性基因Pr存在时，呈现为紫色，当隐性基因纯合prpr存在时则表现为红色。当显性基因A1、A2、A3、C、R中缺少任何一个或所有这些色素基因均为显性，但当显性抑制基因I存在时，均表现为无色。淀粉层的颜色有黄色与白色之分，黄对白为显性，受一对等位基因的控制。上述与胚乳的糊粉层和淀粉层有关的性状常表现花粉直感现象。直感现象是显性性状在籽粒上的一种表现，当父本花粉含有显性基因时，它所控制的性状在当代杂种的籽粒上就可能表现出来，而果皮则因与受精无关故不表现直感现象。二、实验材料与实验用品杂交处理后的不同类型的玉米果穗、计算器。三、实验内容与步骤 取不同杂交组合的玉米果穗，分别观察、统计不同表现型籽粒的数目，将统计结果填入第四项实验结果计算中的表格。1一对遗传性状的分析：紫色白色杂交后代F1自交果穗和测交果穗。2两对独立遗传性状的分析： 紫色饱满白色皱缩籽粒的玉米杂交F1自交果穗。3基因互补作用的遗传性状分析： 紫色白色籽粒的玉米杂交F1自交果穗。四、实验结果计算1将一对遗传性状的分析结果填入表1，并说明实际观察结果与理论推断是否符合。表1 一对遗传性状的分析结果表项目表现型果穗观察值（O）理论值（E）OE（OE）2/EX2=（OE）2/EP值（与0.05比较）自交测交2将两对独立遗传性状的分析结果填入表2，并说明实际观察结果与理论推断是否符合。表2 两对独立遗传性状的分析结果表 项目表现型果穗观察值（O）理论值（E）（OE）（OE）2/EX2=（OE）2/EP值（与0.05比较）自交果穗3将基因互作的分析结果填入表3，并给出合理解释。表3 基因互作性状分析结果表项目表现型果穗观察值（O）理论值（E）(OE)（OE）2/EX2=（OE）2/EP值（与0.05比较）显性互补五、思考题1基因型为AaBbCcDd（各对基因独立遗传，显性完全，无互作）的个体自交后代中与亲本表型完全相同的占多大比例？与亲本基因型完全相同的占多大比例？2在玉米粒色的遗传中，一个基因型为CcPrpr的个体自交后代的表型和比例如何？IiCc个体自交后代表型如何？实验六 连锁基因的遗传分析一、实验原理连锁遗传规律阐明了位于一对同源染色体上的连锁遗传基因分离和组合的关系。由于连锁遗传基因在分离和组合过程中的相互影响，致使杂合体所产生的各类配子比例不等，其自交和测交子代表现型的分离比例也因重组率的不同而异，但总是重组型少、亲型多。由于基因在杂色体上的位置和距离不同，基因之间的连锁强度也不相同。基因在染色体上的相对距离可以用重组率表示。决定玉米胚乳性状的某些基因有连锁遗传现象，可以采用两点或三点测验法获得分离果穗，然后通过对籽粒性状的观测分析求得重组率，从而获得基因在染色体上的排列顺序和遗传距离。已知控制果蝇某些性状的基因位于X染色体上，雄果蝇的Y染色体上不带有同X染色体上相对应的基因。因此，在雄果蝇中表现为完全连锁遗传。通过野生型和突变型果蝇杂交，再使其杂种同隐性纯合亲本测交，根据对测交子代的分析也可以确定基因的位置和距离。二、实验材料和实验用品1材料：玉米紫色、饱满籽粒自交系与褐色、凹陷籽粒自交系的杂种一代（F1）果穗以及杂种一代（F1）同褐色、凹陷亲本的测交果穗；野生型和具有白眼（w）、小形翅（m）、卷刚毛（sn）的突变型果蝇。2用品：双筒解剖镜、放大镜、解剖针、计算器、粗头毛笔、白瓷板、培养瓶、麻醉瓶等。3药品：乙醚。三、实验方法和实验步骤1玉米胚乳性状连锁基因重组率的测定：当两对基因为连锁遗传时，F2和测交子代的分离比例明显不同于独立遗传，表现为亲型个体数明显多于理论值，而重组型个体数明显少于理论值。可见重组型的产生并不是非同源染色体自由组合的结果，而是同源染色体上连锁基因间发生交换重组而产生的。在玉米中，决定糊粉层色泽紫色与褐色、籽粒形状饱满与凹陷的基因都位于第九染色体上，表现为连锁遗传。使紫色、饱满（BzSh/BzSh）的个体与褐色、凹陷（bzsh/bzsh）个体杂交，F1为紫色、饱满（BzSh/bzsh）。使其与隐性亲本测交，根据测交后代的表现型种类和比例就可以确定这两对基因间的距离。（1）观察杂合体（BzSh/bzsh）同隐性亲本的测交果穗，区别不同的表现型，计数各类籽粒的数目。（2）计算bzsh之间的重组率。（3）将连锁遗传的分析结果填入表1。表1 玉米果穗两对性状连锁遗传分析结果表表现型总数基因型观察数重组率（%）2果蝇连锁基因的三点测验（1）使白眼、卷刚毛、小形翅突变型处女蝇与野生型雄蝇交配，每瓶5对。待化蛹后除去亲本成蝇，羽化后鉴定杂种蝇。F1的雌蝇应该为红眼、直刚毛、长翅，而雄蝇表现为白眼、卷刚毛、小形翅。（2）将F1雌蝇同突变型雄蝇交配，78天后移出亲本蝇，以测交子代成虫出现开始，每两天观察一次，将结果填入表2。（3）分析计算根据实验结果确定三对基因的遗传关系。即三对基因是独立遗传还是连锁遗传，或一对独立两对连锁。确定各类交换类型和亲型。确定三对基因的排列顺序，分析双交换类型，如果有两对性状出现了还原为亲本的组合类型，则决定第三对性状的基因必在中间。计算重组率：表2 果蝇三对性状连锁遗传分析结果表类别基因型表现型个体数每组合计每组占总数%交换情况亲型+红眼直刚毛长翅wsnm白眼卷刚毛小翅单交换Iw+白眼直刚毛长翅+snm红眼卷刚毛小翅单交换II+m红眼直刚毛小翅wsn+白眼卷刚毛长翅双交换w+m白眼直刚毛小翅+sn+红眼卷刚毛长翅绘制连锁图：以1%作为一个距离单位，按照基因的排列顺序，绘出连锁图。四、思考题和作业1相引相和相斥相杂交后代计算交换值有何不同?2将玉米和果蝇的实验结果写成实验报告。实验七 果蝇的形态鉴别和饲养管理一、实验原理普通果蝇（Drosophila melanogaster）在分类上属昆虫纲、双翅目、果蝇属。它作为遗传学研究的材料是因为它具有以下几个优点：1饲养简单：凡能发酵的东西都可以作为饲料。2生活周期短，繁殖快：在25时由卵到成虫只需10天左右，并且易于获得较大的后代群体。一对果蝇交配后可以产生400500个甚至上千个卵。3染色体数目少（2n=8）：第一号染色体为性染色体，第二、三号染色体是两对近等臂染色体，第四号是粒状染色体。 4能够经常见到突变个体，且多为形态性状突变，比如白眼、残翅、黑檀体等，易于观察。5幼虫的唾腺染色体具有体细胞联会的特点，并且唾腺染色体是一种巨型多线染色体，可比正常染色体大100200倍。在普通光学显微镜下就能看到染色体上具有不同的带纹，是研究染色体结构变异的好材料。由于果蝇的以上特点使其在现代生物学研究中已成为一种模式生物，对于它的发育、基因组结构等的研究已经日益深入。所以，掌握果蝇的饲养管理以及形态鉴别对于利用该类模式生物进行遗传学研究必不可少。二、实验材料与实验用品饲养的野生果蝇和几种常见突变型果蝇、双筒解剖镜、放大镜、镊子、解剖针、麻醉瓶、培养瓶、白瓷板、粗头毛笔、乙醚、70%酒精、琼脂、玉米粉、蔗糖、酵母（新鲜的或干粉）等。三、实验内容与步骤1果蝇的饲养管理培养时多使用广口瓶培养，在装培养基前要进行高温灭菌处理。酵母菌是果蝇的主要食物，凡能发酵的物质都可以用来培养它。几种饲料配方见表1，其中常用的为玉米饲料。表1 果蝇饲料配制表类 型 原 料玉米饲料米粉饲料香蕉饲料水（毫升）15010050琼脂（克）1.521.6蔗糖（克）1310香蕉浆（克）50玉米粉（克）17米粉（克）8麸皮（克）8酵母粉（克）1.41.41.4丙酸（毫升）110.51下面以玉米饲料为例，说明果蝇培养基的配制方法。按配方将琼脂破碎放入约为总量2/3的水中煮溶，加入蔗糖搅拌溶解煮沸，将玉米粉同余下的1/3水调成糊状倾入正在煮沸的琼脂蔗糖液中并不断搅拌，煮沸几分钟直到成粘稠均匀的糊状为止。然后加入丙酸和酵母搅匀分装到已经灭菌的培养瓶中，每瓶12 cm厚即可。装饲料瓶时应注意避免饲料沾到瓶口和瓶壁上。待饲料冷却后，用酒精棉球擦干净饲料瓶内壁，再插入消毒后的吸水纸（纵向折叠或卷成筒状插入，便于成虫栖息和幼虫化蛹），最后用灭菌的纱布棉塞好瓶口备用。当饲料瓶装好后，最好过12天再移进果蝇。在果蝇的饲养过程中应避免日光直晒，当瓶内果蝇繁殖到相当数量后，或饲料发霉干枯时应及时将果蝇转移。对于留种的果蝇原种可放在1015条件下培养，使生活周期加长，减少转移次数，并且注意防止混杂。2果蝇的生活周期观察果蝇的一生经过卵一幼虫一蛹一成虫四个阶段。生活周期的长短受温度影响很大，一般以2025为适宜。当温度低于10时，生活周期延长，而且生活力明显下降。温度高于30时则引起不育和死亡。生活周期与饲养温度的关系可见表2。表2 果蝇生活周期时间表温 度 时 期10152025卵幼虫8天5天幼虫成虫57天18天6.3天4.2天在25条件下，果蝇各发育阶段所需时间大致是：羽化成虫12小时后交配，2天产卵（培养基表层），1天一龄幼虫，1天二龄幼虫，1天三龄幼虫，3天化蛹（贴在瓶壁上），34天成虫（成虫可活15天左右，低温时可活一个月左右）。3形态观察（1）转移和麻醉为便于细致地观察或鉴别并为以后的自交实验打基础，需要将果蝇进行麻醉处理。麻醉时可使用专用的麻醉瓶（注意不可直接在培养瓶内麻醉），也可以用适当大小的广口瓶代替，用纱布包裹棉团作塞子。转移时，先取下麻醉瓶塞，然后取过培养瓶，轻拍瓶壁，使果蝇落在培养瓶底部，用右手两指取下培养瓶的棉塞（夹在指间不要放下），迅速把麻醉瓶口同培养瓶口严密对接。用左手握紧两瓶接口翻倒过来，使培养瓶在上，麻醉瓶在下，右手轻拍培养瓶将果蝇震落麻醉瓶内，迅速盖好两个瓶塞。也可以使培养瓶在下，麻醉瓶在上，去塞对接瓶口后用黑纸遮住培养瓶，使果蝇因趋光而移入麻醉瓶，当达到一定数量后迅速将两瓶口盖好。当果蝇进入麻醉瓶后，轻拍瓶壁并迅速取下瓶塞，在瓶塞上滴35滴乙醚（注意乙醚不要直接滴到瓶内），然后迅速塞紧瓶口。在经过大约半分钟果蝇便被麻醉。果蝇被麻醉后，可将其倾倒在用酒精擦过的白瓷板上进行观察鉴别。观察过程中如果发现果蝇开始苏醒，可用一张吸水纸滴加几滴乙醚放在培养皿内，然后将培养皿盖住，果蝇将再次被麻醉。如果观察的果蝇还要继续培养利用，应注意不要将其麻醉过度，如果蝇翅外展同身体呈45角则表明已麻醉致死。麻醉观察后的果蝇如再培养可先将培养瓶平放桌上，取下瓶塞，在果蝇苏醒前用粗头毛笔将其转移进瓶内。应注意可先将果蝇放在倾倒的瓶壁上，然后塞好瓶口待其苏醒后再将培养瓶竖起（防止果蝇粘在培养基上导致死亡）。（2）性别鉴定：成虫的雌雄鉴别很明显，可以用放大镜或直接进行观察鉴别。它们的主要特点如表3所列。表3 雌雄果蝇性状比较表观察性状雌蝇雄蝇体型较大较小腹部性状似椭圆形，较膨大，末端尖似圆筒状，末端钝圆腹部背面5条黑色条纹3条黑色条纹，前两条细，后一条宽而延伸至腹面，呈一明显的黑斑腹部腹面6个腹片4个腹片第一对前足无性梳有性梳一般只需用肉眼对体型和上述腹部的三个特点进行观察，就可以把雌雄区别开。但是对刚羽化出的成虫或个别难以区别的成虫有时必须用解剖镜观察性梳的有无。所谓性梳（Sexcombs）是指雄性果蝇第一对足的跗节基部的一撮黑色鬃毛状物。雌、雄果蝇的外部形态及雄蝇的性梳见图1、图2。图2 雄性果蝇性梳左：雄性果蝇左前足 中：雄果蝇左前足跗节基部的性梳 右：雌果蝇左前足跗节基部无性梳1基节2转节3腿节4胫节5跗节 图1 雌（右）雄（左）果型外部形态（3）几种常见突变型的观察：实验用的突变果蝇常见类型及其形态特征见表7。表4 果蝇常见类型及其形态特征名 称基因符号性状特征白眼（White）w复眼白色棒眼（Bar）B复眼横条形，小眼数少黑檀体（Ebony）e身体呈乌木色，黑黑体（Black）b体黑色比黑檀体深黄体（Yellow）y全身呈浅橙黄色残翅（Vestigial）vg翅明显退化，部分残留，不能飞焦毛（Singed）sn刚毛卷曲如烧焦状四、思考和作业题1配制果蝇培养基时有哪些需要注意的问题？2果蝇的性梳有何作用？3绘制雄果蝇性梳。4比较雌、雄果蝇的区别。实验八 辐射对植物染色体的诱变作用一、实验目的通过对植物的辐射，了解物理因素对遗传物质的诱变作用。二、实验原理物理射 线的电离辐射，具有非常短的波长以及相应的较大频率，其穿透力很大，在空气中-射线，射程可达几百米，速度为30万公里/秒。因此，对植物给予一定剂量的照射，很容易引起基因突变和染色体畸变，常见的有染色体粘着，着丝点区域断裂，破坏纺锤丝形成，染色体或染色单体的断裂等细胞学现象。可通过细胞分裂观察到这种现象。在实际工作中，选择合适的剂量是很重要的。一般要求尽量减少对植物的生理损伤，提高遗传方面的效应，以有效地选择优良的变异类型和个体。三、实验材料和实验用品1材料：圆葱、大蒜、。用品：显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、滤纸、量筒、培养皿、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签等。多媒体系统（附显微演示）。2药品：无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8羟基喹啉、1mol/L盐酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶混合液。四、实验内容和实验步骤1处理和发根：将园葱、大蒜鳞茎分别用1000伦琴、2000伦琴、3000伦琴处理。处理后的园葱置于盛清水的小烧杯口上，使根茎部与水接触,或将圆葱半埋于湿沙内。在2025光照条件下培养23天，待根长12cm时，选健壮根自尖端约1cm处剪下备预处理用。处理后的大蒜瓣去皮，用细铁丝串起放在盛水的培养皿内培养，其它要求同上。剪取根尖的时间以上午10时左右为好。2预处理：为了阻止纺锤体的活动，获得更多的中期分裂相，使染色体缩短，便于染色体分散和计数，对根尖需进行预处理。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态，可以不进行预处理。预处理的方法有冰冻法和药物法两种。（1）冰冻预处理：将根尖浸泡在蒸馏水中，置于14冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻24小时。这种方法对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，效果良好，简便易行，各种作物都适用。（2）药物预处理：常用的药物有0.050.2%秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8羟基喹啉等。预处理时，将根尖直接浸泡在药液中，在适宜的温度下处理一定的时间（实验3）。这些药物的作用能使染色体缩短变粗，便于对染色体的观察。3固定或前低渗：为保持染色体的固有形态和结构，预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次（约5分钟）后要进行及时固定。固定液采用卡诺氏固定液，用无水酒精：冰醋酸3：1，或用95 乙醇代替无水乙醇。固定液要现配现用。固定2024小时后即可进行观察。如果需要长期保存，可先用70%酒精冲洗2次然后转入70%酒精中保存。4解离：解离的方法有：（1）将根尖用蒸馏水冲洗2次，然后放入已经在60水浴锅中预热的1mol/L盐酸中。在60恒温条件下处理1015分钟，当根尖透明呈米黄色时取出。（2）将根尖置于95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理210分钟。或将根尖放在5ol/L盐酸内处理510分钟。5后低渗：将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗23次（约10分钟），放入70%酒精中备用。6染色与压片：染色与压片的方法有以下几种：（1）醋酸洋红染色法：取一根尖放在吸水纸