DNA分离技术.ppt

第二讲核酸提取技术PartTwoTechniquesofNucleicAcidIsolation 第一部分 DNA提取方法简介 第二部分 DNA提取常见问题 原因分析及其对策 内容 第三部分 RNA提取方法简介 第四部分 RNA提取及其RT PCR常见问题 原因分析及其对策 核酸是遗传信息的载体 是最重要的生物信息分子 是分子生物学研究的主要对象 因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要 最基本的操作 前言 第一部分 DNA提取方法简介 第二部分 DNA提取常见问题 原因分析及其对策 第三部分 RNA提取方法简介 第四部分 RNA提取及其RT PCR常见问题 原因分析及其对策 第一部分 DNA提取方法简介 DNA提取的基本步骤 DNA提取的几种方法 基因组DNA的提取 CTAB法SDS法其它 DNA提取的几种方法 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法煮沸法 线粒体 叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA CTAB法 CTAB法原理 植物DNA提取经典方法 CTAB cetyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子去污剂 可溶解细胞膜 并与核酸形成复合物 该复合物在高盐溶液中 0 7mol LNaCl 是可溶的 通过有机溶剂抽提 去除蛋白 多糖 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 注 CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出 因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热 且离心时温度不要低于15 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris HCl pH8 0 提供一个缓冲环境 防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2 或Mn2 离子 抑制DNase活性 NaCl提供一个高盐环境 使DNA充分溶解 存在于液相中 CTAB溶解细胞膜 并结合核酸 使核酸便于分离 巯基乙醇是抗氧化剂 有效地防止酚氧化成醌 避免褐变 使酚容易去除 基因组DNA CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚的络合物 能与多酚形成一种不溶的络合物质 有效去除多酚 减少DNA中酚的污染 同时它也能和多糖结合 有效去除多糖 基因组DNA CTAB法 基因组DNA CTAB法 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组DNA CTAB法 CTAB法实例1 1 5ml离心管中加入0 3ml提取液置65 预热 2 取材料0 03g 用液氮研磨 加入0 003gPVP及少许石英沙 迅速研磨成粉 3 将冻粉迅速转入提取液中 尽快用移液枪混匀 在温度65 水浴30min 期间轻轻摇动几次 防止DNA断裂 4 取出离心管 冷至室温 每管加等体积氯仿 异戊醇 24 1 轻轻混匀 颠倒混匀静止10min 10000rpm离心10min 5 吸取上清夜于另一离心管中 加入1 10体积的3 CTAB 混匀 再加入等体积的氯仿 异戊醇 24 1 轻缓颠倒混匀 室温放置15min 然后10000rpm离心10min去上清 6 分别用70 80 酒精洗涤沉淀 在风扇下将沉淀吹干 基因组DNA CTAB法 CTAB法实例7 加30 lTE缓冲液回溶DNA沉淀 不要反复吸打 用手指轻弹 同时加入终浓度50 l mgRNase 置37 处理1h 8 加入等体积的氯仿 异戊醇 24 1 抽提1 3次 9 吸取上清 加入终浓度为0 2 0 4mol l的NaCL 2倍体积的无水乙醇 放置1h左右 10 12000rpm离心10min除去上清夜 11 用70 乙醇洗涤沉淀2 3次 自然干燥后 溶于30 l去离子水中形成DNA提取液 12 以DNA提取液 去离子水1 100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定 基因组DNA CTAB法 SDS法原理 基因组DNA SDS法 SDS是一种阴离子去垢剂 在高温 55 65 条件下能裂解细胞 使染色体离析 蛋白变性 释放出核酸 提高盐 KAc或NH4Ac 浓度并降低温度 冰浴 使蛋白质及多糖杂质沉淀 离心后除去沉淀 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提 反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA SDS法DNA提取缓冲液 SDS法流程图 以动物组织为例 基因组DNA SDS法 SDS法实例1 取0 03g新鲜材料 置液氮中研磨成粉 2 将冻粉转移置65 预热的450 lDNA提取液中 轻轻晃动 使冻粉充分散开 3 加入30 l10 SDS充分混匀 置65 水浴中保温10 15min 间隔晃动2 3次 4 加入48 lKAC充分混匀 冰浴中放置30min 5 4 12000rpm离心15min 6 上清转入另一离心管中 加入等体积氯仿 异戊醇 24 1 轻扣 倒离心管数次 放置片刻 于4 8000rpm离心10min 7 按6 7重复1 2次 8 将上清转移另一离心管 加入2倍体积冷无水乙醇 轻缓摇匀 置 20 沉淀0 5 1h 4 10000rpm离心10min 基因组DNA SDS法 9 倒掉上清 用70 乙醇洗涤沉淀2 3次 吹干后 用30 l去TE缓冲液溶解沉淀 10 DNA溶液加入RNase1 l 于37 保温0 5 1h 11 用等体积的氯仿 异戊醇 24 1 抽提1 3次12 70 乙醇洗涤沉淀2 3次 自然干燥后 溶于30 l去离子水形成DNA提取液 13 以DNA提取液 去离子水1 100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定 一步法 1 0 03mg材料 加200 l0 5mol lNAOH研磨后 取60 l研磨液 加300 l100mol lTris HCL PH7 6 缓冲液中8000rpm离心5min 取上清即为DNA提取液 2 以DNA提取液 去离子水1 100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定 基因组DNA SDS法 基因组DNA 其它方法 物理方式 玻璃珠法 超声波法 研磨法 冻融法化学方式 异硫氰酸胍法 碱裂解法生物方式 酶法 根据细胞裂解方式的不同有 基因组DNA 其它方法 吸附材料结合法 根据核酸分离纯化方式的不同有 硅质材料阴离子交换树脂磁珠 高盐低pH值结合核酸 低盐高pH值洗脱 快捷高效 低盐高pH值结合核酸 高盐低pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物 从而达到分离目的 基因组DNA 其它方法 浓盐法 有机溶剂抽提法 密度梯度离心法 利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同 将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂 同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 质粒DNA 碱裂解法 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多 且染色体DNA为线状分子 而质粒DNA为共价闭合环状分子 当用碱处理DNA溶液时 线状染色体DNA容易发生变性 共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中 从而可通过离心将两者分开 碱变性 质粒DNA 碱裂解法 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 溶液配制 溶液1 GET缓冲液 50mmol L葡萄糖 10mmol LEDTA 25mMTris HClpH8 0 溶液2 0 2mol LNaOH 1 SDS溶液3 乙酸钾溶液 3M pH 4 8 60mL的5mol LKAc 11 5ml冰醋酸 28 5mLH2OTE缓冲液或水 20 g mlRNase 10mmol L Tris HCl 1mmol L EDTA pH8 0 100 乙醇 70 乙醇 注意 用移液器操作时 每一步都要格外小心 特别是在加入溶液II和III后 一定不要剧烈振荡 以免切碎DNA 包括质粒DNA和基因组DNA 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种到1 5 3ml含有相应抗生素的液体培养基 37 培养12 16小时 取液体培养液1 5 3ml于Eppendorf管中 10000r min离心1min 去掉上清液 加入100 l溶液1 GET 充分混匀放置3 5分钟 加入200 l新配制的0 2mol LNaOH 1 SDS 变性液 加盖颠倒6 7次使之混匀 冰上放置5min 质粒小量提取的方法 手工提取 加入150 l乙酸钾溶液 溶液II 加盖后颠倒6 7次混匀 冰上放置5min 用台式高速离心机 10000r min离心7min 上清移入另一干净离心管 并加1ml100 乙醇混匀 12000r min离心5min 弃去上清液 沉淀用0 5ml70 乙醇清洗一次 12000r min离心5min 弃去上清液 小管倒置于吸水纸上 除尽乙醇 室温自然干燥 加入30 50 l含有20 g mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物 室温放置15 30min 使DNA充分溶解 有时需要酚 氯仿抽提 将分离出的质粒DNA置于 20 保存备用 用分光光度计法定量DNA取2 l提取的质粒DNA 加入98 l蒸馏水对待测DNA样品做1 50 或更高倍数的稀释 蒸馏水作为空白 在波长260nm 280nm处调节紫外分光光度计读数至零 加入DNA稀释液 测定260nm及280nm的吸收值 260nm读数用于计算样品中核酸的浓度 OD260值为1相当于约50 g ml双链DNA 33 g ml单链 可根据在260nm以及在280nm的读数的比值 OD260 OD280 估计核酸的纯度 一般DNA的纯品 其比值为1 8 低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染 6 记录OD值 通过计算确定DNA浓度或纯度 公式如下 dsDNA 50 OD260 稀释倍数以上浓度单位为 g ml 凝胶电泳检测DNA的浓度 0 8 的琼脂糖凝胶 100V 40分钟 NEB标准分子量片段 1kbDNALadder 1kbDNALadder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析 但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据 每条带大概的量如下 按0 5 g上样量计 应按13条带计算 因为3kb的量是其它片段量的近三倍 0 5kb的条带由500bp和517bp组成 这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一 质粒DNA 煮沸法 煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多 且染色体DNA为线状分子 而质粒DNA为共价闭合环状分子 当加热处理DNA溶液时 线状染色体DNA容易发生变性 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中 从而可通过离心将两者分开 细胞器DNA 差速离心法 差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法 将待分离物质置于均匀介质 蔗糖 中 以一定的转速进行离心 比重大的物质优先沉降 比重小的却处于上层 从而得以分离 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器 自身可编码蛋白 它们的比重和大小一定 因而在同一离心场内的沉降速度也一定 根据这一原理 常用不同转速的离心法 将细胞内各种组分分级分离出来 大豆线粒体DNA的提取 1 大豆黄化苗的培育取大豆种子 大小均一 无病虫害 20粒左右 用清水冲洗干净 浸泡1 2天 待种子完全膨胀后 取两张发芽纸 用水浸湿 将种子均匀 整齐地摆放在发芽纸上 其上再覆盖一层发芽纸 然后从一端卷起 两端用束带扎起 防止豆种散落 放入装有一薄层清水的烧杯中 于28 暗培养5 7天 定期更换补充烧杯内水源 10 左右长的黄化幼苗即可作为实验材料 大豆线粒体DNA的提取 2 线粒体的分离和纯化1 取黄化苗30g 剪成2cm左右的小段 按5ml g加匀浆缓冲液A 500mmol L蔗糖 50mmol LTris ClpH7 5 5mmol LEDTA 0 1 BSA 5mmol L 巯基乙醇 用预冷的组织捣碎机匀浆 2层无菌纱布过滤 2 将滤液以1000g 离心10min 收取上清 再经17000g 离心15min 3 将得到的线粒体沉淀重悬于2 5ml 按1ml 20g 悬浮缓冲液B 300mmol L蔗糖 50mmol LTris ClpH7 5 中 加MgCl2至终浓度为10mmol L 加DNaseI至终浓度为50 g ml 冰上反应1h 然后加EDTA至终浓度为50mmol L 以终止反应 4 17000g 离心15min 所得沉淀悬于6ml缓冲液A中 取6只4ml的水平超速离心管 依次铺60 52 36 20 蔗糖液 60 52 36 与20 的蔗糖液用TE配制 各700 l 上铺1ml线粒体悬液 35000r min 离心1h 5 收集52 与36 蔗糖液之间的黄色线粒体层于一新50ml离心管中 加3倍体积裂解缓冲液C 150mmol LNaCl 50mmol LTris ClpH8 0 20mmol LEDTA 轻轻混匀 于17000g 离心15min 所得沉淀即为纯化线粒体 大豆线粒体DNA的提取 3 线粒体DNA的提取1 将线粒体沉淀悬于1ml缓冲液C中 加 巯基乙醇至终浓度为5 加蛋白酶K至终浓度为200 g ml 加SDS至终浓度为2 37 反应2h后于冰水浴中冷却 2 加等体积氯仿 异戊醇 24 1 抽提1 2次 离心取上清 3 上清中加2倍体积无水乙醇 20 过夜 17000g 离心20min 所得沉淀用70 酒精洗涤后 晾干 溶于100 lTE或水 20 保存备用 如未加说明 以上操作均在4 条件下进行 大豆线粒体DNA的提取 4 线粒体DNA的检测 1 电泳检测取1 l所得的mtDNA溶液加1 L溴酚蓝 行0 8 琼脂糖凝胶电泳 以 DNA 50ng 作对照 于70V稳压电泳90min 待溴酚蓝行至离前端2cm左右 在紫外灯下观察 2 DNA含量测定取5 l所得的mtDNA溶液 于1ml比色皿中加995 l无菌水 在岛津UV2401PC型紫外分光光度计上测定OD230 OD260及OD280 DNA的酶切鉴定 缓冲液随不同的酶而不同 本实验用Hbuffer 置于37 水浴酶解0 5 1小时 酶解完成后 分别加入10 l3倍的上样缓冲液 然后各取15 l进行电泳分析 1 质粒DNA的酶解 2 琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备 称取0 8g琼脂糖 置于三角瓶中 加入100mlTBE或TAE工作液 瓶口倒扣一个小烧杯 将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解 3 胶板的制备取有机玻璃内槽 洗净 晾干 将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上 放好梳子 将冷却至65 左右的琼脂糖凝胶液 小心地倒在有机玻璃内槽上 控制灌胶速度和量 使胶液缓慢地展开 直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层 室温下静置30min左右 待凝固完全后 轻轻拔出梳子 在胶板上即形成相互隔开的上样孔 制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0 5 1 TAE Tris 乙酸 或TBE Tris 硼酸 工作液的电泳槽中使用 4 加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内 每加完一个样品 换一个加样头 加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部 本实验样品孔容量约15 20 l 1kbDNAladder 能见到10条带 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6 l的1kbDNAladder 50ng l 5 电泳 带上手套操作 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳 建议在80 100V的电压下电泳 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳 将凝胶放入溴化乙啶 EB 工作液 0 5 g ml左右 中染色约20min 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率 电场强度不应高于5V cm 两电极间的距离 电泳温度视需要而定 对大分子的分离 以低温较好 也可在室温下进行 在琼脂糖凝胶浓度低于0 5 时 由于胶太稀 最好在4 进行电泳以增加凝胶硬度 6 观察与拍照在紫外灯 310nm波长 下观察染色后的凝胶 DNA存在处显示出红色的荧光条带 紫外光激发30s左右 肉眼可观察到清晰的条带 在紫外灯下观察时 应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩 避免眼睛遭受强紫外光损伤 拍照电泳图谱时 可采用快速凝胶成象系统 对于未进行酶切的质粒来说 常会出现两条电泳带 一条是 松弛 螺旋状质粒DNA带 另一条是超螺旋状质粒DNA的带 以超螺旋状质粒DNA居多 移动速度也最快 有时还会出现三条带 其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化 其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间 所以该条电泳带位于上述两种带之间 如果提取的质粒很好时 这条带会很弱 有时看不到 Relaxedcircle Super coiledform 第一部分 DNA提取方法简介 第二部分 DNA提取常见问题 原因分析及其对策 内容 第三部分 RNA提取方法简介 第四部分 RNA提取及其RT PCR常见问题 原因分析及其对策 第二部分 DNA提取常见问题 原因分析及其对策 DNA提取的基本步骤 I 材料准备II 破碎细胞或包膜 内容物释放III 核酸分离 纯化IV 沉淀或吸附核酸 并去除杂质V 核酸溶解在适量缓冲液或水中 材料准备 最好使用新鲜材料 低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时 要选择有核细胞 白细胞 组培细胞培养时间不能过长 否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少 提取前先富集 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 使用处于对数期的新鲜菌体 老化菌体导致开环质粒增加 培养时应加入筛选压力 否则菌体易污染 质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒 如为低拷贝或大质粒 则应加大菌体用量菌株不要频繁转接 质粒丢失 细胞裂解 材料应适量 过多会影响裂解 导致DNA量少 纯度低针对不同材料 选择适当的裂解预处理方式 植物材料 液氮研磨动物组织 匀浆或液氮研磨组培细胞 蛋白酶K细菌 溶菌酶破壁酵母 破壁酶或玻璃珠高温温浴时 定时轻柔振荡 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 菌体量适当培养基去除干净 同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长 5分钟 否则质粒易被打断复性时间也不宜过长 否则会有基因组DNA的污染G 菌 酵母质粒的提取 应先用酶法或机械法处理 以破壁 核酸分离 纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时 应提供相应的缓冲体系采用有机 酚 氯仿 抽提时应充分混匀 但动作要轻柔离心分离两相时 应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点 在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 核酸分离 纯化 蛋白质的去除 酚 氯仿抽提使用变性剂变性 SDS 异硫氰酸胍等 高盐洗涤蛋白酶处理 多糖的去除 高盐法 用乙醇沉淀时 在待沉淀溶液中加入1 2体积的5MNaCl 高盐可溶解多糖 用多糖水解酶将多糖降解 在提取缓冲液中加一定量的氯苯 1 2体积 氯苯可以与多糖的羟基作用 从而去除多糖 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA 在500 LDNA液中加入200 l20 PEG8000 含1 2MNaCl 冰浴20min 核酸分离 纯化 多酚的去除 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂 巯基乙醇 抗坏血酸 半胱氨酸 二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂 如PVP PEG 聚乙二醇 它们与酚类有较强的亲和力 可防止酚类与DNA的结合 核酸分离 纯化 盐离子的去除 70 的乙醇洗涤 核酸沉淀 溶解 当沉淀时间有限时 用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 沉淀会更充分沉淀时加入1 10体积的NaAc pH5 2 3M 有利于充分沉淀沉淀后应用70 的乙醇洗涤 以除去盐离子等晾干DNA 让乙醇充分挥发 不要过分干燥 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2 或Mn2 离子 抑制DNasepH值为8 0 可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 DNA中含有蛋白 多糖 多酚类杂质DNA在溶解前 有酒精残留 酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子 重新纯化DNA 去除蛋白 多糖 多酚等杂质 具体方法见前 重新沉淀DNA 让酒精充分挥发增加70 乙醇洗涤的次数 2 3次 DNA提取常见问题 问题一 DNA样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应 原因 对策 材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈 DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融 尽量取新鲜材料 低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后 应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时 可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制 耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中 避免反复冻融 DNA提取常见问题 问题二 DNA降解 对策 原因 实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜 幼嫩 的材料动植物要匀浆研磨充分 G 菌 酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时 时间适当延长 对于动物细胞 细菌可增加PK的用量 低温沉淀 延长沉淀时间加辅助物 促进沉淀洗涤时 最好用枪头将洗涤液吸出 勿倾倒 DNA提取常见问题 问题三 DNA提取量少 对策 原因 第一部分 DNA提取方法简介 第二部分 DNA提取常见问题 原因分析及其对策 内容 第三部分 RNA提取方法简介 第四部分 RNA提取及其RT PCR常见问题 原因分析及其对策 第三部分 RNA提取方法简介 RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍 苯酚法 原理 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解 同时核蛋白体上的蛋白变性 核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相 从而得以分离 在酸性至中性条件下 DNA和蛋白质一起变性通过离心去除 RNA仍留在上清液中 最后用异丙醇沉淀 有机溶剂抽提 沉淀 得到纯净RNA RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍 苯酚法 步骤 材料准备 尽量新鲜 裂解变性 异硫氰酸胍 亚硫氢胍 巯基乙醇 N 月桂肌氨酸等 使细胞及核蛋白复合物变性 释放RNA 有效抑制核酸酶 纯化分离 苯酚 氯仿 异戊醇 苯酚 氯仿可抽提去除杂物 洗涤 70 乙醇 沉淀 异丙醇 无水乙醇 乙酸钠 pH4 0 维持变性的细胞裂解液的pH值 沉淀RNA 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA RNA提取的通用方法 RNA提取实例 大豆总RNA的提取1 配制提取液异硫氰酸胍 4mol l 4ml苯酚3ml醋酸钠 2mol lPH4 8 0 3ml氯仿0 6mlPVP0 04g2 将研钵放在 80 冰箱中预冷 取1 2g花生豆授粉后30天的未成熟种子放入研钵中 加入液氮 迅速将花生豆研磨成粉末状 转移至提取液中 混匀 冰浴30min 3 4 8000rpm 离心13min 4 取上清 加入等体积的苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 4 12000rpm 离心5min RNA提取的通用方法 5 取上清 加入0 5体积的3mol lKAc PH4 8 混匀 冰浴30min 4 13000rpm 离心15min 6 取上清 加入2倍体积无水乙醇 20 放置1h 4 8000rpm 离心13min 7 弃上清 在沉淀中加入1ml4mol LLicl 使溶解 移入1 5mlEppendorf管中 冰浴2h 4 13000rpm 离心15min 8 弃上清 在沉淀中加入400uldH2O 经DEPC处理 再加入400ul氯仿 混匀 4 13000rpm 离心6min 9 取上清 加入0 1体积的3mol lNaAc PH5 0 2倍体积无水乙醇 20 放置 30min 4 13000rpm 离心13min 10 弃上清 将沉淀RNA用70 乙醇洗涤2次 室温下干燥 70 乙醇用DEPC处理水配制 11 加入100uldH2O 经DEPC处理 溶解 20 保存 RNA提取的通用方法 影响RNA提取的因素 材料 新鲜 切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难 且实验需要一定的时间间隔 可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中 于 70 或 20 保存如要多次提取 请分成多份保存液氮长期保存 70 短期保存 影响RNA提取的因素 影响RNA提取的因素 样品破碎及裂解 根据不同材料选择不同的处理方法 培养细胞 通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌 一般TRIzol可直接裂解 对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织 先液氮研磨和匀浆 后加裂解液裂解 期间动作快速 样品保持冷冻样品量适当 保证充分裂解为减少DNA污染 可适当加大裂解液的用量 影响RNA提取的因素 纯化 在使用氯仿抽提纯化时 一定要充分混匀 且动作快速 经典的纯化方法 如LiCl沉淀等 虽然经济 但操作时间长 易造成RNA降解 柱离心式纯化方法 抽提速度快 能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质 是目前较为理想的选择 影响RNA提取的因素 第一部分 DNA提取方法简介 第二部分 DNA提取常见问题 原因分析及其对策 内容 第三部分 RNA提取方法简介 第四部分 RNA提取及其RT P