制备软骨组织工程支架的方法.doc

www.CRTER.org倪硕，等. 制备软骨组织工程支架的方法制备软骨组织工程支架的方法倪 硕1，李 澎1，张卫国2，李鹏声1，贵浩然1 (1大连医科大学附属第二医院关节外科，辽宁省大连市 116027；2大连医科大学附属第一医院骨外科，辽宁省大连市 116023)文章亮点：1 此问题的已知信息：组织工程化软骨研究为解决软骨损伤修复提供了新的治疗方法，软骨组织工程支架作为软骨细胞外基质的替代物，其外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要的意义。支架制备方法的选择在一定程度上决定了支架的力学性能及生物相容性。2 文章增加的新信息：通过溶液浇铸/粒子沥滤法、气体发泡法所制备的软骨组织工程支架孔径大小在100- 250 m这一合适的范围内；将多种方法结合起来，能制备出生物和力学性能方面更加仿生的软骨组织工程多孔支架。3 临床应用的意义：进一步探索适合软骨组织工程支架的制备方法，对于提高支架的稳定性及生物相容性有着重要的意义，寻求组织工程化软骨从实验室研究走向临床应用，为软骨损伤修复提供了新的治疗措施。 关键词：生物材料；软骨生物材料；软骨组织工程；制备方法；支架材料；多孔支架；辽宁省自然科学基金主题词：生物相容性材料；软骨；组织工程；支架基金资助：辽宁省自然科学基金资助项目(2013023034)，项目负责人：李澎摘要背景：软骨组织工程支架作为软骨细胞外基质的替代物，其外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要的意义。目的：回顾目前若干种常用软骨组织工程中三维多孔支架的制备方法。方法：由第一作者检索2000至2013年PubMed数据库，ELSEVIER SCIENCEDIRECT、万方数据库、中国知网数据库。英文检索词为“Cartilage tissue engineering；scaffolds；fabrication”，中文检索词为“软骨组织工程；制备方法；支架材料；多孔支架”。结果与结论：制备软骨组织工程支架的方法有相分离/冷冻干燥法、水凝胶技术、快速成型技术、静电纺丝法、溶剂浇铸/粒子沥滤法及气体发泡法等。目前研究发现，支架中孔径的大小对组织的重建有着直接的影响，孔径为100-250 m的孔有益于骨及软骨组织的再生。通过溶液浇铸/粒子沥滤法、气体发泡法所制备的支架孔径大小在这一范围内，因此比较适合用于骨、软骨组织工程支架的构建。研究人员通常将多种方法结合起来，以期能制备出生物和力学性能方面更加仿生的组织工程多孔支架。倪硕，李澎，张卫国，李鹏声，贵浩然. 制备软骨组织工程支架的方法J.中国组织工程研究，2014，18(3):446-451.Fabrication technologies of tissue-engineered cartilage scaffolds Ni Shuo1, Li Peng1, Zhang Wei-guo2, Li Peng-sheng1, Gui Hao-ran1 (1Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China; 2Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, Liaoning Province, China)倪硕，男，1988年生，浙江省金华市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事骨外科研究。通讯作者：李澎，博士，主任医师，硕士生导师，大连医科大学第二附属医院骨外科，辽宁省大连市 116027doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.019 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2014)03-00446-06稿件接受：2013-11-25Ni Shuo, Studying for masters degree, Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China Corresponding author: Li Peng, M.D., Chief physician, Masters supervisor, Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, ChinaAccepted: 2013-11-25AbstractBACKGROUND: Cartilage tissue engineering scaffold is a substitution for extracellular matrix, and there is a great significance on the shape and pore structure of the scaffold.OBJECTIVE: To retrospectively focus on the fabrication technology of three-dimensional porous cartilage tissue engineering scaffolds.METHODS: The first author searched PubMed, ELSEVIER SCIENCEDIRECT, Wanfang and CNKI databases (2000/2013) to retrieve relevant articles about the fabrication technology tissue-engineered cartilage scaffolds. The key words were “cartilage tissue engineering; scaffolds; fabrication” in English and Chinese, respectively.RESULTS AND CONCLUSION: The fabrication technologies of three-dimensional porous cartilage tissue engineering scaffolds are as follows: Phase separation/freeze-drying, hydrogels, rapid prototyping manufacturing, electrospinning, solvent casting/particulate leaching, gas foaming. The current cartilage studies have demonstrated that the pore size has a significance on the regeneration of the cartilage tissue, the pore size ranging from 100-250 m allows for the regeneration of bone and cartilage tissue. The scaffold fabricated by the solvent casting/particulate leaching and gas foaming technology at a pore size of 100-250 m is suitable for the bone and cartilage tissue regeneration. To obtain the adequate biological and mechanical properties, researchers usually combine a variety of methods to fabricate the cartilage tissue engineering scaffolds.Subject headings: biocompatible materials; cartilage; tissue engineering; stentsFunding: the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 2013023034447ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHNi S, Li P, Zhang WG, Li PS, Gui HR. Fabrication technologies of tissue-engineered cartilage scaffolds. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(3):446-451.1ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction 退变、创伤等导致的关节软骨损伤是骨科常见病，也是临床治疗的难点1-3。修复缺损的关节软骨，对于恢复关节生理解剖的完整性和维持生物力学的稳定性具有决定性的作用4。然而关节软骨周围无血管和淋巴管，依靠关节液营养，其自我修复能力有限，所以一旦损伤，难以修复5。目前临床上关节软骨损伤的修复仍未得到很好的解决6。组织工程技术的发展，为解决软骨损伤的修复这一难题提供了可能性7-8。目前研究证明，组织工程包含3大要素：合适的种子细胞、理想的支架及具有生物活性的细胞因子。其中细胞支架是基础，它为种子细胞和生长因子提供适宜的微环境，完成组织或器官的再生过程9。文章从细胞支架的制备方法入手，综述了目前常用的软骨组织工程细胞支架制备技术的最新进展。1 资料和方法 Data and methods1.1 资料来源 由第一作者检索2000至2013年PubMed数据库，ELSEVIER SCIENCEDIRECT、万方数据库、中国知网数据库文献。英文检索词为“Cartilage tissue engineering；scaffolds；fabrication”，中文检索词为“软骨组织工程；制备方法；支架材料；多孔支架”。检索文献量总计131篇。1.2 纳入与排除标准纳入标准：文章所述内容与软骨组织工程支架的材料选择和制备方法的研究密切相关。同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准：重复性研究。1.3 数据提取 共检索到文献131篇，其中中文文献46篇，英文文献85篇，排除与研究目的相关性差及内容陈旧、重复的文献67篇，纳入64篇符合标准的文献进行综述。2 结果 Results 2.1 软骨组织工程支架的要求 理想的组织工程支架应该具有以下10个特征：良好的生物相容性。可降解性。足够的孔隙结构。能够促进细胞的黏附与增值。具备承载生长因子的能力。支架的容积应能保持不变。支架能与周围组织融为一体。不易从缺损区脱落。具有一定的弹性。具有关节软骨的分层结构10。组织工程支架材料作是组织器官工程化的最基本元素。目前用于组织工程支架的材料主要有天然生物材料11、人工合成高分子材料和复合材料3大类12。单纯应用天然生物材料或人工合成高分子材料存在诸多问题。将两种或两种以上具有互补特性的材料进行复合，并选择合适的制备工艺，可以设计构造出能够满足软骨组织工程所需的三维支架。2.2 软骨组织工程支架制备方法 软骨组织工程支架作为软骨细胞外基质的替代物，其外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要的意义。制备工艺的不同对支架的性能可产生明显影响。目前已研究出多种制备软骨组织工程支架的方法，在实际应用中可以根据不同组织和器官选择不同的制备工艺。2.2.1 相分离/冷冻干燥法 相分离法可分为溶致相分离和热致相分离两种方法。因为许多结晶性聚合物在室温下找不到合适的溶剂，所以溶致相分离方法应用不多。目前应用较多的是将热致相分离法与冷冻干燥法结合起来使用。其原理是将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，诱使混合物在冷冻过程中发生相分离，最后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔泡沫支架。在此方法中支架的内部结构及物理、化学特性由制备过程中的各种条件所决定13。Fan等14用此法制备的聚丙交酯-乙交酯多孔支架孔隙大小较均一，孔隙间微孔相通，平均孔径为500 m，微孔直径为5 m，孔隙率为89.6%。该法由于在制备过程中避免了高温，且不涉及毒性大的有机溶剂，因此有利于生物活性分子，如蛋白质生长因子或分化因子的引入和控制释放。Fan等14应用此法制备负载转化生长因子3的聚丙交酯-乙交酯-明胶/硫酸软骨素/透明质酸支架，种植兔骨髓间充质干细胞后，细胞在支架上生长并部分长入支架内；28 d后骨髓间充质干细胞在支架上分化为软骨细胞，且能够分泌软骨细胞外基质。邓天政等15参考Fan等14的制备方法，制备了明胶-硫酸软骨素-透明质酸及明胶-陶瓷化骨软骨复合支架，结果发现兔软骨细胞在复合支架上生长良好。但该方法的不足是其产生的微孔大小难以控制。2.2.2 水凝胶技术 水凝胶是一种富含水分，并且富有弹性的非黏着性亲水性聚合物，水凝胶支架可以很好地运输营养物质及代谢废物16。通过一定的化学交联或物理交联，凡是亲水性或水溶性的高分子都可以形成水凝胶。这些高分子按其来源可分为天然和合成两大类：天然的亲水性高分子包括多糖类和多肽类；合成的亲水高分子包括丙烯酸及其衍生物类。水凝胶技术具有可塑性强，易于制成可注射性支架等优点17，因此具有广阔的应用前景。Hong等18用交联的壳聚糖水凝胶复合物与软骨细胞共培养，结果显示软骨细胞在12 d后仍能维持其细胞表型。最近，Yang等19将氧化的海藻酸盐作为大分子交联剂制备胶原水凝胶支架，结果显示乳兔关节软骨细胞在交联的胶原水凝胶支架上生长良好，并保持细胞表型。但该技术的不足是所制备的支架强度不高，并且常因吸水而变形，不能很好地促进细胞增殖。2.2.3 快速成型技术 快速成型技术就是利用三维CAD的数据，通过快速成型机将一层层的材料堆积成实体原型。近几年人们将快速成型技术应用于组织工程支架制备，集合计算机获得更理想的支架结构、孔隙率等重要指标，取得了较好的效果。目前用于组织工程多孔支架制备的快速成型法主要有熔融沉积成型、选择性激光烧结及三维打印3种。熔融沉积成型：此法通常使用热塑性高分子原料，利用热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、沉积，并凝固成型，经过逐层沉积、凝固，最后除去支撑材料，得到所需的三维产品20。该技术特点是成型产品精度高、表面质量好、成型机结构简单、无环境污染等。熔融沉积成型技术所使用的原料通常为聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯等热缩性高分子。荷兰乌特勒支药学研究所Seyednjad等21-22使用苄基保护的羟甲基乙交酯与己内酯共聚，然后再进行苄基脱保护，获得了羟甲基乙交酯与-CL 的共聚物，并通过纤维熔体沉积技术制备了3D支架。制备过程中对材料的特殊处理增强了细胞对材料的黏附，促进了人间充质干细胞的存活和增殖，以及成骨分化。南洋理工大学的Cao等23利用此方法制备了聚乙酸内酯骨软骨复合支架，并将成骨细胞与软骨细胞种植于同一支架的两部分。两种细胞在支架中分泌出不同的细胞外基质，在成骨细胞种植区出现了较高的骨钙，而软骨细胞种植区测得了较高的碱性磷酸酶。该结果表明，通过此法制备的聚-己内酯支架可望应用于骨软骨的修复。但是熔融沉积成型法的不足是操作温度较高，无法应用于天然生物材料的制备。选择性激光烧结：选择性激光烧结是采用激光束按照计算机指定路径扫描，使工作台上的粉末原料熔融、黏结固化。其方法是逐层扫描黏结，最后获得所需的三维材料。选择性激光烧结技术常用的原料包括塑料、陶瓷、金属粉末等，其优点是加工速度快，且无需使用支撑材料。美国密歇根大学的Das等使用聚-己内酯为原料，通过选择性激光烧结技术制备了3D可降解多孔支架，获得的3D支架材料能与动物骨组织良好地结合，且具有良好的生物相容性24。但此法的缺陷是成型产品表面较粗糙，且制备过程中持续的高温可能造成高分子材料的降解，以及生物活性分子的变形或细胞的凋亡，所以该技术不能用于制备水凝胶支架25。 三维打印技术：三维打印技术目前已用于组织工程多孔支架的制备26。其基本制造过程是按照“分层制造、逐层叠加”的原理，根据CT等成像数据，经计算机3D建模转换后，再以特定的格式文件输入到计算机系统中，并分层成二维切片数据，通过计算机控制的3D打印系统进行逐层打印，叠加后最终获得三维产品。Schek等27用该方法制造聚乳酸/羟基磷灰石双层软骨与骨复合支架，动物实验发现可在异位同时促进骨和软骨生长。近年来通过直接携带细胞进行3D打印的细胞或组织打印技术受到了广泛的关注。其优势在于：直接通过3D打印技术控制细胞在微观尺度的排列分布，对于调节细胞行为、细胞间的相互作用、细胞与材料间的相互作用，以及促进细胞最终形成功能组织具有十分重要的意义。相比于在已成型的支架中种植细胞，直接携带细胞打印可以获得更高的细胞密度。目前的细胞和组织打印技术主要是基于携带细胞的水凝胶3D沉积技术28。美国斯克里普斯研究所的DLima等以天然牛股骨髁制成体外软骨缺损模型，以PEGDMA/软骨细胞混合溶液为生物墨水，在紫外光照下，在软骨缺损部位进行原位打印29。通过该方法打印成型的聚乙二醇水凝胶支架的物理性能及生物相容性良好，为将来开发能直接应用于体内的原位生物打印技术进行组织缺损原位修复提供了一个重要手段。2.2.4 静电纺丝法 静电纺丝法是聚合物溶液或熔体在静电作用下进行喷射拉伸而获得纳米级纤维的纺丝方法。该方法能使有机大分子简单而可控地形成纳米纤维，制备出较大的面积-体积比和高孔隙率的支架。Li等30采用此法制成聚己内酯纳米纤维支架，将骨髓干细胞接种于支架表面，在不同培养环境中分别诱导形成了脂肪组织、软骨组织、骨组织，说明该技术制成的聚己内酯支架可用于多种组织工程构建。为了能使电纺的纤维支架具有生物活性物质缓释功能，研究人员开发出了同轴共纺技术。Jiang等31通过同轴共纺技术制备以聚乙内酯为壳，牛血清蛋白为芯的纤维，结果表明牛血清蛋白可以从壳-芯式结构中缓慢释放出来。但该方法制作支架耗时长，因此支架的大批量生产较困难；并且对于较大支架的制备仍有许多技术难题需要克服32。2.2.5 溶剂浇铸/粒子沥滤法 该法由Mikos等33-34作为纤维连结法的改进而提出，目前已成功地用于软骨细胞的培养和软骨组织的生成。其原理是先将高分子材料溶解或熔化成液态，然后在液体中加入不溶(或不熔)的所需粒径范围的致孔剂，将该液体混合物固化(待溶剂挥发或降温凝固)，最后用高分子材料不溶(或不熔)而致孔颗粒溶解的溶剂将致孔颗粒浸泡沥出，制成不含粒子的多孔隙高分子支架。支架的孔形态、孔隙率、机械性能、生物活性和降解性能可由致孔剂的性质及其数量，不同支架材料的性质及其比例控制。Lee等35采用该技术制备了孔隙率为87%-90%，孔径大小在115.5-220.9 m之间的聚乙二醇水凝胶支架，并在支架上种植软骨细胞，结果发现软骨细胞在微孔内伸展生长，并产生大量的细胞外基质和葡萄糖胺聚糖。能用该法致孔的聚合物有聚乳酸36、聚乙醇酸及其共聚物等。 溶剂浇铸/粒子沥滤法的改进：虽然粒子致孔法具有简单、适用性广，并且孔隙率和孔尺寸易独立调节等优点，但该方法也存在诸多局限性37，例如：支架的厚度不足38；支架内部连通性的缺陷39；支架内部致孔剂的残留40-41；支架制备过程中残留的有毒溶剂对组织生长的影响40, 42。为克服上述缺陷，研究者们对溶剂浇铸/粒子沥滤法进行改进或者将溶剂浇铸/粒子沥滤法与其他方法相结合来制备多孔支架。为解决支架的厚度的问题，国内学者任杰等43将通过溶剂浇铸/粒子沥滤法所制得的聚乳酸-聚乙二醇薄层支架，利用层叠方法以氯仿润湿支架的黏结面后，将薄层支架彼此黏合为三维多孔支架。此法虽然比较简单，并且有利于滤除支架中的致孔剂，但其制备过程中无法避免有毒溶剂的使用，且在粘接过程中可能导致支架孔结构破坏。为克服支架孔-孔连通性不好的缺陷，Shokrolahi等40采用致孔剂模板法，以通过处理的球形化氯化钠颗粒为致孔剂，经处理得到孔隙率高、孔-孔连通性好的聚乳酸/羟基磷灰石复合材料支架。尽管通过模板法制备的多孔支架的孔-孔连通性好，但它对致孔剂要求较高，对支架的孔隙率的控制也较为困难，且同样无法避免有毒有机溶剂的使用。为解决传统无机盐致孔剂在支架上的残留及其毒害性，采用冰粒子作为致孔剂引起了研究者们的注 意44。国内东南大学的孙浩45以冰粒子作为致孔剂，采用粒子沥滤/冷冻干燥复合工艺制备了具有良好孔隙结构、较大尺寸且无致孔剂残留的三维块状聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物多孔支架。采用冰粒子作为致孔剂虽然可有效避免致孔剂的残留，但在实际操作中因能耗问题而困扰着研究者，并且同样无法避免有机溶剂的使用46。 为有效避免有毒有机溶剂的使用，Hou等46通过模压/粒子沥滤法制备消旋聚乳酸支架，其具体过程是：将所需的聚合物支架材料在低温下冷冻粉碎，然后将所需粒径的颗粒与氯化钠颗粒混合后加入模具，在高温高压下模压成型。此改进方法解决了有毒有机溶剂的残留及支架厚度的问题。但由于此法在制备过程中不可避免的使用高温高压，从而影响了支架材料的性能，并且对于设备及模具有一定要求。采用溶剂浇铸/粒子沥滤和相分离等方法制备软骨组织工程多孔支架，尽管支架孔隙率高达95%，孔径范围在20-500 m，但以上多数方法在制备过程中无法避免有机溶剂的使用。如果有机溶剂残留在支架中，则可能伤害移植细胞及邻近组织。而且，许多生物活性因子(如生长因子)在有机溶剂中会失去活性47。为此，采用超临界CO2 作为致孔剂的气体发泡法来制备高度多孔可生物降解支架引起了研究者们的关注。2.2.6 气体发泡法 气体发泡法主要有物理发泡法和化学发泡法，其大致原理是利用不同压力下气体在固体中溶解度的不同，通过压力的改变在聚合物中形成气腔，并最终形成三维多孔支架。聚合物材料的性质及制备过程中的各种因素决定了支架的孔隙率和孔结构。物理发泡法可以避免有机溶剂的使用，但是对于某些材料，如结晶性聚合物，这种方法产生的泡沫结构大多是闭孔结构。例如，利用超临界二氧化碳发泡工艺形成的支架孔径大小不一，孔隙率较小，且易形成闭合孔49。对于无定型聚合物材料，利用此法则比较容易发泡。Mooney等50采用该法将聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物固体室温暴露于5.5 MPa高压CO2气体72 h达溶解饱和，然后将气压降至大气压水平，随着聚合物中CO2溶解度的迅速下降而产生大量的CO2气腔，最后形成孔径约 100 m，孔隙率达93%多孔泡沫样结构。Singh等48采用超临界CO2作为致孔剂，制备出了孔间相互连通，孔隙度高达89%，孔径范围30-100 m的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物支架。为解决采用发泡法制备的支架中存在的闭孔问题，常常将其与粒子沥滤法相结合使用51，可以制备出性能较好的支架。Yoon等52-53采用气体发泡/盐浸的方法制备了高度多孔的PLGA生物支架,很好地解决了支架结构的闭孔问题。Ju等54采用该方法制得孔隙率在87%-93%，孔径大小在100-300 mm之间的复合有氨基酸的左旋聚乳酸支架，与未复合氨基酸的左旋聚乳酸支架相比能更好地促进软骨细胞的黏附和增殖。化学发泡法主要是将聚合物溶液和碳酸盐类化合物混合后浇铸成型，待有机溶剂挥发后再进行加热处理，最后经冷冻干燥而制得支架55。将可以产生气体的化合物代替氯化钠作为致孔剂目前被广泛用来制备多孔支架56-57，它能同时起到发泡剂和致孔剂的作用，在实际操作中既可单独使用，也可以和氯化钠配合使用。Lee等58利用制热碳酸氢铵分解出CO2和NH3采用气体发泡并结合其他方法曾经制备了左旋聚乳酸纳米-微米双重孔结构的多孔支架。同理，也可以单独使用碳酸氢铵作为发泡剂及致孔剂制得所需的支架样品。Lin等56利用不同比例的碳酸氢铵和氯化钠作致孔剂，通过此法制备出所需支架。以上研究表明，沥滤法和发泡法结合使用保留了传统沥滤法的优点，并且无机盐滤除更快更彻底，同时又具有良好的孔-孔连通性。3 总结与展望 Conclusions and prospects组织工程多孔支架的力学性能主要由支架的孔径、孔隙率及连通孔径等结构参数决定，支架的结构特征直接影响着细胞的增殖及分化功能59-60。选择合适的制备方法，将有利于支架性能的发挥。目前研究发现，支架中孔径的大小对组织的重建有着直接影响，孔径为100-250 m的孔有益于骨及软骨组织的再生。由于通过溶液浇铸/粒子沥滤法、气体发泡法所制备的支架孔径大小在这一范围内，因此比较适合用于骨、软骨组织工程支架的构建。目前，研究人员通常将多种方法结合起来，如气体发泡/盐浸57、气体发泡/萃取法61、热致相分离/溶剂萃取62、冷冻固定/冷冻凝胶63、注塑成型/挤出发泡等64，以期能制备出生物和力学性能方面更加仿生的组织工程多孔支架。作者贡献：第一作者和通讯作者构思并设计本综述，分析并解析数据，所有作者共同起草，经通讯作者及第二作者审校，第一作者对文章负责。利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。伦理要求：无涉及伦理冲突的内容。学术术语：熔融沉积成型-使用热塑性高分子原料，利用热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、沉积，并凝固成型，经过逐层沉积、凝固，最后除去支撑材料，得到所需的三维产品。作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。4 参考文献 References 1 Hunziker EB.Articularcartilagerepair:basicscienceand clinicalprogress. 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