大鼠肝微粒体的制备.doc

2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1购买实验动物 SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：00557062大鼠肝脏灌流 购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mgkg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。3灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。4将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4条件下9000g 离心20 min。5保留上清并转移到超速离心管中，在4条件下100000g 离心60min。6保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。7 将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。8微粒体蛋白浓度测定 依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。9肝微粒体中P450 酶含量测定 根据Omura and Sato 的方法(Omura andSato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.30.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池， 400 nm500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450490) 1000)/(91 C) (2.1)其中，A(450490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450氧化酶活性测定一、目的要求1. 掌握肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定方法。二、实验原理外来化学物质在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450 酶（CYP450）系进行氧化、还原、水解等代谢。许多药物对细胞色素P450 酶系活性有抑制或诱导作用，当与其他需经CYP450 代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，从而产生药物相互作用。制备肝细胞微粒体，并测定其内细胞色素P450 酶系的含量与活性，可为进一步研究外来化学物质物对肝微粒体细胞色素P450 酶系的影响提供依据。肝微粒体细胞色素P450 酶系活性测定中，本实验首先应用Lowery 法测定肝微粒体蛋白浓度，其显色原理为Flion酚试剂与蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基反应所致。细胞色素P450含量测定采用CO 还原差示光谱法，还原型细胞色素P450 可与一氧化碳结合，在波长450 nm处出现最大吸收峰，因此可应用紫外分光光度计于波长450 nm 处进行测定，而氧化型细胞色素b5 经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5，在波长423 nm 处呈最大吸收，因此可通过测定还原型与氧化型细胞色素b5 的差示光谱来进行。三、仪器与试剂实验动物：Wistar 大鼠，雄性，体重21213 g。主要试剂：羧甲基纤维素钠，氨基吡啉，红霉素，7-乙氧基香豆素，NADPH，牛血清白蛋白，甲醛。实验仪器：紫外/可见光分光光度计，荧光分光光度计。四、实验步骤1. 给药：8 只雄性Wistar 大鼠，给予0.25%羧甲基纤维素钠1 ml，每日灌胃1 次，连续7 d。d 7，禁食1 夜，次日断头处死。2. 动物处理与肝微粒体蛋白的测定大鼠断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔，取出肝脏，用0.15 molL-1 KCL-0.2 molL-1 蔗糖（pH 7.5）洗净表面血污，用滤纸吸去表面血液，称肝重。将肝脏剪碎，用上述缓冲液洗2 次，充分去除肝脏血液。按每克肝脏组织加3 ml 缓冲液的比例加入0.15 molL-1 KCL-0.2 molL-1 蔗糖，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆；10 000g，4离心20 min。取上清液转移至超速离心管内，105 000g，4离心60 min。弃上清，淡红色沉淀物即为肝微粒体。将肝微粒体沉淀取出后用0.05 molL-1Tris-0.25 molL-1 蔗糖（pH 7.5）悬浮，经超声细胞粉碎仪混匀后，分装于冻存管中，干冰速冻后，置-70冰箱保存。大鼠肝微粒体蛋白浓度测定：Lowery 法。3. 牛血清白蛋白标准曲线制备在试管中分别加入0、25、50、100、150、200、250 mgL-1系列浓度的牛血清白蛋白溶液1 ml，然后加入5 ml Flion 酚试剂甲混匀，室温放置10 min后加入0.5 ml Flion 酚试剂乙（1 molL-1），立即混匀，30 min 后，以不含蛋白质的试剂空白对照于紫外分光光度计760 nm 波长处扫描。以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标，OD值为纵坐标，进行线性回归，求得牛血清白蛋白线性回归方程。4. 样本中蛋白浓度测定将待测大鼠肝微粒体样本稀释50 倍，加入稀释后样本1 ml，其余同标准曲线操作步骤。依据线性回归方程计算待测样本中蛋白含量。5. 细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法。吸取0.05 molL-1 Tris-0.2517molL-1 蔗糖溶液5.5 ml，加入稀释为5 mgml-1 的待测微粒体悬液0.5 ml 及10%连二亚硫酸钠0.04 ml，立即混匀。等量分装到两个比色杯中，分别作为对照和样本，于样本池中比色杯充一氧化碳30 s，紫外分光光度计450 nm 向490 nm 扫描。计算公式如下：nmolmg-1 蛋白=OD（450 nm-490 nm）100091稀释后蛋白浓度（mgml-1）_HLM Preparation.To allow for sufficient microsomes to perform all assays, three livers were prepared for each of the three experiments (the force of the first centrifugation, homogenization buffer, and homogenizing strokes). Approximately 10 g of liver per experimental treatment was allowed to thaw in a room temperature homogenization buffer (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.125 M potassium chloride and 1.0 mM EDTA). After transfer to 25 ml of chilled homogenization buffer (plus or minus 0.25 M sucrose in the buffer experiment), livers were minced thoroughly with scissors and homogenized with 10 strokes (6, 8, or 10 strokes in the strokes experiment) using a Teflon-glass homogenizer (870 rpm). Strokes were even and steady, lasting approximately 15 s for passage, except for the first two strokes where greater pressure and time were spent on material on the bottom of the glass tube. The tube was submersed in a small bucket of ice and water during all homogenization. The homogenate was diluted to 4 volumes of sample weight (approximately 40 ml). The samples then were centrifuged at 12,000g (9,000, 10,500, or 12,000gin the force experiment) in a Sorvall RC-5B with a Sorvall SA-600 rotor for 20 min (Sorvall, Newton, CT). The supernatant from the first centrifugation was removed, the mitochondrial pellet was resuspended in 25 ml, and the centrifugation was repeated. The supernatants were combined and centrifuged at 138,000g in a Sorvall Ultra Pro 80 with a Sorvall T-1270 rotor for 60 min. The upper lipid layer was removed and the cytosolic supernatant collected. The microsomal pellet was resuspended in 0.125 M KCl, 0.1 M Tris (pH 7.4) with t