细胞破碎方法综述.doc

2011级生物工程专业论文细胞破碎方法综述细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法1前言目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。 自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。2细胞破碎技术21高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。22振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振汤机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便.23高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 。24超声波破碎法（ultrasonication）超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。25渗透压冲击破碎法（osmotic shock）渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。26冻融破碎法（freezing and thawing）将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。27酶溶破碎法（enzyme lysis）利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。28化学破碎法（chemical treatment）采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂3超声波破碎法具体应用 3.1超声波处理 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于1520KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。 存在问题：对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用.超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用，能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热(42-43)，因为正常组织的临界致死温度为45.7，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡，使肿瘤出血、组织瓦解以致坏死。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温 (约5000)、高压(可达500104Pa)，可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。简单说就是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质(如水)而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。3.2超声波应用 超声波细胞粉碎机是利用一种超声波在液体中产生空化效应的多功能、多用途的仪器；它能用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用于各类无机物质的破碎重组，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡清洗及加速化学反应等。超声波细胞粉碎机有广泛的用途，如: 3.2.1超声波提取生物纳米(超声波化学合成法)超声波化学反应中，起关键作用的是声波的空化效应，在超声波的辐照过程中，在液体里将发生空化气泡的形成，长大和崩灭，当空化气泡崩灭时产生一个覆盖着的强压力脉冲，产生许多独特的性质，例如产生高达5000K的高温，大于200Mpa的压力，这就是超声波化学合成的能量来源，利用这些能量能在一些特殊粉末表面合成出纳米粒子。 3.2.2超声波制药 (1)注射用医药物质的分散将磷脂类与胆固醇混合用适当方法与药物混合在水溶液中，经超声分散，可以得到更小粒子供静脉注射。 (2)草药提取利用超声分散破坏植物组织，加速溶剂穿透组织作用，提高中草药有效成分提取率。如金鸡纳树皮中全部生物碱用一般方法侵出需5小时以上，采用超声分散只要半小时即可完成。 (3)制备混悬剂在超声空化和强烈搅拌下，将一种固体药物分散在含有表面活性剂的水溶液中，可以形成1um左右口服或静脉注射混悬剂。例“静注喜树碱混悬剂”“肝脏造影剂”、“硫酸钡混悬剂”。 (4) 制备疫苗将细胞或病菌借助于超声分散将其杀死以后，再用适当方法制成疫苗。 3.2.3超声波对化妆品的分散 为了更进一步提取药物精华和粒子微细化，并节约生产成本，达到分散、乳化效果，使化妆品更深入渗透到肌肤里层，让肌肤很好的吸收，发挥药物的效力和作用，采用超声波乳化可达到非常理想的效果。采用超声分散，则不需要使用乳化剂，就能使蜡及石蜡乳化、化妆水等油的微粒子分散。石腊在水中分散的粒子直径可达1um以下。 3.2.4超声波对酒的醇化催陈技术 一瓶美酒以它的酒味醇厚，绵软柔和、芳香浓郁为人青睐，人们常用陈年老酒来形容酒的珍贵，一瓶上世纪的陈酒，标价几万元，其价格的含义在于时间的存放上。酒的主要控制因素是化学变化即酸的形成，并进一步酯化，酯参与乙醇和水的缔合。刚出厂的酒含有戍醇，有辛辣味，这种气味要经过很长时间才能化解，这个缓慢变化称酒的醇化。用功率1.6KW，频率17.5-22KHZ的超声波处理5-10min，可使酒的老熟时间缩短1/3到1/2。 因此超声波细胞粉碎机可以并且已经被广泛用于生物化学、微生物学药理学、物理学、动物学、农学、医学、制药等领域的教学、科研、生产。 5.总结随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。动物细胞培养的产物有的分泌在细胞外，动物细胞培养的产物大多分泌在细胞外培养液中，微生物的代谢产物有的分泌在细胞外，也有许多是存在于细胞内部，例如大肠杆菌表达的基因工程产物、某些酶制剂（如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等）。而植物细胞产物，多为胞内物质。为了提取胞内的蛋白质、酶、多肽和核酸等生化物质。首先必须收集细胞或菌体，进行细胞破碎。细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度的释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化。微生物细胞核植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎。遗传基因和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变形和被胞内的酶水解。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎