基于高光谱成像的黄瓜叶内叶绿素分布的无损检测.doc

基于高光谱成像的黄瓜叶内叶绿素分布的无损检测Zou Xiaoboa, Shi Jiyonga, Hao Liminb, Zhao Jiewena, Mao Hanpinc, Chen Zhenweia, Li Yanxiaoa,Mel HolmesdA 中国江苏大学食品与生物工程学院，中国江苏镇江 B 中国汉麻材料研究中心，中国北京C 中国江苏大学中国农业工程重点实验室，中国江苏镇江 D 英国利兹大学食品科学系，英国摘要 本研究的目的是调查的光谱反射率之间的关系和叶绿素含量来发展一种基于高光谱成像的黄瓜叶内叶绿素分布的无损检测技术。在450-850纳米范围的立方体黄瓜叶的高光谱图像数据进行了采集和处理。六十个光学数据或指数作为一个功能相关的反射特定纳米波长，在文献中提出文献是用来预测黄瓜叶片中叶绿素的总含量。最后,R710/R760, (R780 R710)/(R780 R680), (R750 R705)/(R750 + R705), (R680 R430)/(R680 + R430), R860/(R550 R708),和一个根据红边位置经过线性外推方法所估计的指标被确定为理想指标。红边波段（680780 nm)）出现在这些理想指标中表明了红边位置在估计叶绿素时的重要性。当(R695705)1 (R750800)1，最好的指数适用于独立的验证设置，叶绿素含量（r=0.8286）得到了合理的预测表明了模型的稳健性。根据实例，这种技术能够识别和描述各种叶绿素的相对含量及在黄瓜叶中的分布。图表显示在边缘叶绿素处于一个相对的较低水平，可以看到在主叶脉和一些出现暗绿色组织的区域含有更高的叶绿素。我们的研究表明，高光谱成像有相当大的希望可以预测的叶子的色素而色素可以用于原生植物样品的无损检测。1. 引言叶绿素是常见的有机化合物因为他们是自然存在于植物并给其特定的颜色1。在体内，这些色素在光合作用中发挥着重要作用，蔬菜的营养状况与光合色素含量高度相关2。光合色素率技术可以提高农场经营效率，减少农场对环境的影响，在领域内，这些都刺激着为寻找有效方法而进行的积极研究。传统方法的色素分析，通过萃取光度法或高效液相色谱法测定，需要破坏测量叶，因此，随着时间的推移不允许单叶中色素含量变化的测量3。此外，该技术是费时和昂贵，从而使整体景观植被健康和生态系统的评估不切实际。此外，不论其来源原生的或提取的叶绿素是脆弱的分子和容易修改，拥有能够快速准确的识别和量化叶子的色素4。反射光谱信息的潜力结合数据图像处理（例如，导数分析）已引导了遥感技术的最新进展，几种用于定量和半定量各种植物叶片中的叶绿素估计的导数指标已经被发表了2.。相比于那些像人工神经网络，遗传算法或支持向量机一样复杂的模型，基于二到四波段的指标更实用，因为其很普遍且不适用的风险更低一些。两个独立的带比和归一化差异指数被广泛用于评价氮气/叶绿素状态，此外，表面吸收的第一差异转化，相互反射的对数，被认为是对新鲜大枫叶的氮和叶绿素的最好预测5。当使用较大的实验数据库，一个用于计算四个离散波段的双差指数可以给出很好的叶绿素的估计6。相比于一些常用指标，一些基于红色边缘反射的指数是更好的叶绿素含量的指标。红边位置定义为植物反射光谱在红色和近红色区域的最大坡度，是不容易被干扰的因素且被认为是叶绿素含量的最佳估计。当应用多个物种和功能型植物时，一些发表的光谱指数与叶片叶绿素含量的相关性相对较差7。因此，如何选择最佳的指数是一个有趣的问题。光谱分析时，新鲜叶片组织比干燥，地面上的叶片组织有更多的问题，许多叶片蜡质角质层可引起高光谱反射率8,9。水会强烈的吸收红外辐射且新鲜植物里的细胞结构会散光是因为光以不同的折射率通过水和空气的界面。这些现象可能掩盖细微的弯曲和伸展的化学键引起的吸收现象。此外，由于组织细胞和细胞器，鲜叶中的化学成分的分布并不均匀。大多数的蛋白质和叶绿素包装成叶绿体迁移和聚集，这主要取决于光环境和在细胞壁中的木质素1012。光谱仪器技术的最新进展提高了估计枝叶生化物质浓度或总含量的可能性，各种非侵入叶片颜料预测技术，视频图像分析1315和光谱学16的是潜在的在线实施方法，彩色视频图像分析系统，可以在三个不同的波长或波段捕捉图像。现代数字红，绿，蓝图像可以有很高的空间分辨率，但是有一个有限的光谱分辨率，光谱仪提供了可见光和近红外光谱区的高光谱分辨率的信息，但几乎没有空间信息。包括数码相机和光谱仪的高光谱成像系统，可以取得高空间和光谱分辨率的图像内容17。因此，该系统可以认为是视频图像分析系统与数百个窄的光谱波段的延伸。由于高光谱成像，每个像素的频谱和每个窄带的灰阶色调图像都可以得到。高光谱成像已经成功的测试了几个高精度的农业应用试验1821。高光谱成像在捕捉空间和生化信息的同时，可以更精确地预测叶绿素。此外，高光谱成像可以给出鲜叶中的化学成分分布。现在黄瓜在世界中是一个普遍品种，随着中国的发展，在温室栽培的黄瓜正在增加，这种培养需要精确的用水和施肥。本研究探讨了光谱的反射率和叶绿素含量之间的关系和利用高光谱成像发展一种非破坏性的叶绿素估计及其在黄瓜中分布的技术。2 材料与方法2.1 黄瓜叶黄瓜叶片被用于实验。所有被调查的植物从2009年10月10日至2009年12月16日和2010年3月20日至2010年5月26日，在江苏大学在中国的温室土壤条件下生长。植物培养作为参考 22。植物开花一个星期后，三片叶在上部，中部和下部的植物拥有不同的色素含量。每天15片叶子被测量其中包括所有光谱收集和分析质量测量，总共100片叶子被收集。2.2 图像的采集和预处理在我们实验室开发的基于近红外视频图像分析的高光谱成像系统被用于给叶子拍照，该bci4-u-m-20-lp相机有一个空间分辨率为12801024像素。光谱仪v10e，有一个范围为4001000纳米的光谱和30微米的狭缝，提供一个2.8纳米波段的光谱。机配备了12.5毫米镜头，系统扫描每一个目标的单一空间的线，并从每行元素或像素光谱摄谱仪分散光。因此，每个光谱图像包含一轴（1280像素）且在其他轴（1024像素）的光谱像素。为了获得一个三维（3D）的光谱数据立方体，叶子要沿着第二个空间维度被扫描。一个线性电动滑块（型号：zolix ts200ab，zolix。集团公司，中国）是用来移动样品的步进电机。控制步进电机的计算机通过串口使相机扫描和运动可以同步进行。选择方形像素的扫描率，当图像采集时，叶子传达了一个优化速度为每秒1.58毫米的视场，视野是一个6厘米的长和180微米宽的线区。进入视野后，样品的高光谱图像采集和图像通过USB传送到电脑并存储起来在文献23得到描述。为了纠正相机暗电流对图像的影响以及获得相对反射率，在镜头上盖上帽和白色参考下，获得一个暗的图像和白色图像。每个叶子上选出一个100200像素的矩形区域（图1），通过平均关注区域内的每个像素来计算每个图像的相对反射率。总共一百个样本共获得一百个反射光谱，经过十一个点的均值滤波和以消除在每个频谱的光散射促进基线的变化的标准正态变量，每个频谱都平滑了。标准正态分布将每个频谱转变为一个平均强度为零和标准偏差的频谱24。2.3 叶绿素的测定从每个叶片的划定区域取出五千克鲜重用于色素提取，为了这些目的，在叶片的光合色素中提取80的丙酮，并两次在5000重力下离心15分钟，分光光度计叶绿素浓度的测定和计算单位鲜质量的基础上使用Lichtenthaler和Wellburn方程3。2.4 叶绿素光谱指数.六十个参考指标已经被研究出来了，表1列2列出了这60个指标的指标。线性回归建立在校准过的表1数据之上，为了验证这些模型的优越能力，每个LR校正模型是用来预测的校正数据集和测试数据集。平方根校正，均方根误差预测和每个校准数据集和验证数据集模型的相关系数的绝对值都被考虑进去23。2.5 估计每个像素叶子的叶绿素浓度基于表1中数据的最佳校正模型是用来估计每个像素叶子的叶绿素含量，结果表明叶片中的叶绿素含量分布。2.6 软件所有的图像处理和数据分析程序描述都使用在Matlab7.1开发的程序，从高光谱图像上提取的光谱使用的是ENVI4.3（ITT公司视觉信息化解决方案，博尔德，美国）。表1用于估算在可见和近红外（可见/近红外）区域的叶绿素浓度的反射指数3 结果与讨论3.1 测量叶片中叶绿素含量100片黄瓜叶绿素含量的描述性统计和参考方法都列于表2，所有的叶片样本的标准偏差为没克1.2557毫克，100个样本分为校准集和验证集，为了避免子集选择的偏差，采用2:1的校准/验证。所有样本进行了排序，根据各自的叶绿素含量的参考测量值。每三个样品光谱选择两个进行验证，终于使校正集包含66光谱和验证集34。表2总结了叶绿素含量参数。3.2 高光谱遥感图像的研究高光谱成像系统获取丰富的空间信息的同时收集光谱信息，其从黄瓜叶样品中获取的立方体的高光谱图像数据如图1（a）所示。原始的反射图像先采用平场校正（公式1），图1（b）是在三个波长位于红（670纳米），绿（525纳米），蓝（460 nm）的区域组合的光谱图像，因此，出现了类似的自然色。当波段上升时，图像的强度发生了变化。在合并后的图像不同的位置选择三个区域如静脉区叶（静脉），叶（绿色）绿色叶肉面积，黄色叶肉叶面积（黄色），如图1（b）所示。对三个区域内的1010像素的平均反射光谱进行计算，并在图1（d）中标出，可以看出三个领域的平均光谱有大的变化。因为鲜叶中的化学成分分布在细胞和细胞器的组织中是不同的，光谱特征因此与叶影像不统一。样本的选定区域变得非常重要且对预测模型的性能产生深远的影响。在这项研究中，叶的选取的矩形部分位置主要根据文献。 48，这部分的叶子用于叶绿素的测定。平均光谱和平滑频谱如图1（c）所示。从图1（c）到图1（d）,850到1128之间的反射光谱是饱和的且有很多毛刺。为了避免低的信噪比，450-900纳米的范围内波长被进一步的处理。多元散射和基线由11分过滤器和标准正态变量更正22。从540到580纳米的反射波段与呼吸系统的色素有关就像760到850纳米的波段与水有关一样在其他文献中被提及48。黄瓜叶的代表单波段反射图像是从500至850纳米选定的8个波段，如图2所示。证明高光谱图像的一般模式不同光谱区域间的差异。从500到850纳米的其他波段的整个叶片的图像质量时相当不错的。叶片表面的叶静脉在750和850 nm之间的光谱区域显得更鲜明，静脉和正常叶肉之间的光谱在700纳米以下的对比是下降的是由于叶面上出现了黑斑。表2 黄瓜叶片叶绿素含量的校准和验证设置3.3 光谱和叶片叶绿素含量之间的关系电磁波段的可见光的反射率主要是受叶绿素含量的影响49，因此，在这一地区的反射光谱可以用来估算叶绿素的总含量。相关图提供了一个有用的光谱和叶片叶绿素含量之间关系的可视化表示（图3）。在可见光区域相关系数的绝对值更高一些，在约710纳米的波长得到最大绝对值0.70，如图 3（a）所示。叶绿素含量的相关性和相关性最高的光谱波段的幅度都类似于其他使用感官的研究方法7,39。大部分红外尤其是那些低于750 nm的波长区域，反射率的相关性更差，这些波长对叶绿素含量正常的变化很有用2。光谱数据的一阶导数计算使用11个移动窗口和叶绿素含量相关的二阶多项式如图3（b）所示, 由于第一差的变化，跨越高度相关的多个可见光的领域和红外区域，虽然带宽窄，但反射率绝对值的相关性普遍较高。一阶导数的大小和叶绿素含量之间的牢固关系被标出，叶绿素的相关性存在于红边区域（695705纳米）和524528，566613纳米的开始边缘，同样，玉米的叶绿素含量和一阶微分光谱之间很强的相关性在文献7被提到。然而，图3显示，相关系数均小于0.70。因此，叶片的反射率和反射率的一阶微分值与叶绿素含量的相关性较差。3.4 叶片叶绿素含量和光谱指数之间的关系表1中所列的光谱指数和在这项研究中的黄瓜叶片的叶绿素含量有关。为了评估这些指标的性能，建立了各指标的线性回归模型。每个模型的相关系数的均方根误差校正，预测均方根均方根误差预测和绝对值都设置了校准数据集和验证数据集，如表1所示。表1的这些指数可分为以下三类：（1） 固定波长的反射率指数。例如，R675（在675 nm的叶绿素a的吸收反射是最大的）和总叶绿素总含量有关4。在675纳米的低反射率降低了其对叶绿素a变化的敏感性。在550 nm处的反射率已经被那些通过对叶绿素含量的影响得出建模在675纳米是应为较低的叶绿素行列而又搞的灵敏性和在550纳米时叶绿素含量高的研究者提出。在这项研究中，R550的性能比R675更好，因为叶绿素含量的平均值为1.25属于高含量按文献 7来说。这些指数的优点是简单，容易理解和切实可行的，然而，它们对生物，辐射变量，背景的影响，和几何排列的场景，传感器，和表面非常敏感。（2） 基于两个或三个固定波长的指数。为了消除任何添加和乘法因素，两个离散带的比值和归一化差异被广泛用于评估氮/叶绿素状态。蓝色（约450纳米），绿色（约550 纳米），红色（650-680纳米）和近红外光谱（720-870纳米）都是常见的频段。Penuelas等人 43定义了一个使用使用近红外波段（800纳米）作为减去的和参考的结构无关的色素指数。然而，该指数（R800-R550）提供了一个与叶片叶绿素含量相对较差的相关性。由卡特 27 发展的R710/R760的简单比值（4到25，表1）取得了良好的效果（均方根误差=0.2844，均方根误差预测=0.2714）。在修改后的反射比或衍生物，列在表1从26号到46号，（R780-R710）/（R780-R680）由马乔尼等人提出40 （R750-R705）/（R750+R705）由梅尔兹利亚克给出31，（R680-R430）/（R680+R430）由Penuelas等给出43。Datt公司给出的R860/（R550R708）比别人有更好的表现，尤其是，R860/（R550R708）取得的成果，如表11所示。（3） 解读光谱特征复杂程度指数红边位置使用一下方法：最大的一阶导数谱，倒高斯拟合技术45和线性外推技术46。近年来，植物的衍生光谱指数和红边特征的反射模式被证明对叶绿素含量是非常敏感的，而他们往往以减少背景和大气的影响7所造成的噪声谱，同时它们使由背景和大气影响的噪声光谱降到最低7。吉特尔森2等人发现(R)1 (RNIR)1(RNIR)X (695705 纳米) 可调节叶片结构的差异，并进一步增加叶绿素估计的准确性。在这项研究中，吉特尔森给出了的R695-705）-1 -（R750-800）-1，（R750-800/R695-705）- 1和斯基德莫尔给出的基于红边的位置和线性外推法估计的指数用于黄瓜叶绿素估计取得了很好的效果。（R695-705）-1 - （R750-800）-1是校正集和验证集最好的结果，如表1所示。在表1中该指数计算和黄瓜叶片叶绿素含量是高度相关的，应当指出的是，红边波段（680-780纳米），特别是波段（700-715纳米）出现在这些更好的光谱指数，表明了红边位置估计叶绿素的重要性6,35,37,40。（R695-705）-1 - （R750-800）-1可能被视为基准消除功能，因为R750-800是最高的光谱区域，而R695-705是最低的光谱区域如图1所示，这是为什么（R695-705）-1-（R750-800）-1指数的噪声稳健性是令人满意。多元线性回归和最小二乘回归是校准光谱数据中使用的两种常见的多元方法47。用两种方法对最佳指标进行比较，最小二乘在全光谱范围内，多元线性回归和最小二乘在选取的区域（R430，R550，R680，R705，R708，R710，R760，R780，R800）提供了非常相似的结果根据表1中的最后三个行所示的比率。然而，多元线性回归和最小二乘模型比最佳模型略微复杂。表1的一些指数与黄瓜叶片叶绿素含量的相关性较差。这可能是由于以下原因：（1）不同物种之间反射波长或长或短，（2）选定波长跳跃或多峰的特点的变化使结果不稳定，（3）指数和叶绿素含量之间的关系不是一般的线性和（4）采用的技术和传感器的灵敏度。绿素含量估计指数的性能变得不稳定以及对计算方法和物种选择都有较强的依赖，这得到了这一领域内研究人员的认可。这意味着当不同的传感器用于不同物种时有必要开发新的指标3.5估计每个像素叶叶绿素浓度（R695-705）-1 -（R750-800）-1指数被用来估计每个像素叶叶绿素浓度，图4显示了总叶绿素的相对含量基于最佳指数在叶片上的分布，并根据带的强度着色。叶绿素整体的分布和基于单点测量的结果是一样的。图表显示叶绿素在叶边和黄色叶肉的区域的水平相对较低，在沿静脉两边和深绿组织的区域水平更高。在图4，沿着主脉有一个黄色纤维，表明这个区域的叶绿素含量没有叶肉组织那么高，然而，可以明显的看到叶绿素主要积累在暗绿色的原发性和继发性静脉之间的叶肉组织里。4结语结果说明，高光谱成像是一种强大黄瓜叶绿素分析工具，这些色素可以在原生植中提取和无损检测植物样板。在高光谱图像的采集和预处理之后，黄瓜叶片的红边区域的平均谱被用于模型的开发。六十个数据或指数作为一个功能相关的反射特定波长的文章中列出的是用来预测总叶片叶绿素的含量。R710/R760，（R780-R710）/（R780-R680），（R750-R705）/（R750+R705），（R680-R430）/（R680+R430），R860/（R550R708），（R695-705）-1 - （R750-800）-1和基于红边的位置和线性外推法估计的指数是最佳的指标。红边波段（680-780nm）的出现在所有的最佳指标里，表明红边位置对叶绿素估计的重要性。当最好指标（R695-705）-1 -（R750-800）-1被用于独立的验证集时，叶绿素含量得到合理地预测表明了模型的稳健性。根据样品的不同，这种技术可以鉴定和表示黄瓜叶片内分布的各种叶绿素的相对含量。此外，高光谱成像可以将部分或全部的植物样品中的叶绿素分布的详细地描述出来。因此，高光谱成像可以监测活组织内的色素分布及变化，这可能对色素参与生物过程比如调节其生物合成途径，植物发育和衰老，植物应激反应和植物病原体相互作用是有价值的。致谢作者感谢提供财政支持的国家自然科学基金（批准号6091079），中国863的基础项目（批准号：2008AA10Z208，2011AA1008047），PAPD， 中国前100名的博士论文（200968），江苏大学的人才基础。图1合并后的光谱图像和反射从高光谱图像（a）高光谱成像数据；（b）结合在三个波长于红（670纳米），绿色（525纳米），蓝（460纳米）的图像；（c）选取黄瓜叶的高光谱成像；（d）叶脉，叶肉绿色和黄色叶肉面积的反射(黄色)图2从500到850纳米的选定波长的黄瓜图像图3叶片叶绿素含量和反射的相关图（毫克/每克）（a）和反射的一阶导数（b）图4基于最佳指数对叶的叶绿素分布参考文献1 C.B. 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