单克隆抗体的制备应用研究.doc

单克隆抗体的制备应用研究制备单克隆抗体的过程中，免疫小鼠和检测常需用特异性抗原。然而，对于一些组织或细胞（如肿瘤细胞、组织抽提物等），因成分复杂，提纯方法繁琐或不易提纯，应用这样的抗原进行免疫，势必减低或干扰特异性抗原诱导的免疫应答。另外，其中的混杂物刺激机体产生的抗体也会干扰对特异性抗体的检测，增加筛选的工作量1。在用混合抗原免疫小鼠时存在着一种偏倚，即获得的抗体多是针对强免疫原性抗原的抗体。为了获得对弱免疫原性抗原或稀有抗原的理想免疫效果，曾采用了多种免疫方案，如体内免疫（皮下、腹腔、静脉和脾内免疫等）及体外免疫等2。1983年Matthew等3首次应用免疫制剂-环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)免疫小鼠，开创了以免疫抑制法制备特异性单克隆抗体的工作。此后应用此方法又成功地制备了抗神经轴突生长因子的抗体等4。以下介绍环磷酰胺免疫抑制法在单克隆抗体应用中的研究情况。1理论基础这种免疫方案是建立在一个假说的基础上。其含义是，当抗原诱发一种正常的免疫应答时，B细胞与T细胞克隆均发生增殖，处于分裂期的细胞易被烷基化药物(如CP)选择性地杀死，因而当相同成分的抗原再次进入体内时，对其的免疫应答便即被抑制6。Turk等9研究表明，CP用处理确实可以减少B细胞与T细胞克隆的增殖。因此，CP被用来抑制非目的抗原的免疫原性，减少非目的抗体的产生，从而增加了对目的抗原免疫应答的机率，减少了筛选的工作量，有可能在不纯化抗原的基础上有目的地获得预期的单克隆抗体。2基本方法免疫抑制法免疫的基本步骤是：取A，B两组成分相近的混合抗原（如组织抽提液），A组中含有目的抗原，B组中不含有目的抗原。先用B组抗原免疫小鼠，同时用CP处理或分别在注射抗原后10 min，24 h和48 h，再注射CP（100 mg/kg体重）；两周后重复此免疫过程，使小鼠对B组抗原产生免疫抑制，然后再用A组抗原免疫小鼠。此时对A，B两组抗原中共有成分的免疫应答便被抑制，而对A组抗原中目的抗原的免疫应答则相对被加强，于是融合后获得特异性单克隆抗体的机率明显增加5 。3实验结果1987年Matthew等6用CP免疫抑制法，制备了几种单克隆抗体：(1)用刚出生的猴小脑免疫小鼠，同时用CP处理，再用出生11d的猴小脑免疫，融合后获得的单克隆抗体中，有85%为抗出生后11d猴小脑的单克隆抗体，而无抗刚出生猴小脑其他组织的单克隆抗体；(2)用成年猴的脊髓免疫小鼠，同时用CP处理，再用18d的胚胎脊髓免疫，获得的43株单克隆抗体对胚胎脊髓都可产生特异性免疫反应，而对照组则无获得 1 株具有特异性的单克隆抗体；(3)用成年猴的脊髓免疫小鼠，并用CP处理，再用横断的坐骨神经远端残干免疫，获得的147株单克隆抗体中有28株可与横断的坐骨神经起反应，其中17株对外周神经是特异性的；(4)用正常坐骨神经免疫小鼠，并用CP处理，再用横断的坐骨神经免疫，获得了764株单克隆抗体，其中37株对横断的坐骨神经起反应，20株对正常神经也有同样反应，而另17株则对横断的神经远端的相应抗原起反应6。Susan等5比较了免疫抑制法与免疫耐受法制备单克隆抗体的方案。他们先用猴的脑运动皮质免疫小鼠，同时用CP处理，再用其脑视觉皮质免疫小鼠。结果发现，融合后克隆的形成率及分泌抗体的孔数无明显变化；与对照组相比，能结合运动皮质和/或视觉皮质的单克隆抗体数略有减少，而只与目的抗原即视觉皮质结合的抗体数则明显增加（82/292,56/202；对照组为12/326），只与运动皮质结合的抗体数也有所增加（40/292,37/202；对照组为12/326），同时可与二者结合的单克隆抗体数明显下降（170/292,109/202；对照组为302/326）。用此种方法产生的特异性单克隆抗体的百分率比正常对照组提高了7.5倍。Matthew等6，Hisatsune等7和Blume等8分别证实该方案的有效性。1992年Salata等10用此种方法制备了1株抗突变型牛生长激素的单克隆抗体。他们用野生型牛生长激素免疫小鼠，同时用CP处理，然后用含有突变型生长激素相关抗原的抗原免疫。融合结果表明，免疫抑制法产生的特异性单克隆抗体显著增加（P=0.0001）。陆芹章(1994)11又用免疫抑制法制备了一组抗M17马红细胞的单克隆抗体。结果显示，抗体分泌孔的百分率受到抑制（7.8%，对照组为46.3%）；与对照组（1.59%）相比较，抗M17的特异性抗体数略有增加（为2.26%）；而抗M26的抗体明显减少（3.08%，对照为35.59%）。实验组出现抗非目的抗原抗体的百分率降低32.51%，经统计学t检验差别显著（P0.05）。单克隆抗体特异性鉴定的结果表明，对照组的非特异性较高。以上实验说明，CP免疫抑制法可抑制非目的抗原的免疫原性，明显减少抗非目的抗原抗体的产生，从而相对增加了抗目的抗原的抗体产生的机会，减少了筛选的工作量，是一种较好的免疫方案。本法的优点在于：(1)可用混合的组织抽提物直接免疫小鼠，避免了繁琐的纯化过程及其过程中抗原的丢失与活性丧失；(2)可制备出能区别两种相近组织成分的单克隆抗体，从而为一些特殊组织抗原(如癌基因产物、抑癌基因产物等)的分析提供了新的手段。免疫抑制法还可以用于制备抗独特型(anti-idiotypic)抗体。Matthew等6 研究表明，CP可减少被激活的T抑制细胞，用于增加小鼠对氨基葡萄糖烯糖(glycosaminoglycans,GAG)的自身免疫反应，以制备相应的单克隆抗体。在用肝素、软骨素免疫和CP处理后，再用同样的GAG免疫小鼠，通过融合获得了相应的单克隆抗体。用类似的方法还获得了针对透明质酸、岩藻糖的单克隆抗体。Jerne提出的网络学说认为，抗原免疫动物后，可诱发针对抗原及其单克隆抗体中超变区上独特型的抗独特型抗体12。在通常的免疫应答中，检测出的抗独特型抗体处于低水平。Cleveland等13用注射带乙酰胆碱受体的主动肌(agonist of the acetyl-choline receptor)免疫小鼠，制备出针对乙酰胆碱受体的抗独特型抗体。如针对独特型的淋巴细胞增殖在正常免疫应答中处于抑制状态，而CP增强了这种增殖反应，因此CP可能是影响了抗独特型抗原抗体免疫应答的调节过程。一个重要的问题是，药物诱发的抑制状态并不持久，而在每4周给予一次抗原和CP的处理下，则可使抑制状态维持一个相对长的时间6。当小鼠经4次不含目的抗原的混合抗原免疫和CP处理后，在随后的6周7周（有说5周以上）再用含有目的抗原的混合抗原进行免疫，便可诱导出针对目的抗原共有表位（shared epitopes）的强免疫应答，提示免疫记忆的存在。例如辅助T细胞能逃避CP的作用而保留在静止状态达4周以上的给药间期，与Stevenson等14体外研究的结果相一致。说明在此免疫方案中，CP应至少每4周使用一次。值得注意的是，CP的作用效果难以控制。因其不能完全抑制抗非目的抗原抗体的产生，而药物本身的毒性作用往往可引起小鼠免疫系统的全面抑制，使小鼠因感染等原因而死亡，导致免疫的失败11。尽管如此，CP免疫抑制法在单克隆抗体技术中的应用，为免疫工作者提供了一种新的途径。它已显示出较突出的优点，即可用未经纯化的抗原进行免疫，有利于保持抗原的免疫原性；也可以增强稀有抗原及弱免疫原性抗原的免疫应答，有利于获得预期的抗体，减少了筛选的工作量等。然而，作为一种较为少用的免疫方案，CP免疫抑制法又存在着一些不足，还有待于今后工作中进一步积累经验，逐步完善。参考文献1徐志凯. 实用单克隆抗体技术. 陕西科学技术出版社，1992:82徐志凯. 实用单克隆抗体技术. 陕西科学技术出版社，1992:93Matthew WD,Patterson PH . Cold Spring Harbor Symp Quant Biol，1983; 48: 6254Chiu A Y,et al. J Cell Biol，1986; 103:13835Susan Ker-hwa Ou,et al. J Immunol Methods，1991;145:1116Matthew WD,et al. J Immunol Methods，1987; 100:737Hisatsune T,et al. J Immunol，1995; 154(1):888Blume G,et al. Neurology，1995; 45(8):15779Turk JL,et al. Immunology，1972; 23:49310 Salata RA,et al. Anal Bio