体外无细胞体系为表达可溶性膜蛋白.docx

北京中生柏奥生物科技有限公司体外无细胞体系为表达可溶性膜蛋白提供新方案细胞中30%的蛋白质是膜蛋白。膜蛋白不仅参与和调节细胞的各种代谢活动，还是细胞与外界进行物质交换、能量转换和信号传递的桥梁。膜蛋白在细胞膜上形成通道、载体，对离子和可溶性代谢物进行选择性转运，一些膜蛋白还参与构成线粒体、叶绿体膜上的电子传递链，进行生命体生存所必须的能量转换。此外，膜蛋白还参与细胞识别和信号转导，产生相应的生物学效应。在“2006年诺贝尔奖得主北京论坛”上，德国马普学会生物物理研究所教授、1998年诺贝尔化学奖获得者米歇尔指出：绝大多数疾病都是由某一特定的膜蛋白缺陷引起的，市场上销售的80%药物都是针对膜蛋白。然而，在PDB（Protein Data Bank）的结构数据库中只有不到1%的资料是膜蛋白的结构数据。在解析的30145个人类蛋白结构数据库中，膜蛋白为325个，仅占1.078% （2015年12月04日数据）。膜蛋白结构解析的瓶颈在于难以得到可溶性蛋白，因此难以获得高度有序的三维结晶。膜蛋白含有数目不等的疏水区域，其完整蛋白具有两亲性，一旦从天然脂环境中提取出来，其非极性区域就倾向于形成无序化合物。膜蛋白表达量少，利用基因工程手段对其进行过表达会导致其对细胞产生毒性。体外无细胞蛋白表达体系为膜蛋白提供了一个很好的合成途径。以细胞裂解液为基础的体外蛋白表达体系，在表达膜蛋白的时候无需考虑其对细胞造成毒性的问题；由于无细胞蛋白表达是一个开放性的表达体系，可方便的控制反应体系的生化反应条件如pH、离子强度、氧化还原电位，还可以在体系中加入去污剂以及脂质体，使蛋白处于疏水环境避免聚集，促进蛋白的溶解性。因此，这种体外无细胞蛋白表达体系可专为目标蛋白设计优化，即体系中只合成目标蛋白，合成环境为靶蛋白的最适环境，因此最容易获得所需蛋白。相反的，在体内合成系统中，蛋白合成体系适合所有蛋白，而目标蛋白的合成和分离受到了很多限制。因此，无细胞蛋白表达体系为膜蛋白的表达做出了越来越重要的贡献，从2004到2015年间，PubMed中相关研究论文的数量增长了约8倍。无细胞蛋白表达体系表达膜蛋白有三种模式。P-CF 模式：无疏水环境，膜蛋白以沉淀形式表达；D-CF 模式：有去污剂提供疏水环境，蛋白以可溶形式表达； L-CF 模式：膜蛋白表达后直接整合到脂质体中。三种膜蛋白表达方式可以同时实施，也可以以下图这种连续方式逐步进行。对于每一种方式，添加剂的选择或多种添加剂共同使用在体系优化中都是很重要的。例如，如果要合成的膜蛋白中需要有二硫键形成，那么体系中需要氧化型和还原性谷胱甘肽共同使用进行氧化还原环境的调节以利于二硫键的形成。D-CF和L-CF是目前较常采用的模式，有研究表明，L-CF比D-CF表达膜蛋白获得了更高的蛋白产量和更好的溶解性。脂质体的头部基团类型、烷基链的长度以及烷基链的饱和度对其流动性、厚度、电荷和脂质双分子层的侧压都有影响。脂质体与膜蛋白直接作用直接影响了蛋白的折叠、稳定性和活性。日本爱媛大学做过一项统计，他们利用体外蛋白表达系统对40个含有1-14个跨膜结构域（TMD）的哺乳动物的膜蛋白进行表达，发现这些膜蛋白不同程度的结合了脂质体，不过，没有发现膜蛋白结合脂质体的比率与含有跨膜结构域的多少有关。德国RTS试剂盒中的大肠杆菌高产系统（E.coli HY）、大肠杆菌二硫键系统（E.coli disulfide）和麦胚系统（wheat germ CECF）都可以在去污剂、脂质体的配合下，高效表达膜蛋白。对于一些需要糖基化修饰的膜蛋白，RTS提供了昆虫系统的膜蛋白表达试剂盒（RTS Insect Membrane Kit），可以实现膜蛋白的糖基化修饰。RTS试剂盒表达糖基化膜蛋白日本cellfree science（CFS）公司的无细胞蛋白表达系统也提供了利用麦胚系统表达膜蛋白的试剂盒ProteoLiposome Expression Kit。脂质体的多少直接影响了可溶膜蛋白的产量。利用CFS无细胞蛋白表达试剂盒表达G蛋白偶联受体T1R1综上所述，无细胞蛋白表达系统为表达可溶性膜蛋白提供了新的选择方案。RTS 昆虫膜蛋白表达试剂盒可以实现膜蛋白的糖基化修饰，CFS的膜蛋白表达试剂盒具有更大的反应体系（4毫升，120微克）。（北京中生柏奥生物科技有限公司，代理德国RTS、日本CFS无细胞蛋白表达系列产品，电话010-606