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解放军总医院基础所分子生物学研究室 2011年7月 北京第一部分 DNA重组技术实验一 聚合酶链反应 【实验目的】 掌握基本PCR扩增方法及PCR反应条件优化。 【实验原理】 用PCR方法进行的基因扩增过程类似于体内DNA的复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的过程，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸三个步骤组成的不断重复的过程。每次重复的三个步骤称为一个周期，经过2530个周期之后，PCR产物以指数方式增加可达106 107。目前，人们已根据各种用途设计了不同的特殊PCR，本实验介绍的是经典PCR技术。 【实验材料】（一 ）模板DNA： 模板可以是单链或双链；可以是染色体DNA；亦可以是克隆的质粒DNA。本实验使用克隆的质粒pCDNA3.1-FHL2 (1g/l)经100倍稀释作为模板。表 PCR反应体系模板量以50ul PCR 反应体系为例人基因组DNA0.11g大肠杆菌基因组DNA10100ng质粒DNA0.110ngDNA0.55ng（二 ）2Taq PCR MasterMix: 0.1 U Taq Polymerase/l，500 M dNTP each，20 mM Tris-HCl (pH8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl2，其它稳定剂和增强剂，使用终浓度为1PCR buffer。适用于常规PCR反应、复杂模板如GC含量高（60%），有二级结构等的扩增和大规模基因检测。（三 ）引物： PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。1. 引物序列：本实验PCR 扩增片段FHL2大小约851bp。P1（FHL2-M1）：5- gga tcc gt atg act gag cgc ttt gac tg -3P2（FHL2-M2）：5- gcg gcc gc tca gat gtc ttt ccc aca gtc -32. 引物的浓度 公司合成的引物通常为干粉，使用前应先离心，然后再打开管盖溶解。通常配成贮存液浓度100pmol/ul，-20保存，使用浓度10pmol/ul，使用终浓度0.4pmol/ul。3. 引物稀释计算示例：例一： 假设引物合成量为1 OD，配成贮存液浓度100pmol/L ；引物长度20nt ；A/G/C/T平均分子量为324；因此，总分子量：20324=64801OD260=33ug，引物浓度为 33ug/6480=0.0050925 um=5.0925nm =5092.5pm 引物稀释：5092.5pm/100pM=50.9ul，即用50.9ul去离子水溶解，贮存浓度为 100pmol/ul。 例二：直接法计算贮存浓度为100pmol/ul。预稀释引物的微升数（ul）=OD数3310000引物分子量 【实验反应条件设置】 1循环温度及参数设置 典型的PCR循环由三部分组成： 模板热变性 退火 寡核苷酸延伸 变性温度与时间: 由G+C含量决定； 由DNA分子长度决定 退火温度与时间: 取决于引物的长度、浓度和G+C含量。引物长度为1525时，退火温度可选用Tm -5，时间30sec。 延伸温度与时间: 72 10min。 循环数一般以2030次为宜。 【实验器材】0.2ml PCR管 0.5离心管2400/ 9700 PCR扩增仪 冰盒台式离心机 水平式凝胶电泳设备 【实验步骤】 一、配制PCR反应体系 1按25l PCR反应体积配制反应混合液，用0.2ul PCR反应专用薄壁管，按下列程序依次加入试剂(装有2Taq PCR MasterMix的PCR管为反应管)，注意：模板DNA最后加，防止污染。成分加量（ul）终浓度模板10.110ngM1（上游引物）10.4pmol/LM2（下游引物）10.4pmol/L2Taq PCR MasterMix12.51Taq PCR MasterMixH2O 9.5补水至25 ul总体积 25 ul二、PCR反应条件2将上述液体混合，短暂离心以集中液体，置PCR仪依下述条件进行反应。PCR反应预变性变性退火延伸总延伸循环周期194 5min12941min 60 40sec7240sec3337210min1注意：反应结束后，如不立即使用，可将样品于-20暂时保存。三、 电泳观察结果配制0.8%琼脂糖凝胶。往25l PCR产物中加入10上样缓冲液4l，取5l上样进行电泳，观察结果。本实验PCR扩增DNA特异片段大小约851bp。其余样品用于实验三 “PCR产物回收”。 【注意事项】 PCR反应体系中的任何一个成分，对其结果都是非常重要的。由于PCR是以指数方式扩增，极微量的DNA污染都可能造成假阳性结果，因此反应体系的干净程度是非常重要的。需要实验者在操作中加以注意。1. 合理分隔实验室 根据各实验室不同的条件科分为样品的处理、配制反应液、循环扩增及产物的鉴定四部分。实验前应用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。2 分装PCR试剂 所有的PCR试剂都应小量分装，-20保存。3. 设立适当的阳性对照和阴性对照 为确保结果的可肯定性，每次反应都应有设置严格的对照。阳性对照：阳性模板；阴性对照：不含有被扩增核酸的样品作阴性对照；空白对照（或试剂对照）：一管不加模板的试剂对照。4. 防止操作人员污染 尽量一次性使用手套、吸头、离心管。选择质量好的PCR反应管，打开离心管前应先离心，开管动作要轻，以防管内液体溅出。5. 加样器 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因此吸样要慢，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶造成污染。设置专用的加样器用于PCR，这套加样器不能用于PCR的反应产物分析。实验二 水平式琼脂糖凝胶电泳电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的首选标准方法。根据制胶的材料可分为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶两类。琼脂糖凝胶分离度不如聚丙烯酰胺凝胶，但分离范围广，约100bp60kb的DNA分子，且操作简便。本实验重点介绍水平式琼脂糖凝胶电泳技术。琼脂糖凝胶浓度的变化形成大小不同的分子筛网孔，可分离不同分子量的核酸片段。 【实验原理】 各种生物大分子在一定的pH值条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中向相反电极移动。琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液，凝固后，形成一种固体基质，DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基，接通电场后，在中性pH条件下带负电荷的DNA分子由负极向正极迁移。不同长度的DNA 片段会表现出不同的迁移率，当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，DNA分子越大，摩擦阻力越大，越难于在凝胶孔隙中穿行，因而迁移的越慢，据此，DNA分子可以在凝胶中获得有效分离并测得其分子量大小。 该过程可通过示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以鉴别分子量相同但构型不同的DNA分子。在抽提质粒DNA分子中，由于各种因素影响，质粒DNA分子存在闭环（I型）、开环（型）和线性（型）三种构型，三者之间迁移速率一般为I型型型。有时也会出现相反的情况，I型共价闭环质粒DNA常态下为负超螺旋，当溴化乙锭嵌合在DNA碱基对之间时，I型DNA负超螺旋逐渐解开，其分子半径增加，迁移速率下降，当溴化乙锭浓度达到临界浓度时，不再有超螺旋，I 型DNA迁移率达到最小值，当溴化乙锭浓度继续增加时，形成正超螺旋，DNA分子迁移速率迅速增加。同时，由于电荷的中和，也由于溴化乙锭赋予DNA较大的刚性，型和型DNA迁移速率有不同程度的减少。 提取的质粒DNA样品中，如还有染色体DNA、RNA或蛋白，在琼脂糖凝胶电泳中也可以观察到，如蛋白质与DNA结合，在点样孔内产生荧光亮点，提取的质粒DNA如有RNA未被处理完全，在DNA条带前方有云雾状的亮带，由此可分析样品的纯度。 【实验材料】（一）仪器 稳压稳流电泳仪 水平式凝胶电泳槽 紫外检测仪 凝胶成像系统及凝胶图象分析软件（二）试剂15TBE（1L）：54.0g Tris ；27.5g硼酸 ；20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，用时10稀释，使用终浓度0.5TBE。2溴化乙锭（EB）：用水配制成10mg/ml的贮存液，分装，避光，4保存。310上样缓冲液： 0.25%(W/V)溴酚蓝；0.25%(W/V)二甲苯青FF；50% (W/V)甘油；10mM EDTA，4保存。4电泳级琼脂糖 5. D2000 标准分子Maker（TIANGEN公司） 【实验方法】（一）制备琼脂糖凝胶1. 准备电泳槽 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的连接线路。2. 配胶 根据所需浓度称取一定量琼脂糖加入，量取所需的电泳缓冲液（如：0.5TBE）倒入三角烧瓶中，加热。凝胶加热时间不宜过长，以免引起暴沸；如蒸发过多应补充部分缓冲液。凝胶浓度选择参照表2.1。3. 倒胶 待凝胶冷至50左右时（手感容器能耐受），在凝胶中加入EB至终浓度0.5g/ml，摇匀后缓缓倒入制胶模中，迅速放好梳子。凝胶的厚度在35mm之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡，可用吸管小心吸去。4. 凝胶条件 凝胶通常需要在室温中放置3045min。低熔点琼脂糖凝胶或低浓度凝胶应放4冰箱，加速凝固，增强硬度。5加电泳缓冲液 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm，这样凝胶两端的电压几乎与外加电压相等，电泳效率高。6拔梳子 小心移去梳子和琼脂糖凝胶隔离板，保持点样孔完整。（二）加样 将DNA样品管中加入其1/10体积的10加样缓冲液，混合均匀，短暂离心以集中样品，用移液器逐一加至每个加样孔中。如果 DNA样品体积太小，可先稀释样品，再加加样缓冲液加样。加样时Tip头不必插入孔中，可对准加样孔，在孔的上方加样，样品会沉入孔内。同时，根据待分离片段的大小选择不同的DNA分子量标准作对照，同时起标识样品顺序的作用。（三）电泳 接通电源线，开启电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则表示电泳槽已经接通电源。电泳起始需先采用高压（80100V），待电泳几min后溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中，调整电压至15V/cm（按两极间距离计算）继续电泳。电泳时间视具体样品而定，一般需要30min。注：点样孔处于电泳槽的阴极端。制备较好的电泳图谱需小电压长时间甚至过夜。（四）观察 核酸与溴化乙锭结合后，在UV灯下发橘红色荧光。如制备凝胶时加入溴化乙锭，则可随时观察DNA条带的迁移位置，如没加溴化乙锭则根据溴酚蓝指示剂在凝胶中的迁移距离判断何时终止电泳，染色。分离大片段DNA或长时间电泳时溴酚蓝可泳出凝胶。（五）照相及图像分析 照相及结果分析是一个关键步骤。现有的凝胶成像分析系统镜头前加装近摄装置和红色或橘红色滤光片以消除背景。配备专门的图像分析软件。四、注意事项（一）凝胶浓度的选择 不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子，一般情况可参照表1选择凝胶浓度。表1 凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围（kb）凝胶中的琼脂糖含量%( W/V) 线状DNA分子的有效分离范围(kb)0.3 5.0600.6 1.0200.7 0.810 0.9 0.5 7 1.2 0.4 6 1.5 0.2 3 2.0 0.1 2 染色 荧光染料溴化乙锭（EB）是核酸的染色剂，它与DNA形成荧光络合物，用低浓度的溴化乙锭（0.5g/ml）对凝胶进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。而发射的荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。溴化乙锭是一种强诱变剂，有毒性，使用含有该染料的溶液时必须带手套，注意防护。实验室使用溴化乙锭染色方法一般有2种方法： 在凝胶中加入EB至终浓度0.5g/ml，这是实验室常用的方法 ；电泳结束后，取出凝胶放入含有0.5g/ml EB的电泳缓冲液（或双蒸水）中染色1030min。 无污染染料SYBR Green 、，使用稀释比例1：10，000。经SYBR Green染色的凝胶几乎不呈现背景荧光，300nm紫外照射透视下，与双链DNA结合的SYBR Green呈现绿色荧光，单链DNA颜色为橘黄。 上样缓冲液 上样缓冲液的目的有3个：增加样品密度，以确保DNA样品均匀进入点样孔内（含蔗糖、聚蔗糖400和甘油等）；使样品呈现颜色（溴酚蓝呈蓝紫色，二甲苯青呈绿色），使加样操作便利；DNA电泳时前沿指示剂，因溴酚蓝在不同浓度的凝胶中迁移速度基本相同，二甲苯青在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢，以0.5TBE作电泳缓冲液时，溴酚蓝的迁移速率约与300bp 双链DNA分子相同，而二甲苯青约与4Kb双链DNA分子相同，迁移速率与胶的浓度关系不大。可以参照指示剂的迁移情况决定是否停止电泳。 DNA 样品的点样量 正确估计DNA样品的点样量决定于两方面因素：一是DNA样品条带的浓度，点样量太多易产生拖尾现象或DNA条带轮廓不清晰，点样量太少UV灯下难以辨认，影响结果判定。一般来说，电泳结果在紫外灯下可用肉眼分辨低至0.1g的DNA条带，如在紫外灯下拍照，只需510ng DNA就可从照片上比较鉴别；二是DNA样品的容积，每孔最大加样容积由加样孔大小决定，若样品容积大于凝胶孔容积会导致样品溢出，流入临近样品孔造成样品交差污染，影响结果分析。解决的方法是将凝胶制厚一点，或用乙醇沉淀浓缩DNA。 电泳条件1.电泳缓冲液 常用的电泳缓冲液为Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系，以保证较稳定的pH值。TAE的缓冲能力较弱，长时间电泳后阳极变为碱性，阴极变为酸性，因此长时间使用需循环或更换缓冲液。TBE和TPE缓冲能力较强，可重复使用数次，但用TPE配制的凝胶，尤其是低熔点凝胶，回收的DNA片段中含有较高的磷酸盐，易与DNA一起沉淀而影响下面的一些酶反应。故我们推荐以TBE缓冲液作为首选电泳缓冲液。这些缓冲液中均加入EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制DNA酶以保护DNA。电泳缓冲液常采用偏碱或中性pH值，使DNA分子带负电荷，向正极泳动。2电压 低电压时，线状DNA分子的迁移速度与电压成正比，但随着电场强度的增加，大分子量的DNA片段的迁移率就不再与电压成正比。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，一般凝胶电泳的电场强度不超过5v/cm，对于大分子量真核基因组DNA分子的电泳常采用0.51.0v/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。 3电场方向 如果电场方向保持不变，则长于50100kb的DNA分子在琼脂糖凝胶上的迁移速率相同。但是，如果电场方向呈周期性改变，则DNA分子被迫改变路径。由于DNA分子越大为适应新的电场方向而重新排列所需时间就越长，因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分子（达到10 000Kb）。4电泳温度 温度对电泳的影响不太严格，在琼脂糖凝胶电泳中不同大小的DNA片段的相对迁移率在4与30之间不发生改变。琼脂糖凝胶电泳一般在室温进行，但是琼脂糖凝胶浓度低于0.5%或低熔点琼脂糖凝胶较为脆弱，电泳宜在4下进行，此时它们强度较大。实验三 PCR产物的回收【实验目的】 PCR扩增产物中含未结合的Taq酶、寡核苷酸引物、dNTPs、引物二聚体等，常常影响随后的连接反应，因此，有必要对PCR扩增产物进行纯化。 【实验材料】 一、试剂 TIANGEN Midi Purification Kit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN公司，目录号：DP209） 试剂盒成分 本实验使用量本实验分装量 溶胶液PN 参照每位实验者所切凝胶块的大小， 每10mg凝胶使用10ul Binding Solution1000ul 平衡液BL 500ul600 ul漂洗液PW(用前加无水乙醇) 700ul+500ul750ul2 去离子水 20ul300ul 吸附柱CA2 1个1个 收集管（2 ml） 1个1个 1.5ml离心管 3个4个 二、其它试剂、耗材及仪器无水乙醇0.8% 琼脂糖凝胶及凝胶电泳设备、0.5TBE buffer50水浴13，000rpm台式离心机 【用 途】 从TBE或TAE 琼脂糖凝胶中回收DNA片段。 从PCR反应溶液中回收DNA，去除反应体系中的蛋白质。 从高熔点的琼脂糖和低熔点琼脂糖中回收DNA。 【实验步骤】 （从琼脂糖凝胶中回收DNA）（一） 准备含有DNA片段的凝胶 1.行0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳时将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开。紫外灯下，用干净的手术刀切下含所要回收DNA的琼脂块，放入1.5 ml离心管中，称重胶块。注意：判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长UV，在UV下照射的时间应尽可能短；此回收凝胶块如不马上进行实验，可放4或-20保存一周。2.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500 l平衡液BL，12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。3.按每10mg 琼脂糖凝胶加入30 l溶胶液PN，50水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几min，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。（二）结合DNA4.将吸附柱插入2 ml收集管中。5.将融化的胶溶液转移到柱中，室温放置2min。6.室温，12,000 rpm离心3060sec7.取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中。注意：吸附柱容积为800 l，若样品体积大于800 l可分批加入。（三）漂洗8. 向吸附柱CA2中加入700 l漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），室温离心12,000 rpm1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心。9向吸附柱CA2中加入500 l漂洗液PW，室温离心12,000 rpm1min，倒掉废液。10将吸附柱CA2放回收集管中，室温离心12,000 rpm2min。，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置30sec，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。（四）洗脱DNA11将回收柱放入一新的1.5ml离心管中。12将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20l去离子水，（如果回收的目的片段10 kb，则洗脱缓冲液EB应置于6570水浴预热），室温放置2min。室温离心12,000 rpm2min ，收集DNA溶液。实验中如果回收样品多，担心混淆，可在回收柱上作好标记。13. 为了提高DNA的回收量，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤12。注意：DNA也可以用缓冲液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脱。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。14弃去柱子，离心管中的液体即为回收的DNA片段，作好标记，可立即使用，或于-20保存备用。15. 本实验取3ul上述回收产物行0.8%琼脂糖凝胶电泳，参照Marker定量，接实验四进行DNA连接反应。实验四 DNA连接反应-利用 pGM-T载体进行PCR产物克隆 【实验目的】 掌握PCR产物克隆方法。 【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组（又称DNA克隆）。DNA重组技术是分子克隆的基本技术，其关键步骤为在DNA连接酶的作用下将载体分子与外源DNA分子进行连接。【实验内容简介】 本实验将实验四中回收的PCR 片段克隆入载体pGM-T。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3端添加一个A，可与pGM-T 3端的T互补连接。如果是使用pfu等高保真聚合酶扩增的不带A末端的片段，应使用平末端连接试剂盒先加A末端后再连接。pGM-T载体介绍 pGM-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，由EcoR V线性化，在两侧的3端添加T而成。载体中有多克隆位点和-半乳糖苷酶阅读框，可根据互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入（白色克隆为阳性重组克隆，蓝色的为载体自环连接的克隆），克隆后，可使用通用引物T7、SP6进行测序。图5.1 pGM-T 载体环形图谱及相关的序列位点 【实验材料】 pGM-T克隆试剂盒（TIANGEN公司，目录号：VT302-01）试剂盒成份使用量本实验分装量（ul）pGM-T载体(50ng/ul)50ng2.0T4 DNA Ligase (3U/ul)3U1ul2Rapid Ligation Buffe17 ul灭菌去离子水300ul 试剂盒中可选择使用的试剂：10Rapid Ligation Buffe（本次实验不选用） 【实验步骤】 1连接反应体系 本实验T4 DNA Ligase 1 ul 已分装至离心管，连接反应实验时，此管即作为各组反应管，所需其它试剂由学员依次加入此管。（1）将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一份），短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。（2）按照下表的内容往装有T4 DNA Ligase的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1：3或3：1，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片段反而会干扰连接反应。实验反应管（ul）pGEM-T Easy Vector 12Rapid Ligation Buffer5T4DNA ligase1PCR产物*灭菌去离子水* 总体积用去离子水补至10ul2 反应条件 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心，4连接过夜。反应结束后，可暂时放-20保存。 【注意事项】1载体和插入片段的摩尔浓度比 一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但是当底物浓度过高，反应体积太小(即浓度太大)时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻挠；当DNA连接浓度太低与连接体积太大也易于造成DNA的自连。我们在实验中采用目的基因与载体的比通常为3：1或1：3，变化范围可为8：11：16。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应最好作几个实验梯度，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中（10l），通常一个连接反应用1050ng的载体DNA。载体和插入片段比推荐使用公式如下：ng of vectorkb size of insertInsert ：vector molar rationg of insertkb size of vector2连接反应均为微量操作，要注意取样的准确性，不要漏加溶液，反应中所用的Eppendorf管与Tip应一次性使用并于实验前高压灭菌。3取酶时，应把酶放在冰盒，用完立即放回-20冰箱保存。吸酶时Tip要从溶液的表面吸取。4连接酶反应缓冲液（10 Rapid Ligation Buffer或2 Rapid Ligation Buffer）含支持连接反应的辅助因子，如ATP，商品化的缓冲液购买后，最好先分装，20保存，以减少反复冻融的次数。实验五 转化反应 【实验原理】 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以包容外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent Cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有外源DNA分子的受体细胞)。实验室常用的感受态细胞有两大类，即化学感受态及电转感受态。电转感受态需配备相应的仪器。本实验室通常使用化学感受态细胞。目前常用的制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法。本实验使用的感受态细胞为TOP10，转化效率108cfu/ug。可满足一般的分子克隆实验。 【实验材料】 仪器及耗材 超净台、平皿、 玻璃涂棒、试管、Eppendof管、Tip尖 试剂1LB（Luria-Bertani）液体培养基配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-trptone） 10g细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/L NaOH（约0.2ml）调节PH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在15磅(1.034105Pa)高压下蒸气灭菌20min。2氨苄青霉素（Ampicillin） 贮存浓度100 mg/ml,20保存，使用浓度100ug/ml。3LB平板（含Ampicillin,Amp+） 先按上述配方配制液体培养基，临高压灭菌前加入细菌培养用琼脂（bacto-agar），15g/L，在15磅(1.034105Pa)高压下蒸气灭菌20min。从高压灭菌器中取出培养基时应轻轻旋动以使熔解的琼脂能均匀分布于整个培养基溶液中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50，方可加入不耐热的抗生素（如Ampicillin），为避免产生气泡，混匀培养基时应采取旋动的方式，然后可直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需3050ml培养基。将平皿盖斜盖在盛琼脂的底板上，使琼脂变硬冷却至室温，盖好，放入4可保存一个月。40.1M IPTG贮存液：称1.2g IPTG，加去离子水至50ml，滤过除菌，分装成1ml小份贮存于-20。5X-Gal贮存液：100mg X-Gal用2ml二甲基甲酰胺溶解，用铝泊纸包裹避光、20保存24月。X-Gal贮存液无须过滤除菌。6LB平板（含Ampicillin/IPTG/X-Gal） 参照3配制LB平板（含ampicillin），取100ul 100mM IPTG和20ul 50mg/ml X-Gal，混匀，加到平皿表面，涂布均匀，放37正向放置吸收30min，用于重组子筛选鉴定。7SOC培养基(TIANGEN公司pGM-T克隆试剂盒中自带) 在转化实验中可用LB液体培养基替代8TOP10感受态细胞（TIANGEN 公司） （1）用于化学转化； （2）可与-半乳糖苷酶氨基端实现互补，可用于蓝白斑筛选。 【实验步骤】1. 取-70下保存的40ml Top10感受态细胞两管，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。分别标记 ，为实验四中各实验组连接反应产物，为由本实验室提供的阳性对照。2. 两管分别加入上述连接反应产物及阳性对照3ml(连接产物的加入量不应超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹管底使之混匀。注意：不要用力吹打。3. 冰上放置30min。4. 42水浴中放置90sec。（此步骤要求42温度准确，水浴过程中不要摇动。）5. 快速将管转入冰浴放置23min。6. 加500ml SOC或LB液体培养基(不含抗生素)，37 150200rpm振荡培养1小时，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。7. 取500ml上述菌液加入90mm LB平板中(含抗生素、IPTG、X-gal)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。8. 待平板表面干燥后，倒置平板，37培养过夜(12-16小时)。注意：培养时间不要超过16小时，否则会产生卫星菌落（杂菌）9. 结果分析：取出培养板，观察菌落生长情况。白色菌落为所要菌落，蓝色菌落为自环或不含重组子的菌落。随机挑选白色菌落进行重组子鉴定（接实验六）；如暂时不做，可用石蜡膜封口，4保存，一月之内使用。 【注意事项】 1感受态细胞置于-70保存，不可反复冻融。 2. 转化过程中阴性对照、阳性对照是非常必要的，在实验出现问题时可以更快地找到原因。 3. 建议留下部分连接产物，在出现问题后能迅速的补救，减少不必要的重复实验。 4. 涂布用量可根据具体实验作相应调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300 l转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4,000rpm，2min）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。 5细菌培养超过16小时长出的菌落视为杂菌。 6蓝/白斑筛选的平皿4放置几小时后，可使蓝色显色更清楚。实验六 质粒DNA的小量提取 【实验目的】 细菌质粒是细菌染色体外能自主复制的双链DNA分子。通常提取细菌质粒用做克隆载体、是携带外源基因进入细菌大量扩增和表达的媒介物。提取质粒DNA的目的是将细菌质粒DNA与菌体染色体DNA分开，去除菌体残片及蛋白，以获取质粒DNA。现有提取方法很多，各有利弊，可根据菌株类型，质粒大小及应用提取的质粒DNA进行何种实验等具体情况选择实施。本实验将介绍目前被广泛采用的碱变性法。 【实验原理】 掌握碱裂解法提取质粒DNA。在pH1212.5这个范围内，基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。本实验所用试剂盒沿用传统的SDS碱裂解法，结合硅基质膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。 【应 用】 本实验提取质粒DNA可用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。 【实验材料】 一、试剂盒组成 以TIAGEN公司TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒（目录号：DP103）为例。成分分装量使用量RNaseA(10 mg/ml)已加入到溶液P1平衡液BL600 ul500 ul溶液P1300 ul250 ul溶液P2300 ul250 ul溶液P3400 ul350 ul漂洗液PW（用前参照说明书加无水乙醇）750ul2 750ul +500ul吸附柱CB31个1个收集管（2 ml）1个1个去离子水300ul20ul1.5ml 离心管3个3个0.5ml 离心管1个1个试剂盒中带有的其他试剂（本次实验不用）：去蛋白液PD，洗脱缓冲液EB二、其它试剂、仪器及耗材1LB培养基（Ampicillin,Amp+） 使用之前，加入氨苄青霉素。2氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）：用去离子水配制成100mg/ml, 20保存。使用浓度100ug/ml。3仪器及试验耗材 恒温摇床；台式离心机 （离心力14，000g）；紫外分光光度计；电泳设备；紫外检测仪 ；1.5/0.5ml Eppendorf管；Tip尖；试管架；移液器。 【实验步骤】 一、细胞培养：随机调取实验五中单个、白色菌落，接种到5ml LB培养基（Amp+）中，于37恒温摇床，200rpm（转/分）培养过夜。 二、小量质粒DNA快速提取（一）裂解细胞1柱平衡步骤：向吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500 ul的平衡液BL，室温离心12,000 rpm1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）2收集过夜培养的15ml的细菌，室温离心12，000rpm1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3沉淀中加入250ul 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），用枪头或振荡器充分悬浮细胞。（注意：此步骤充分悬浮细胞很重要。）4加入250ul 溶液P2，立即上下颠倒45次，使细菌裂解充分至溶液变澄清，室温放置15min。注意：此步骤不要剧烈混摇。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5加入350ul 溶液P3，立即上下颠倒45次，此时不要剧烈震动，使之充分中和,此时将出现白色絮状沉淀。6室温离心，12,000rpm10min。（二）提取和纯化 取出2ml收集管和吸附柱CB3，将吸附柱CB3插入收集管中，在吸附柱壁作好标记。7将步骤6中上清全部转到吸附柱里。注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。8室温离心12,000rpm1min。取下吸附柱，弃去收集管中的废液。9可选步骤：向吸附柱CB3中加入500 l去蛋白液PD，12,000 rpm (13,400g )离心3060sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM101， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5，TOP10等），这步可省略。10将柱子放入同一个收集管中，加入750 l漂洗液PW。11. 室温离心12,000rpm1min。取下吸附柱，弃去收集管中的废液，将柱子重新插回收集管。12. 重复洗一遍，加入500 l 漂洗液PW。室温离心12,000rpm1min。13室温高速离心12,000rpm2min。尽量去除残余液体。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CB3开盖，置于室温放置30sec，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（三）洗脱质粒DNA14将吸附柱插入一新的1.5ml离心管中，在离心管壁作好标记。在柱子膜中央加25 l 水，不用盖上离心管盖，室温放置2min，室温离心12,000rpm1min。注意: 将去离子水预热到50加入洗脱DNA时有利于提高DNA 的洗脱效率。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤14。 15离心管中洗脱的液体即含有质粒DNA，可立即使用或保存于-20或以下温度备用。 16本实验课提取的质粒DNA用于重组子酶切鉴定。接后续实验：接实验七，酶切质粒DNA进行重组子鉴定； 琼脂糖凝胶电泳分析质粒DNA提取质量； 紫外分光光度计测定质粒DNA浓度和纯度。三、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析 配制0.8%琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml溴化乙锭)，取2ul质粒 DNA进行电泳，检测提取的质粒DNA的质量。方法：取0.5ml离心管，加2ul质粒DNA2ul 10上样缓冲液，加入点样孔电泳。100V电压使点样孔的样品进胶，60mV电压30min电泳，紫外灯下观察结果。 四、紫外分光光度计测定质粒DNA含量 取5ul上述质粒DNA加600ul去离子水稀释，在紫外分光光度计下测定A260nm 和A280nm处的吸光值。DNA浓度（ug/ul）=A26050稀释倍数 100012质粒DNA纯度 A260nm /A280nm 大约为 1.8左右。若低于1.8，表明有蛋白质污染，可用酚或酚：氯仿：异戊醇抽提；高于2.0疑有RNA污染。3示例：如OD260=0.10，稀释倍数为500，则：0.10 50 500 =2500g/ml 即DNA浓度2.5g /ul 式中“50”系DNA的消光系数，即1OD A260的DNA相当于大约50g/ml。实验七 限制性内切酶酶切反应 【实验原理】 遗传工程中经常使用的是II型限制性内切酶，它能识别双链DNA分子中某一段特定核苷酸，并在该序列之中切割。有的限制酶在双链DNA 两条链正好相对的位置上切割产生平齐末端，另外一些限制酶在两条链上交错切割，成为“粘末端”。酶切反应需要一个理想的反应系统，要有Mg2+做辅助因子，并要有一定的盐离子浓度，经特定反应条件后，产生大小不同的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。 【实验目的】 初步掌握限制性内切酶小量酶切技术。 【实验材料】（一）仪器及耗材 水浴锅或37温箱；稳压稳流电泳仪；水平式凝胶电泳槽；紫外检测仪；移液器；台式离心机；0.5ml Eppendorf管；试管架；Tip尖（110l、20200l）；冰盒（二）试剂1质粒DNA （本实验六中纯化的质粒DNA ） 2限制性内切酶 EcoR I （12U/ul） -20贮存。3限制性内切酶10H buffer4电泳级琼脂糖 5灭菌去离子水6溴化乙锭（EB，10 mg/ml） 【实验步骤】 本次实验主要介绍小量酶切反应。其主要用于质粒DNA的酶切反应鉴定。典型的反应为20l反应体积中含有0.21.0g DNA。1 配制酶切反应体系：向1支灭菌的新Eppendorf管中依次加入下列试剂，先加灭菌的去离子水：质粒DNA*l10H buffer2lEcoR I 1l去离子水 补去离子水至总体积20l总体积20l 2 经离心机简短离心混合均匀，集中样品。3 酶切反应条件：37水浴1h。4 终止反应：65水浴1015min终止酶切反应，样品置4冰箱备用。5 结果鉴定：用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切反应。 【注意事项】1限制性内切酶：注意保持酶的活性，将酶从低温冰箱中取出后应立即置事先准备好的冰盒中，用后及时放回低温冰箱；限制酶保存于50%甘油，粘稠，加样时Tip尖不要过多的插入液体，加后应充分混匀。 2底物DNA：DNA纯度要高，不含RNA、蛋白质等,也不能含有过高EDTA（10mmol/L）、SDS等去污剂及过量的盐离子浓度，更不能含有酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。3反应缓冲液：购买商品限制酶