（植物病理学专业论文）稻瘟菌定殖与扩展过程中特异表达基因分析.pdf

福建农林大学硕士学位论文 摘要 稻瘟病菌与水稻互作系统，是理想的病原菌与植物互作的模式系统，也是病害生态 控制的理想模式。为了探索稻瘟病菌与水稻互作的分子机理，本文采用基因芯片的方法 筛选了稻瘟病菌在定殖与扩展过程中与水稻互作的特异表达基因，并对这些基因进行初 步的分析和部分基因r t - p c r 验证。 基因芯片结果显示，若以两倍的变化作为标准，在稻瘟病菌定殖和扩展过程中，稻 瘟病菌共有3 3 0 9 个基因发生上调，3 4 5 3 个基因发生下调；水稻有9 7 4 个基因上调，1 1 3 4 个基因下调。参照n c b i 数据库、稻瘟病菌数据库和水稻基因组数据库结合p r o t c o m p8 0 软件，对基因芯片结果中稻瘟病菌中上调最大的1 2 2 个基因，下调最大的6 7 个基因； 水稻上调最大的6 2 个基因，下调最大的7 个基因，进行基因表达产物的分析和亚细胞 定位。并对基因芯片中稻瘟病菌上调最大的2 0 个基因进行r t - p c r 的验证，结果发现 其中有1 8 个基因与基因芯片结果一致，有2 个基因未能扩增得到产物。 主题词：稻瘟病菌水稻基因芯片互作差异表达 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h es y s t e mo fr i c e m a g n a p o r t h eg r i s e a , i sa ni d e a lm o d e ls y s t e mo ft h ep l a n t s i n t e r a c t i o nw i t ht h e i rp a t h o g e n sa n dt h ee c o l o g i c a lc o n t r o lo fp l a n td i s e a s e i no r d e rt o u n d e r s t a n dt h ei n t e r a c t i o nm o l e c u l a rm e c h a n i s mb e t w e e nm a g n a p o r t h eg r i s e aa n dr i c e ，t h e s p e c i f i ce x p r e s s i o ng e n e sd u r i n gt h ep a t h o g e ni n f e c t i o nw e r es c r e e n e do u tb yt h et e c h n o l o g y o fg e n ec h i pa n ds o m eo ft h e mw e r ev e r i f i e db yr t - p c r 。 t h er e s u l to fg e n ec h i pe x p e r i m e n ts h o w e dt h a t ，f o rm o r et h a n2 - f o l dc h a n g e ，t h e r ew e r e 3 3 0 9u p - r e g u l a t e dg e n e sa n d3 4 5 3d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mm a g n a p o r t h e g r i s e a ；a n d9 7 4 u p r e g u l a t e dg e n e sa n d113 4d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mr i c e t h en c b i ，m a g n a p o r t h e g r i s e ag e n o m ea n dr i c eg e n o m ea n n o t a t i o np r o j e c td a t a b a s e s ，a n dp r o t c o m p8 0s o f t w a r e w e r eu s e dt oa n n o t a t et h ep r o t e i n sa n dt h e i rs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n so ft h em o s to b v i o u s l y c h a n g e dg e n e s ，i nw h i c h 12 2u p r e g u l a t e da n d6 6d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mm g r i s e a ，a n d 6 2u p r e g u l a t e da n d6 6d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mr i c e f i n a l l y , t h et o p2 0u p - r e g u l a t e d g e n e sw e r es e l e c t e df r o mm a g n a p o r t h eg r i s e aa n dv e r i f i e db yr t - p c ra n a l y s i s k e yw o r d s ：m a g n a p o r t h e g r i s e a r i c e g e n ec h i pi n t e r a c t i o n d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n i i 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔繇钥剪螗日期：妒尹似 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。日 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：劫遗考烀 日期： 矿尸 心 指导教师亲笔签名： 日期： 一 福建农林大学硕士学位论文 l 刖百 寄主植物与病原微生物的相互作用在自然界中是广泛存在的，也是长期以来两者之 间相互选择的结果。体现在农业生产上，一个抗病品种的大面积使用后，致病菌中很快 就会出现新的致病生理小种，并大量繁殖，最后使原抗病品种的抗病性丧失。因此，找 到农作物与病原菌之间互作的机理，具有深远的理论意义和重大的实际意义。 目前对寄主植物与病原微生物互作的解释有“基因对基因”假说和后人对该假说的 补充，即：植物抗病性是由植物的抗病基因r 与相应的病原物的无毒基因a v r 的相互 作用所决定的，r 基因和a v r 基因称为主效基因；同时还有一些基因的表达产物由于 涉及信号传导、植物防卫基因的激活及与微生物毒性基因互作等，可能会影响植物与微 生物互作的表现，但效应远不及r 基因和a v r 基因，被称为微效多基因。因此，如果 找出这些基因，并明确它们的作用机理，对揭示寄主植物与病原微生物互作原理和解决 病原菌致病的关键问题将有很大帮助。 而新兴的基因芯片技术，使人们能够同时高通量地检测基因表达及基因间的相互作 用，因而得到广泛的应用。该方法也是全面获取植物与病原微生物互作后差异表达基因 的有利工具。 水稻是我国主要粮食作物之一，种植面积最广。稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a b a r n ) 侵染水稻引起的稻瘟病是影响水稻生产的三大主要病害之一。由于水稻是禾本科 的模式植物，稻瘟病菌是致病丝状真菌的模式生物，并且水稻和稻瘟病菌的基因组测序 工作也先后完成【1 3 】。因而，研究水稻与稻瘟菌互作系统是研究植物与致病微生物相互 作用的最佳模式系统之一。本研究采用基因芯片技术，找出稻瘟病菌与水稻互作中差异 表达基因，从而为揭示稻瘟病菌与水稻的互作机理打下研究基础。 1 1 稻瘟病菌生物学特性及致病相关基因的研究现状 稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e ab a r r ) 弓l 致的水稻稻瘟病是世界性的水稻重要病害，并 且易暴发成灾，一般可导致水稻减产1 0 2 0 【1 1 ，重则造成水稻绝收，直接关系到世界 粮食的安全生产问题。因此，多年来无数科学家针对该病的发生流行规律、综合防治策 略和措施等方面开展了大量研究。稻瘟病菌作为丝状子囊菌，易于开展遗传分析，在生 长发育、侵染致病机制等方面有许多特点，同时稻瘟病菌还可侵染大麦、小麦、粟等禾 本科植物，以及可以从叶、茎、根侵染水稻，引发同样的症状【4 5 】，因此，它成为研究丝 状真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物【6 7 】。 二十世纪八十年代后，随着分子生物学的发展，科学工作者们明确了水稻与稻瘟病 福建农林大学硕士学位论文 菌的互作符合基因对基因假说，并从分子水平证明了这一互作机制【1 3 】。并且研究者们 普遍认为稻瘟病也已成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式系统之一【6 8 9 】。 z h u 等人通过不同水稻品种混栽增加遗传多样性以控制稻瘟病的研究，使得该病害系统 成为研究病害生态控制的理想模式【1 0 】。而在该研究系统中，与稻瘟病菌侵染相关的分子 遗传学和细胞生物学研究已取得较大的进展【6 】。特别是该菌基因组全序列的测定，极大 地推进了该菌的研究。至今，已报道了数十个与稻瘟病菌致病相关的基因，另外还有一 部分与生长、产孢等形态分化过程有关的基因也已得到克隆和研究。这些研究为最终揭 示稻瘟病菌致病及与寄主互作的机理奠定了坚实的基础，同时也为该病的防治提供了理 论依据。 1 1 1 稻瘟病菌的生物学特性 稻瘟病菌的有性世代为m a g n a p o r t h eg r & e a ( h e b e r t ) b a r r ，属于子囊菌亚门。无性世 代为p y r i c u l a r i ag r i s e a ( c o o k e ) s a c e ，称为灰梨孢( = p y r i c u l a r i ao r y z a ec a v ，称稻梨孢) ， 属于半知菌亚门。稻瘟病菌侵染致病包括接触、侵入、扩展等过程。稻瘟病菌分生孢子 着落在寄主植物表面，依靠顶端的胶状物紧紧地粘着在疏水植物组织表面，在有水珠的 条件下便很快萌发形成芽管，4 h 内分化出附着胞 1 1 - 1 3 】。成熟附着胞壁内层可以沉积大量 的黑色素，而在附着胞和植物表面间黑色素不沉淀或很少沉积。在附着胞朝向植物表面 的一端基部有附着胞小孔，由于黑色素的沉积使细胞壁上的孔径小于l n m ，仅允许小分子 物质通过，而甘油等有机分子不能通过，从而维持一定的渗透压，即膨压。h o w a r d 等 通过试验计算出稻瘟病菌的一个附着胞可以产生的压强为6 - 8 m p a ，是汽车轮胎压强的 3 0 4 0 倍【1 5 16 1 。有巨大膨压的附着胞致使侵入栓有足够的力量穿过寄主的角质层，侵入 寄主组织内部。已有试验表明，不产生黑色素、没有甘油积累的附着胞突变体往往失去 侵染致病能力或需要通过人为造伤以后才能致病【1 3 1 4 】。 稻瘟病菌的侵入栓刺穿细胞壁进入寄主表皮细胞，在侵入的最初细胞内形成侵染菌 丝。在水稻叶片内，侵染菌丝在细胞内和细胞间迅速延伸，在接种的7 2 h 后，病原菌的 生物量已经达到感染叶片的1 0 t 1 7 1 。稻瘟病菌侵入5 7 天后，水稻叶片上形成可见的灰 色病斑。病菌菌丝在病斑处产生分生孢子梗，从气孔或直接穿透寄主表皮暴露到空气中， 在分生孢子梗顶端形成无性分生孢子。有试验证明，稻瘟病菌每夜可向田间释放 2 0 0 0 6 0 0 0 个孢子，并能持续2 周左右 18 1 。成熟的分生孢子，借风传播，可达2 0 k i n ，在 高达2 3 0 0 m 的高空也可收集到稻瘟病菌的分生孢子，分生孢子随风雨接触到新的水稻植 株，开始新轮的循环【1 9 】。 2 福建农林大学硕士学位论文 1 1 2 稻瘟病菌致病相关基因的研究现状 在整个稻瘟病菌侵染水稻的过程中，病菌和寄主两方面都有大量的基因参与【2 0 1 ，仅 病菌方面就包括如下三类：一类是与侵染有关的形态分化过程信号识别基因：第二类是 与毒性相关的无毒基因、毒性决定因子等；第三类是与病菌在侵入水稻组织后定殖和扩 展有关的基因【2 1 1 。已有的大量研究主要集中在附着胞的分化以及侵染早期相关的基因， 弧m p g l 、p t h l i 、c p k a 、生c l 、m a g b 、p m k l 、a l b l 、r s y l 、b u f l 、p t h 2 、t p s l 、 p l s l 、m s t l 2 、m s t l l 、m s t 7 、m p s l 、c b p l 、g a s i 、g a s 2 、p d e l 、c y p l 、m h p l 等【6 2 2 2 3 1 。它们有的参与附着胞分化的信号传导，如识别表面疏水信号的m p g l 、p 刀订j 基因，进行信号传递的c p k a 、m a c ，、m a g b 、p 纭j 、m s t l l 、m s t 7 等基因，这些 基因识别的信号经g 蛋白，激活细胞内的c a m p 和m a p k 蛋白激酶等信号途径，决定 了该菌附着胞的形成【2 3 2 5 2 6 1 。它们有的参与形成附着胞的正常功能，如黑色素合成基 因a l b l 、b u f l 和r s y l ，肉毒碱乙酰转移酶基因p t h 2 和海藻糖合成酶基因t p s l 等与 附着胞中膨压的形成有关；p l s l 、嬲”2 、m p s i 、g s j 、g 舵、p d e l 、c y p l 等基因 与侵入栓的形成和功能有关【6 2 7 之9 1 。m h p l 为最新报道的与病菌疏水性表面形成有关的 基因，该基因的突变会影响病菌侵染相关形态的发育，并使病菌的侵染和定殖能力下降 【2 2 1 。此外，l i 等考察了稻瘟病菌中与酵母p a k 激酶基因s t e 2 0 类似的c h m l 和m s t 2 0 基因，发现c h m l 基因与病菌附着孢的形成和穿透寄主有关，但与酵母中不同的是， c h m l 并没有调控稻瘟病菌的p m k l 激酶【3 0 1 。 尽管己鉴定到几十个稻瘟菌无毒基因 7 , 3 1 1 ，但是，也许是受到克隆基因难度的限制， 迄今只有五个无毒基因p w l 2 、a v r l c 0 3 9 、a v r p i t a 、a c e l 和a v r - p i z t 已经克隆 3 2 - 3 5 , 1 0 5 。其中无毒基因a v r - p i t a 的结构及其与水稻抗病基因p i t a 的互作功能得到了深 入的研究【3 _ 4 ，3 6 1 。a v r p i t a 编码一个金属蛋白酶，尽管尚无直接的生化依据，但只要改 变该金属蛋白酶结构域中的一个氨基酸，它就不能与抗病基因p i t a 互作【3 】。功能分析表 明，a v r p i t a l 7 6 直接与水稻细胞内的p i t a 蛋白的富亮氨酸区域( l r d ) 结合，激发尸妇 调控的防卫反应，从而导致水稻的抗病反应。 关于稻瘟病菌穿透组织后定殖发展阶段的基因调控则研究的很少。b a l h a d e r e 和 t a l b o t 发现，稻瘟病菌p 型a t p 酶的基因p d e l 与侵入菌丝的发育和最终在细胞内的定 殖有关2 9 1 ；m h p l 基因的突变也使病菌的侵染和定殖能力下降【捌；而a t p 驱动的输出 泵蛋白基因a b c l 与病菌的亲和性互作密切相关1 2 1 。另外，甲硫氨酸和组氨酸的合成， 以及金属硫因叫e t a l l o t m o n e i n ) 等也与稻瘟病菌的侵染过程有关【3 7 r3 8 1 。不过，这方面的 堡垄垄签奎兰堡主堂垡笙苎 研究离认识稻瘟病菌在植物组织内定殖扩展的调控机理还差很远。 因此，尽管对稻瘟病菌的生长、侵入、发病等各个阶段已展开了较为系统的研究， 并取得了一些重大的研究进展，但对稻瘟病菌致病过程的分子机理仍然未完全弄清楚， 特别是稻瘟病菌侵入后在寄主体内如何与寄主发生互作，并导致病菌的定殖与扩展，最 终形成感病反应的研究非常稀少。近年来，虽然有多个实验室运用m r n a 差异显示、 c d n a 抑制消减杂交( s s h ) 、s a g e 、基因芯片和表达序列标签( e s t ) 分析的方法来研究 水稻与稻瘟菌互作的相关基因，得到了大量的信息【3 9 4 8 1 。但这些研究获得的信息中，有 些由于采用人工培养或人造疏水性表面代替植物接种，得到的信息与来源于真正的与寄 主互作还存在差异，特别是无法找到病菌中特异参与定殖与扩展的基因。 1 2 植物抗病的机理及水稻抗稻瘟病基因的研究 1 2 1 植物抗病的机理 植物在生长过程中，经常会遭到一些病原微生物( 包括真菌、细菌和病毒等) 的危害。 病原物侵染寄主植物的能力是病原物与寄主植物协同进化的结果，有很多植物在进化过 程中还出现抵抗病原菌侵染的能力，即为寄主植物的抗病性。目前对植物的抗病机理流 行着两种学说： 一种是f l o r l 9 7 1 年提出的“基因对基因”假说( g e n e f o r - g e n eh y p o t h e s i s ) 。主要用来解 释植物抗病基因和病原菌之间的特异性相互作用。其广为接受的观点是受体激发子模 型，即病原物入侵寄主后，病原菌无毒基因( a v o 的产物被寄主相对应的抗性基因( r ) 产 物识别后，激活了侵染点细胞的过敏性反应( h y p e r s e n s i t v er e s p o n s e ，h r ) ，导致这些细胞 快速地程序性死亡，使侵染的病原物生长繁殖受到抑制，被控制在这些细胞中【4 9 1 。这一 假说一直以来得到广泛的肯定和补充。但是多数已经克隆的抗病基因产物和其对应的无 毒基因产物尚未证实能直接发生作用。 另一种假说是v a nd e rb i e z e n 等1 9 9 8 年提出的防卫假说( g u a r dh y p o t h e s i s ) ，该假说 认为病原为了使周围环境更有利于自身侵染、繁殖，释放了一类效应子( e f f e c t o r s ) ，效应 子能够作用并修饰寄主的某些目标( t a r g e t ) 蛋白，抗病蛋白则作为防卫( g u a r d e r ) 蛋白，通 过与这些目标蛋白的互作启动寄主的抗病反应【5 0 , 5 1 】。防卫假说的提出彻底改变了我们过 去对抗病基因功能的认识，抗病蛋白不再是被动地等待无毒蛋白的结合，而是主动的， 时时刻刻地从各个方面监控由病原物引发的自身生理变化过程，迅速启动防卫反应。 1 2 2 水稻抗稻瘟病菌基因的研究现状： k i y o s a w a 等通过遗传分析，先后在粳稻中的8 个位点( p i k 、p i a 、p i i 、p i z 、p i t a 、p i b 、 4 福建农林大学硕士掌位论文 p i t 、p i s h ) 鉴定了1 3 个抗病基因俨f a 、p i - i 、p i - k 、p i k a 、p i ，k m 、p i k s 、p i 砌、p i - z 、 尸，捌、p i ，t a 、p i t a 2 、p i b 和p i - t ) ，并在此基础上确立了一套单基因鉴别品种，它由1 2 个品种组成，每个品种包含一个己知的抗稻瘟病基因，这套单基因鉴别品种大大提高了 对稻瘟病生理小种的鉴别能力【5 2 1 。 y u 等先后利用近等基因系鉴定t - - 个稻瘟病抗性基因，p i - 1 似 p i 一1 1 、p i 一2 ( 0p i - z 哥 和p i - 4 ( t ) p i 趔并分别定位于第1 1 、6 和1 2 染色体上 5 3 , 5 4 1 ；i m b e 等鉴定并将p i 2 0 基 因定位到水稻的第1 2 号染色体上【5 5 】；n a q v i 等利用r a p d 和r f l p 技术在重组自交系 中还定位了第5 号染色体上的抗稻瘟病基因p f j d 5 6 1 。朱立煌等利用r a p d 技术，在 水稻第8 染色体上首次发现稻瘟病抗性基因，即尸唧扣，j 俐，它离r a p d 标记b p l 2 7 a 的遗传距离为1 4 9 c m e 5 7 1 。w a n g 等利用重组自交系c 0 3 9 m o r o b e r e k a n 定位了两个来自 粳稻的稻瘟病抗性基因p i - 5 ( t ) 和p i - 7 ( t ) ，分别在第4 染色体上，位于r f l p 标记r g 4 9 8 和r g 7 8 8 之间；和第1 1 染色体上，位于标记r g l 6 和r g l 0 3 a 间。另外，他们还发现 了1 0 个控制部分抗性的q t l ，位于第8 条染色体上，它们控制着病斑的大小、数量和 病叶的面积，这是首次对稻瘟病微效抗性基因进行定位【5 8 】。 1 9 9 5 年，中国水稻所的郑康乐等利用r f l p 技术从品种红脚占中定位了抗稻瘟病基 因p i h 一，例，位于第1 2 染色体上，距离r f l p 标记r g 8 6 9 为5 1 c m 5 9 】。日本m i y a m o t o 等发现源于籼稻品种的抗稻瘟病基因p i - b 位于第2 染色体的近末端，与r f l p 标记r z l 2 3 及r a p d 标记b 1 共分离。他们还找到了两个标记r z 2 1 3 和g 1 2 3 4 。前者位于靠近端粒 的一边距r a p d 标记b 11 9c m 处，后者位于距着丝点的一边r a p d 标记b 1 只有0 5 c m 处。因此，他们不仅找到了p i b 两侧的标记，而且找到了与目的基因完全共分离的标记， 为该基因克隆奠定了基础 矧。w a n g 等在1 9 9 9 年克隆了该基因。r y b k a 等用r f l p 和 r a p d 标记定位了来源于籼稻品种t a d u k a n 的两个抗稻瘟病基因p i - t a 和p i t a 2 ，它们被 定位在第1 2 染色体距离着丝点非常近的中部，且紧密连锁。他们还发现这两个基因与 标记x n p b 2 8 9 和x n p b l 9 6 共分离【6 1 1 。w u 等从1 4 4 0 个r a p d 引物扩增产物中筛选出 1 8 个条带，均与尸正，口连锁，并且构建了基因所在区域的精密图谱。b r y a n 等在2 0 0 0 年 克隆了p i - t a 基刚6 2 1 。p a n 等1 9 9 8 年从云南的品种m a o w a n g u 中鉴定到p i l 3 、p i l 42 个 基因盼6 4 1 。b e r r u y e r 等2 0 0 3 年从i r 6 4 中鉴定到p i 3 3 基因；2 0 0 4 年，c h e n 等从 中国的籼稻品种地谷中鉴定并作图了2 个基因p i d l 和p i d 2 觚6 7 1 。 迄今为止，通过性状标记或分子标记( 微卫星标记，s s r ，限制性片段长度多态性 r f l p 等) 技术，已经有超过6 0 个稻瘟病抗性基因被定位到染色体上。 目前已经克隆的基因有：p i b 、p i t a 、p i 2 、p i 9 、p i d 2 和尸切六个基因。 气 福建农林大学硕士学位论文 其中，由p i b 基因编码的蛋白质，是由1 2 5 1 个氨基酸残基组成的含一个核苷酸结 合位点( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e ，n b s ) 和富含亮氨酸重复( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ，e r r ) 的蛋白 质。其n 端的n b s 区有激酶l a 、2 和3 a 结构域的重复单位，l r r 的中部有8 个成簇的 胱氨酸残基68 6 9 1 。p i b 基因在水稻中以多拷贝形式存在，目前该基因的抗病机理尚不清 楚。 而尸扣幻基因编码的蛋白，是富含l r r 序列的细胞质膜受体蛋白，由9 2 8 个氨基酸 残基组成。它在水稻中以单拷贝形式存在【7 0 1 。并且根据j i a 等的研究还发现，p i t a 基因 的抗病机制遵循基因对基因的学说，即它编码的产物与稻瘟病菌中相应的无毒基因 a v r p i t a 表达产物能相互作用引发抗病反应【7 1 】。 研究证明，尸忍位于第6 染色体上，抗谱广且完全显性基因，是一个基因簇成员【7 2 。7 5 1 。 p i 2 编码一个由1 0 3 2 个氨基酸组成的n b s l r r 蛋白。根据尸刀的序列信息，在品种 t o f i d e l 中发现了它的等位基因p i z - t ，也编码n b s l r r 蛋白，但是由1 0 3 3 个氨基酸组 成。两个基因在编码的三个连续组成的l r r 结构域中有八个氨基酸不同【7 6 1 。 p i 9 也同样是位于第6 染色体上的一个广谱抗性的基因，和尸f 2 属于同一个基因家族。 编码n b s l r r 蛋白，由1 0 3 2 个氨基酸组成。p i 2 和p i 9 的克隆为从分子水平上解释稻 瘟病基因簇的形成和进化提供t i f f _ 据【7 7 1 。q u 等认为抗性是由l r r 结构域决定的【7 引。 1 3 基因芯片技术及其应用 基因芯片又称d n a 芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片。它是指在固相载体上 按照特定的排列方式固定上大量序列己知的d n a 片段，形成d n a 微矩阵。将样品基 因组d n a 或r n a 通过体外逆转录、p c r 或r t - p c r 扩增等技术掺入标记分子后，与位 于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂 交信号强度，计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量基因序列 特征或基因表达特征信息。由于其检测基因的高通量性，基因芯片在基因的表达和调控， 疾病的诊断和检测、新基因功能的确定等各个方面得到了日益广泛的应用7 9 棚】。 基因芯片检测的最基本原理同s o u t h e r nb l o t 、n o r t h e r nb l o t 一样，都是基于碱基互 补的核酸分子杂交。他们的区别是：s o u t h e r nb l o t 、n o r t h e r nb l o t 中把样本的d n a 或 r n a 固定到( 固相) 膜上，再用标记好的探针进行杂交；基因芯片则是把大量的已知序列 的基因探针有序地固定在固相介质上，再把样品中总的靶基因进行标记，与带有探针的 芯片进行常规的分子杂交，因此可以大规模高通量的进行基因序列的研究【8 2 】。 1 3 1 基因芯片的种类： 6 堡堡奎茎奎兰堡主兰垡笙茎 由于载体材料、制备方法、所用d n a 的种类及用途等方面的不同。基因芯片大致 可分为一下几类： 就基因芯片所用的载体材料的不同，可分为玻璃芯片、滤膜芯片、硅芯片、陶瓷芯 片等。目前，玻璃芯片由于其荧光背景低、材料易得和应用方便等优点，而在国际上得 到广泛应用。 按照芯片的制备方法的不同，可以分为以下两类：一类是在基质上直接原位合成寡 核苷酸的点阵；另一类是用微量点样技术将d n a 片段直接点至基质上。根据芯片载体 上所点的d n a 种类不同，可以分为寡核苷酸芯片和e d n a 芯片两种： 寡核苷酸芯片是以寡核苷酸为探针，是人工合成的，一般以原位合成方式固定到载 体上，具有密集程度高、可合成任意序列的寡聚核苷酸等特点，适用于d n a 序列测定、 s n p 分析等。但是选择这种：签片，要求研究者对基因有充分的了解，即基因的位置和长 度有一定的认识。由于合成寡聚核苷酸长度在1 5 7 0 m e r 左右，因而特异性差，而且随 长度的增加，合成的错误率也会增高。同时寡核苷酸芯片也可通过直接点样制备，但固 定率较d n a 芯片差。寡核苷酸芯片主要用于点突变和测序等，也可用于表达谱研究【8 3 8 4 】 a e d n a 芯片的探针是e d n a ，由于e d n a 就是与m r n a 互补的d n a ，因此被认为 是真实表达的基因。是将微量e d n a 片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，基因 点样密度较传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载 玻片6 万个基因。e d n a 芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，目前许多实验室 和制药公司都用此类芯片。e d n a 芯片主要用于一般的检测芯片和表达谱研究8 5 ，8 6 1 。 按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片和毒理芯片 等。 1 3 2 基因芯片的应用： 基因芯片技术产生以后，由于其检测的快速和高通量性，便得到了广泛的应用，并 不断发展。最初在医学研究、药物筛选等方面开始应用，后又逐步扩展到动物、植物、 昆虫和微生物等领域。已经用于基因差异表达检测、突变体检测、基因组多态性分析、 基因文库作图和杂交测序等方面的研究。基因芯片主要应用于以下几方面。 1 3 2 1 基因表达水平的检测 常规检测基因表达的方法不仅工作量大，而且存在着一次仅能检测少量基因以及灵 敏度不高等局限性，而基因芯片技术可以高敏感度地定量、定性检测基因表达水平，既 可以同时比较不同标本基因表达水平的差异，也能够提供某一基因或一群基因的表达模 7 福建农林大学硕士学位论文 式与其他基因表达模式相互间关联的信息。目前多是将不同来源、不同组织、不同时期、 不同外界条件下m r n a 或c d n a 与芯片杂交，从而获得相应的基因表达谱。 s c h e n a 等人首次使用e d n a 基因芯片检测拟南芥( ar a b i d o p s i st h a l i a n a ) 中不同基因表 达和表达水平的差异，用4 5 个拟南芥e d n a ( 1 4 个完全序列和3 1 个e s t 序列) 和3 个对 照( 分别来源于不同种属的人类a c h 受体、鼠糖皮质激素受体和酵母t r p 4 的c d n a ) 构 建成的微阵列，同时用丽丝胺( 1 i s s am i n e ) 和荧光素( f l u o r e s c e i n ) 分别标记探针，探针与微 阵列杂交。结果发现，在对照组中均未检测到杂交信号，说明该微阵列的特异性很高； 在根和叶组织中检测到2 6 个基因的表达存在差异，其中参与叶绿素合成的c a b i 基因 在叶组织中的表达水平较根组织中的表达水平高5 0 0 倍【8 7 1 。s h i n j i 等用不同盐浓度处理 水稻耐盐品种( v a r p o k k a l i ) 的根并构建c d n a 文库，得到1 7 2 8 个片段组成的c d n a 微阵 列，结果显示，在盐胁迫l 小时内约有1 0 的序列表达水平发生显著变化，随着时间的 增长，对照和处理的差异在持续数小时后变小，一周后处理中在l 小时内表达升高的序 列恢复到对照水平，说明随着植株对盐胁迫的适应，基因的表达情况也在发生着动态变 化【8 8 】。j a c e o u d 等则将基因芯片技术应用于水稻品种资源的遗传多样性分析【8 9 1 。r u u s k a 等等利用c d n a 微阵列芯片检测拟南芥种子在发育过程的基因表达，发现淀粉合成相关 基因在幼嫩种子中的表达十分活跃，而随着种子逐渐成熟这些基因的表达量逐渐减小 9 0 l 。l u 等结合c d n a 微阵列和s s h 技术，分离并鉴定了一个与稻瘟病亲和与非亲和性 反应有关的新基因 9 1 1 。m i s s o n 等使用a f f y m e t r i x 的a t h l 芯片测定拟南芥短期、中期和 长期磷缺乏的基因表达差异，发现在短期磷缺乏情况下，7 2 个基因被诱导表达，4 个基 因沉默，随着磷元素的缺乏，基因被诱导表达的数量逐渐增多【9 2 1 。c a s u 等利用a f f y m e t r i x 基因芯片研究甘蔗茎细胞壁代谢和发育基因表达，检测到了1 1 9 个高度表达的转录本， 并发现了一些与纤维素合成相关的基因 9 3 1 。k l o o s t e r m a n 等构建了含1 ，3 1 5 c d n a 的马铃 薯基因芯片，研究马铃薯块茎发育【9 4 】。 c a r l s s o n 等利用拟南芥花器官特异c d n a 芯片研究甘蓝型油菜c m s 的机理，发现保 持系与不育系之间的基因表达差异很大，其中一些在花药或花粉中表达的基因在c m s 中不表达，与细胞壁形成有关的基因表达在c m s 材料中受到了抑制【9 5 1 。c e r c o s 等用含 7 , 0 0 0 个基因的c d n a 芯片研究克里曼丁桔( c i t r u sc l e m e n t i n a ) 果实发育和成熟时的基因 表达变化，揭示了在果实成熟过程中柠檬酸及细胞质酸性下降的分子机理1 9 6 。p u t h o f f 等利用基因芯片分析了拟南在不同胞囊线虫侵染下基因表达谱的变化，他们发现，用甘 蔗胞囊线虫( h e t e r o d e r as c h a c h t i i ) 侵染拟南芥时，1 2 8 个基因的表达发生变化而用大豆胞 囊线虫( h g l y c i n e s ) 侵染时仅1 2 个基因的表达发生变化，并且这1 2 个基因包含在前面的 8 福建农林大学顿士学位论文 1 2 8 个基因中【9 7 1 。m a r a s c h i n 等利用与胚发育相关的表达标签制作的芯片，揭示了大麦 孤雄生殖的分子机理【9 8 1 。n 等利用含8 , 0 9 5 个油菜基因的芯片研究经寡聚糖 ( o l i g n c h i t o s a n ) 处理后的油菜基因表达谱变化，发现共3 9 3 个基因表达发生改变，其中， 2 5 7 个沉默，1 3 7 个上调表达】。n e g i s h i 等还以包含有8 9 8 7 条水稻c d n a 克隆的微阵 列研究了大麦根部铁元素胁迫的表达谱变化，并获得了一批铁元素胁迫相关的基因【1 0 0 。 爱荷华州立大学利用这种高通量工具对2 0 0 0 0 个玉米e s t 序列的37 端进行了研究。这 些研究为研究物种的基因组表达及相互关系提供科学依据和丰富的数据库资源。并且在 差异表达基因的研究方面，由于基因芯片的敏感性和高通量性，很好地解决了普通的消 减杂交和差异筛选技术中存在的富集和扣除之间的矛盾，还可以同时对大量基因的表达 差异进行对比分析。 1 3 2 2 功能相关基因的检测 生物的很多生理过程不是单基因控制的，而是由一系列直接或间接作用的功能相关 基因，相互作用的结果。基因芯片技术通过平行监测众多基因表达模式进行功能分析， 有助全面了解生物在特殊处理和不同环境胁迫下较为完整的基因表达情况，从而找到与 特定功能相关的基因情况。 饶志明等( 2 0 0 2 ) 用2 2 0 0 条来源于受稻瘟病菌处理的水稻e s t 序列制备成c d n a 微 阵列，分析了抗稻瘟病近等基因系g 2 0 5 和g 7 1 受稻瘟病菌胁迫后基因表达的差异，检 测到3 8 个差异表达克隆，其功能涉及到病程相关、信号转导、逆境胁迫及光合作用和 糖代谢等方面，基本构成了从信号传导到主动和被动防卫反应的复杂防卫系统【1 0 l 】。 1 3 2 3 寻找新基因 生物体的发育分化及对环境因子刺激所产生的应答反应等一系列生命活动过程均由 基因来调控。利用基因芯片技术可以从表达序列水平对生物基因组进行快速、高通量研 究，如寻找动植物抗病、生物抗药性、植物抗旱和抗寒以及高产、优质相关基因，有利 于新基因的发现和利用。h a r o n i 等从草莓中分离了1 7 0 1 个c d n a 片段构建微阵列，研 究草莓果实不同成熟期果实颜色与成熟度的关系，发现有4 0 1 个基因在绿、白和红色果 实中表达显著差异，通过r n a 杂交发现新基因，其中草莓乙酰基转移酶基因( s t r a wb e r r y a l c o h o la c y l tr a ns e r f a s e ，s a a t ) ，在草莓成熟时特殊风味合成中起很重要的作用 1 0 2 1 。 9 福建农林大学硕士学位论文 2 1 试验材料 2 材料与方法 2 1 1 供试菌株及植物 稻瘟病菌g u y l l 菌株由法国d i d i e r t h a r r e a u 博士提供； 稻瘟病菌7 0 1 5 菌株由美国普渡大学徐金荣博士赠送； 水稻品种为c 0 3 9 近等基因系( c 0 3 9 n i l s ) 2 1 2 培养基 菌丝生长培养基：酵母完全培养基( c m ) ( 酵母粉6 叽，水解酪蛋白6 9 l ，蔗糖1 0 9 l ，琼 脂粉2 0g l ) ；酵母液体培养基( c m ) ( 酵母粉6 9 l ，水解酪蛋白6 9 l ，蔗糖l o g l ) ； 产孢培养基：米糠培养基( 米糠3 0 9 l ，琼脂粉2 0 9 l ，p h6 。o ) 。 2 1 3 生化试剂 p c r 试剂( 1 0 xt a qb u f f e r 、d n t p 、t a q 酶) ，其它常规试剂均为国产分析纯，引物由福州 博鸿生物技术有限公司合成。t r i z o l 总r n a 提取试剂( 天根生化科技有限公司) ；基因芯 片试验所需试剂( 详见附件) ；r t - p c r 试验所用试剂采用p r o r n e g a 公司的r t - p c r 试剂盒。 基因芯片采用a g i l e n t 公司的m a g n a p o r t h eg r i s e a2 0o l i g om i c r o a r r a yk i t ，它包含了 1 5 ，1 7 0 个mg r & e a 探针，和6 , 3 2 5 水稻探针，每个探针由6 0 个核苷酸组成。 2 2 试验方法 2 2 1 稻瘟病菌菌丝体获得 切取在酵母完全培养基上活化好的g u y ll 菌丝块，转移至酵母液体培养基中，于2 5 1 2 、1 3 0 r p m 振荡培养4 8 h 一7 2 h ，后用经高压蒸汽灭菌过的滤纸片过滤收集菌丝体。 2 2 2 稻瘟病菌侵染水稻后病叶的获得 用米糠培养基培养稻瘟病菌菌丝，待菌丝长满平板时，刮除菌丝，置于2 5 ( 2 光照培 养3 d ，用无菌水洗脱分生孢子，经两层擦镜纸过滤分生孢子悬浮液，将浓度调整至l 1 0 6 个m l ，喷雾接种3 叶1 心的水稻植株，2 5 ( 2 黑暗保湿2 4 h 后，移到相对湿度8 0 以上 的人工气候培养室培养。以同样处理，但接种清水的为对照。于接种后的4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 分别取样，迅速投入液氮，至一8 0 ( 2 冰箱待用。 2 2 3 总r n a 的提取( t r l z o l l 1 0 望堡奎签奎兰堕主堂垡笙茎 提取g u y l l 菌丝体和稻瘟病菌孢子接种水稻后不同时间段水稻叶片的总r n a ，具 体方法如下： ( 1 ) 将收集的菌丝和水稻叶片用液氮研磨成粉末( 在研磨过程中注意保持组织处于冷冻状 态) ，转k 2 m l 离心管中，按每1 0 0 m g 样品加入1 m lt r i z o l ，振荡混匀，室温静置5 m i n ； ( 2 ) 然后加入0 2 倍体积的氯仿，盖子盖紧后剧烈振摇1 5 秒使混匀，室温放置3 m i n ，4 。c 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色水相； ( 3 ) 将上层水相转移至一个新的离心管( 水相的体积大约为所用t r i z o l 体积的6 0 ) ，加入 o 8 倍体积的异丙醇，混匀，静置1 5 m i n ( 或更久) ，4 c1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清； ( 4 ) = l j n n 7 0 酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分。如沉淀较大可用t i p 头先将沉 淀打散。然后4 7 , 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清； ( 5 ) 室温凉置5 1 0 m i n ，然后加入适量的无r n a s e 的水溶解； ( 6 ) j 口e k 0 5ul1 0 m g m ld n a s ei 于3 7 。c 反应1 h ； ( 7 ) 反应结束后，加入无r n a 酶的水，将体系扩大至5 0 01 al ，加入等体积的水饱和酚：氯 仿：异戊醇( 2 5 ：2 - 4 ：1 ) ； ( 8 ) 4 c1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ； ( 9 ) 转移上清至另一干净的无r n a 酶的离心管中，加入2 5 倍体积冰冻无水乙醇和0 1 倍体 积3 mn a a c ( p h5 2 ) ，混匀，- 2 0 放置过夜； ( 1 0 ) 4 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ； ( 1 1 ) 弃上清，加入7 0 酒精洗沉淀2 次，晾干5 1 0 m i n ，加入适量的无r n a s e 的水溶解沉 淀。 ( 1 2 ) 用分光光度计分析r n a 浓度，1 琼脂糖电泳检测r n a 的纯度。 2 2 41 琼脂糖电泳检测r n a 的纯度 ( 1 ) 配置用d e p c 处理的电泳缓冲液5 0 t a e ，高压灭菌后待用； ( 2 ) 使用电