促红细胞生成素对慢性高眼压下大鼠视网膜Caspase_9表达的影响[1].pdf

作者简介 归东梅 女 1972年 1月 出生 辽宁沈阳人 博士学位 副教 授 副主任医师 研究方向 主要从 事青光眼视神经保护的临床和基础 研 究 联 系 电 话 024 24831116 H E mai l guidongmei2004 yahoo com cn AboutGUI Dong M e i Female born in January 1972 M edical doctor asso ciate professor Study direction neuro protection in g laucoma Te l 86 24 24831116 H E mai lguidong mei2004 yahoo com cn 收稿日期 2009 10 16 修回日期 2009 12 21 本文编辑 董建军 作者单位 110004 辽宁省沈阳市 中国医科大学附属盛京医院眼科 Received date O ct 16 2009 Accepted date Dec 21 2009 From the Department of Ophthal molo gy Shengjing H ospital Affiliatedto China M edical University Shenyang 110004 Liaoning Province China 实验研究 促红细胞生成素对慢性高眼压下大鼠 视网膜 Caspase 9表达的影响 归东梅 石 磊 杨 颺 李 迅 高殿文 Effect of eryt hropoietin on expression of Caspase 9 in retinas of ratswith chronic ocular hypertension GUIDong M e i SHI Le i YANG Yang LI Xun GAO D ian W en K eywords erythropoietin Caspase 9 ocular hypertension retina apoptosis Abstract Objective To investigate the effective m echanis m s of erythropoietin EPO in apoptotic process of retinal ganglion cells M et hods About 120 rats were rando m ly divided into 12 groups 10 rats 20 eyes in each group Scleral cauterization was used tom ake ratm odelsw ith chronic ocular hypertension Intraperitioneal injection ofEPO was performed in EPO treat m ent group RT PCR and W estern blotting m ethod were used to exam ine the mRNA and protein expression of Caspase 9 genes in retinas of each group The changes of am plitude of ERG bw ave and retinal thicknesswere de tected before and after injection ofEPO Results Retinal edem a and thinning of reti nal thickness in EPO treat m ent group were decreased obviously therewere significant differences co m pared w ith non drug treat m ent group The am plitude of ERG b wave was obviously recovered in EPO treat m ent group and statistical difference was found bet ween the t wo groups Except for 3 days after hypertension group mRNA and protein expression of Caspase 9 were obviously decreased after drug treat ment and statistical differencewas found w ith non drug treat m ent group Conclusion EPO has protec tive effect on retina after chronic hypertension and one of its m echanisms is inhibiting the apoptotic signal transduction induced by Caspase 9 Rec AdvOphthal m ol2010 30 8 727 730 736 中图分类号 Q959 836 R775 文献标志码 A 文章编号 1003 5141 2010 08 0727 05 关键词 促红细胞生成素 Caspase 9 高眼压 视网膜 凋亡 摘要 目的 探讨促红细胞生成素 erythropoietin EPO 在视网膜神经节细胞凋亡途径 中的作用机制 方法 选取 120只大鼠随机分为 12组 每组 10只 20眼 巩膜烧灼法制作 大鼠慢性高眼压模型 用药组每只大鼠腹腔注射 EPO 应用 RT PCR 法 W estern blotting印迹法检测各组视网膜组织中 Caspase 9基因 mRNA 及蛋白表达情况 检测用药前后 ERG b波波幅和视网膜厚度的变化 结果 EPO 用药组视网膜水肿明 显减轻 视网膜厚度变薄的趋势明显减弱 与未用药组比较差异有统计学意义 用药组 ERG b波波幅明显恢复 2组差异有统 计学意义 Caspase 9mRNA 和蛋白在用药后除高眼压后 3 d组外 表达均明显减少 与未用药组比较 差异有统计学意义 结论 EPO 对慢性高眼压后的视网膜具有保护作用 其机制之一是通过抑制 Caspase 9介导的凋亡信号转导途径来完成的 眼科新进展 2010 30 8 727 730 736 近年来促红细胞生成素 erythropoietin EPO 的 神经保护作用越来越受到人们的关注 它除了通过 抵抗脑缺血再灌注后氧自由基的损害 抗兴奋性氨 基酸的神经细胞毒性及抗氧化作用外 还阻滞了神 经细胞的程序性死亡 在中枢神经系统缺氧时对神 经元有保护作用 1 11 本实验拟在大鼠高眼压后腹 腔内注射重组人红细胞生成素 r HuEPO 观察 EPO 对视网膜的作用 以及 EPO 与半胱氨酸天冬酶 9 Caspase 9 的关系来进一步探讨 EPO在视网膜神 经节细胞凋亡途径中的作用机制 1 材料与方法 1 1 实验动物及分组 中国医科大学实验动物中 心提供 120只出生后 40 50 d的 W istar大鼠 体质 量 200 250 g 雄性 无眼疾 将 120只大鼠随机分 为 12组 每组 10只 20眼 12组分别是空白对照组 高眼压 3 d组 高眼压 7 d组 高眼压 14 d组 高眼压 21 d组 高眼压 28 d组 注射 EPO 高眼压前组 注 射 EPO 高眼压 3 d组 注射 EPO 高眼压 7 d组 注射 EPO 高眼压 14 d组 注射 EPO 高眼压 21 d 组 注射 EPO 高眼压 28 d组 727 眼 科 新进展 2010年 8月 第 30卷 第 8期 RecAdv Ophthalmol Vol 30N o 8August 2010http www ykxjz com 1 2 动物模型的制备 用 100 g L 1水合氯醛 3 mL kg 1腹腔注射 完全麻醉后 用倍诺喜滴眼 2次 行眼表麻醉 剪开颞侧及上方球结膜 暴露巩膜浅层 静脉 大鼠眼球鼻侧 颞侧 颞上及颞下各有一条浅 层静脉 走行较为笔直 用热凝止血器烧烙 2或 3 条浅层巩膜静脉 对照组只打开球结膜 巩膜静脉不 做处理 结膜切口不做缝合 术后用地塞米松眼液滴 眼及红霉素眼膏涂眼 大鼠眼压用 TONO PEN 型 笔式眼压计测量 测量分别于术前 术后 30 m in 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d进行 眼压超过术前 40 的手 术眼为建模成功 2 药物益比奥 重组人红细胞生成 素 r HuEPO 由沈阳三生制药股份有限公司生产 每支 3 000 U 用药组每只大鼠腹腔注射 EPO 剂量为 5 000U kg 1 注射时间分别为术前 1 d 术后 2 d 术 后 6 d 术后 13 d 术后 20 d 术后 27 d 共 6次 1 3 组织标本收集及处理 不同组的动物处死后 立即摘除双眼眼球 置入 0 生理盐水中 沿睫状体 平坦部冠状面切开眼球 弃去眼前节 小心完整分离 视网膜后用滤纸尽可能吸干水分放入冻存管中立即 置于液氮中 24 h后贮存在 80 冰箱保存 备 RNA和蛋白质的抽提液 1 4 目的基因 mRNA的检测 应用 RT PCR目的 基因 mRNA进行检测 应用美国 Gibco公司的 TR IZOL试剂盒方法对各组总 RNA进行提取 内参照 基因 GAPDH Caspase 9引物均应用 Pri mer Express 3 0软件自行设计 引物序列如表 1所示 上述引物 均由大连宝生物工程公司合成 95 5 m in逆转 录 94 40 s变性 60 40 s退火 72 60 s延 伸 共 32个循环 扩增产物经 15 g L 1琼脂糖凝 胶电泳 于 UVIpro凝胶图像分析系统下观察并摄 像 并用 F loorchem V2 0软件进行扫描分析 以目的 基因条带的吸光度值 A 与 GAPDH 条带吸光度值 A 的比值作为目的基因 mRNA的相对含量 表 1 目的基因 Caspase 9及内参照基因 GAPDH 的 PCR引物序列及产物大小 Table 1 PCR pri mer series and production length of target gene Caspase 9 and endo reference gene GAPDH GenePrm i er seriesPCR producti on length GAPDHUpstrea m prm i er 5 ACCACAGTCCATGCC ATCAC 3 452 bp Do wnstrea m prm i er 5 TCCACCACCCCTGTTGCTGTA 3 Caspase 9Upstrea m prm i er 5 TTTAAGCTC TCAGAAGACATG 3 363 bp Do wnstrea m prm i er 5 TGTTGAAGTACAGACAGTACCCCCA 3 1 5 蛋白质的检测 应用 W estern blotting印迹法 进行蛋白质检测 将剪碎的视网膜组织超声匀浆后 12 000 r m in 1离心 30m in 取上清 酚试剂法测定 蛋白浓度 将各组蛋白浓度调至同一水平 取 30 L 蛋白 加入样本缓冲液煮沸 5 m in 150 g L 1 SDS PAGE 电泳 然后电转膜到硝酸纤维素膜上 用 TBS 20 mmol L 1 T ris HC l 150 mmol L 1 NaC l p H 7 4 配制的 80 g L 1脱脂奶粉室温封闭 1 h 兔抗 大鼠 Caspase 9 武汉博士德公司 工作浓度 1 200 4 孵育过夜 TTBS洗膜 二抗 辣根过氧化物酶标 记的羊抗兔 IgG 1 2 000 室温孵育 2 h 加入显色 液 15 30m in后终止 显色后行计算机扫描 结果用 F loorchem V2 0软件进行扫描分析 以目的蛋白条 带的吸光度值 A 与 actin条带吸光度值 A 的比 值作为目的蛋白的相对含量 1 6 视网膜电图的测量 用 VETS 3型电生理仪 重庆医电 检测 ERG b波变化 全身麻醉下充分 散瞳暗适应后角膜接触式电极法进行 ERG b波波幅 检查 地电极刺入同侧耳缘皮下 参考电极刺入前 额皮下 角膜工作电极连于角膜接触镜 用全视野 闪光刺激器 角膜平面距离白色刺激光 15 c m 刺激 光强 3 93 cd m 2 刺激频率 1 9H z 通频带宽 1 100H z 记录的 ERG b波波幅值为连续 3次测量的 平均值 两次刺激光间隔时间 5 s ERG b波波幅指 a波波谷至 b波波峰之间的垂直距离 大小以 V为 单位 1 7 视网膜厚度的测定 标本切片后行苏木素 伊 红染色 HE染色 于光镜下以 40倍物镜观察视网膜 变化 以 Olympus EvolutionMP5 0数码相机采集数码 图像 以 M eta morph BX51显微图像分析软件测量视 网膜内界膜至外界膜距离 以下简称为视网膜厚度 测量地点为视盘鼻侧 200 m 外 每个标本切片 3张 每张切片测 3次 取其平均数 以同样倍数及物距采 集标尺图像 将所测值 像素数 换算为 m 1 8 统计学分析 统计结果均以均数 标准差表 示 多组均数间的比较用 One Way ANOVA分析 均 用 SPSS 12 0软件进行统计学分析 2 结果 2 1 注射 EPO前后视网膜内 ERG b波波幅变化 注射 EPO 前后视网膜内 ERG b波波幅变化情况见 表 2 用药组在高眼压 7 d时 b波明显恢复 在 28 d 时未用药组 b波是正常的 61 而用药组恢复到 80 二者差异有显著统计学意义 P 0 05 随着高眼压时间的延长 高眼压后 3 d 7 d视网膜增厚 到 21 d 28 d视网膜萎缩 变薄 用药组 7 d 视网膜水肿明显减轻 21 d 28 d视网膜 厚度变薄的趋势明显减弱 28 d厚度恢复到正常的 88 而未用药组 28 d时厚度只有正常的 65 差异 有显著统计学意义 P 0 05 随着高眼 压时间的延长 Caspase 9mRNA表达逐渐增加 高眼 压后 14 d达到高峰 用药组 Caspase 9 mRNA表达的 增加趋势明显减弱 而且在各个时间段与未用药组 对比 差异均有统计学意义 均为 P 0 05 表 2 注射 EPO前后视网膜内 ERG b波的波幅变化 Table 2 Changes of a mplitude of ERG b wave in retinas before and after injection of EPO x s n 10 T i meNon drug treat ment group V V EPO treat ment group V V tP Before injecti on113 05 9 53119 45 11 430 750 480 3 days after injection92 71 7 3897 34 8 451 040 430 7 days after injection72 37 8 1598 21 10 23 3 460 025 14 days after injection65 51 0 0495 57 9 29 9 280 009 21 days after injection68 65 0 0693 32 6 42 4 980 016 28 days after injection69 91 0 04 95 32 9 12 2 960 038 No te Comparedw ith non drug treat ment group P 0 05 P 0 01 Figure 1 Changes ofmorphology in retina before and after injection ofEPO 1 U L 1的 EPO能保护由缺氧所致或培 养的神经细胞的凋亡 且可上调 Bcl xlmRNA 和蛋 白的表达 Junk等 7 发现在急性视网膜缺血再灌注 损伤动物模型中缺血上调了视网膜 EPOR mRNA 的 表达 缺血后 12 h开始上升 72 h达到高峰 是正常 的 4倍 而 EPO 的表达呈下降趋势 48 h后下降 52 免疫细胞化学双标记染色示 EPOR的表达定 位在视网膜神经节细胞 无长突细胞和 M ller细胞 在缺血前 24 h预治疗或缺血时立即腹腔注射 r HuE PO有助于视网膜功能的恢复 并发现 TUNEL 原位 末端标记物法 阳性细胞减少 而缺血后用 r HuEPO 无效 提示 EPO通过抗凋亡机制对急性视网膜缺血 再灌注损伤具有神经保护作用 外源性全身应用 EPO可以挽救损伤的神经元 关于 EPO 神经保护 作用的机制可能与 EPO的抗细胞凋亡作用 保护神 经元免受兴奋性氨基酸的毒性作用 增强细胞钙内 流 抑制一氧化氮 NO 过度合成等有关 12 本实验通过腹腔给予 r HuEPO与未用药组相 比 在视网膜的结构上 光镜的结果表明视网膜节细 胞的损伤明显减轻 在视网膜的功能上 从视网膜 电图的 b波的波幅看 在未用药组 在高血压 28 d时 b波的波幅下降了 39 而用药组在 28 d时 b波的波 幅只下降了 20 两者相比差异有显著统计学意义 P 0 01 这些结果表明外源性的全身注射 EPO 对处于缺氧负荷的视网膜具有保护作用 与以往国 内外的研究结果相一致 6 另外我们还通过用药组和未用药组凋亡信号转 导通路中 Caspase 9的转录水平和蛋白质合成的变 化 来探讨 EPO对视网膜的保护机制 关于 Caspase 家族 是近年来凋亡研究的热点 它的活化是导致细 胞凋亡的中心环节 8 不同的启动性 Caspase通过 不同途径介导不同的凋亡信号 研究表明主要有两 种途径 一是 Caspase 8介导的死亡受体相关信号的 死亡受体途径 发生在细胞膜部位 二是 Caspase 9 介导的细胞毒性的死亡信号的线粒体路径 发生在 线粒 体部位 在多种 应激因 素作用 下 激活的 Caspase 9将活化 Caspase 3 后者是凋亡的执行者 是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路 所以 Caspase 9作为凋亡的启动子 是细胞发生凋亡的最 早的信号 以往的研究表明高眼压后 视网膜神经 节细胞发生凋亡 Caspase 9的表达有增强 9 10 从 mRNA的转录水平来看 外源性全身使用 EPO后 在 除高眼压 3 d外的各个时间段 EPO对 Caspase 9mR NA的高表达均有抑制作用 差异有统计学意义 P 0 05 在高眼压 7 d 14 d 21 d 28 d的变化差异均 显著 以上结果首先表明 EPO对高眼压后视网膜内 的凋亡基因 Caspase 9有抑制作用 其次对蛋白质合 成的抑制时间滞后于对 mRNA转录的抑制 这一方 面说明 EPO的抑制作用是通过凋亡信号转导途径实 现的 另一方面又说明 EPO 对损伤视网膜的保护要 有一个浓度蓄积的过程 需反复多次应用 下转第 736页 730 http www ykxjz co m 眼 科 新进展 2010年 8月 第 30卷 第 8期 Rec Adv Ophthalmol Vol 30N o 8August 2010 如 T细胞 B细胞和自然杀伤细胞的分化和增殖 19 李洪霞等 20 发现 IL 10可以降低大鼠急性肺损伤后 炎症因子 I L 1 mRNA TNF mRNA的表达水平 而这些细胞因子也是眼内炎症性疾病发病过程中非 常重要的炎症介质 本实验结果显示角膜穿通伤后可引起眼球壁组 织细胞的应激反应 刺激细胞于损伤早期分泌应激 反应蛋白而促进经典的炎症因子 TNF IL 1 等促 炎因子的释放 但抑炎因子 I L 10的分泌高峰出现较 晚 由此说明损伤早期局部眼免疫性炎症反应较严 重 内源性抑炎因子的作用相对较弱 不足以抑制炎 症反应 为减轻眼球壁组织的炎症损伤 可在损伤 早期局部使用外源性免疫抑制剂 以抑制炎症反应 保护眼球壁组织细胞 尤其是视网膜细胞 参考文献 1 胡海鹏 郭春溪 张秀萍 眼球穿孔伤 80例临床分析 J 眼外伤 职业眼病杂志 2007 29 3 212 213 2 BagchiM Ireland M KatarM M aiselH Heat shock proteins of chicken lens J J Cell Biochem 2001 82 3 409 414 3 BagchiM KatarM M aisel H Heat shock proteins of adu lt and embryonic hum an ocular lenses J J Cell Biochem 2002 84 2 278 284 4 Sharp PS AkbarM T Bouri S Senda A JoshiK Chen HJ et a l Protective effects ofheatshock protein 27 in amodelofALS oc cur in t he early stages of disease progression J N eurobiol D is 2008 30 1 42 55 5 Tanaka K M izush i ma T Protective role ofHSF1 and HSP70 a gainstgastrointestinal diseases J I n t J Hypertherm ia 2009 25 8 668 676 6 Akira S TakedaK Kaisho T Toll like receptors critical proteins link ing innate and acqu ired i mm unity J Na t I mm uno l 2001 2 8 675 680 7 Wallin RP Lundqvist A Mor SH von Bonin A Kiessling R L jung gren HG Heat shock proteins as activators ofthe innate i mm une syste m J Trends I mmun ol 2002 23 3 130 135 8 李 浪 颜兰香 Toll样受体及内源性配体 HSP的研究进展 J 国外医学生理病理科学与临床分册 2005 25 1 8 10 9 徐 祥 梁华平 核因子 B的结构和功能研究进展 J 细胞与 分子免疫学杂志 2002 18 1 92 95 10 Basu S B inder RJ Ra m alingam T Srivastava PK CD91 is a common receptor f or heat shock proteins gp96 hsp90 hsp70 and calreticulin J I mmun ity 2001 14 3 303 313 11 Bhakar AL Tann is LL Zeindler C RussoM P Jobin C Park DS et a l Constitutive nuclear factor B activity is requ ired for cen tral neuron survival J J N euro sci 2002 22 19 8466 8475 12 陈雪峰 何桂珍 董良广 TLR4及内源性配体对缺血 再灌注损伤 的作用 J 基础医学与临床 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