花生粕制备花生蛋白和多肽.doc

前言花生是我国六大油料作物之一1，上世纪90年代以来，我国花生生产得到持续发展，年均递增率2.7%，是全球增长最快的国家。2003年全国花生播种面积达到5056.7 khm2，总产量达15006 kt，总产量居世界首位，种植面积居世界第二位2。目前我国花生加工和综合利用主要用于榨油，且相当大的部分是被众多小型榨油厂消耗掉。由于技术落后，影响了花生营养的开发利用，蛋白质浪费较大。花生蛋白的营养价值较高，其生物价（BV）为58，蛋白质有效价（PER）为1.7，比面粉和玉米高3-4，它对维护人体健康和幼儿发育具有重要作用5。继大豆蛋白被人们充分认识和深度利用后，花生蛋白开始进人人们的视野并逐渐引起重视，花生正在成为优质食用植物蛋白资源。我国“十一五”发展目标明确提出20052010年，我国花生加工业主要由数量的增长转变为质量的提高，产品品种和经济效益同步增长，提高深加工转化率和利用率；进一步优化产业结构和产品结构，着重提高生产技术水平和产品的科技含量。因此，就要求在花生加工的过程中高效彻底地分离蛋白和油脂且尽可能减少对原料本身营养成分产生影响。另一方面，进一步开发花生蛋白产品，加强花生蛋白精深加工技术和设备方面的应用基础研究。人们研究发现，花生多肽是花生蛋白经酶作用后,再经过特殊处理得到的蛋白质分解物,是由许多分子链长度不等的低分子小肽混合组成的。多肽有比蛋白质更好的营养性能，蛋白质经酶作用后主要是以低肽的形式吸收的，通过物代谢实验证实出了肽的吸收率比氨基酸高6，比氨基酸更易、更快通过小肠粘膜被人体吸收利用7。同时肽具有低渗透压、低抗原性等特点。此外，蛋白质在酶催化下控制的水解，得到的肽混合物还具有许多重要的功能特性：一是在酸性条件下溶解性大大改善；二是高浓度仍是低粘度的溶液。虽然国内外对植物蛋白活性肽的研究已经达到一定水平，且相关产品已应用于医疗保健，但主要为大豆活性肽产品，而对于花生活性肽的研究才刚刚起步，相关产品甚少，无法满足食品工业需求8与其它多肽不同的是，花生多肽含有白藜芦醇，它对心血管疾病和动脉硬化有明显抑制效果，亦可藉此促进人类肿瘤细胞的凋亡，或是受过肿瘤抑制因子P53的表现来达到抗肿瘤活性。因此，近年来我国加强了对花生多肽的开发和利用。所以研制花生蛋白和多肽是很有必要的，它将经济效益、环保效益和社会效益紧密的结合在一起。1文献综述1.1花生粕的简介花生粕是以脱壳花生果为原料，经提取油脂后的副产品，呈淡褐色或深褐色，有淡花生香味，形状为小块状或粉末状9，含有少量花生壳。它的产量大，来源广，价格低，且其中含有30 50的花生蛋白质，大部分花生粕作为饲料使用，有的甚至作为废料丢弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。花生粕的粗蛋白质含量接近大豆粕，但氨基酸不平衡，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸缺乏。花生粕中的蛋白质含量最高(48.68)，其次是可溶性总糖(32.50)、灰分(5.61)、脂肪(0.80)，每100 g花生粕中的含维生素E、维生素B1、维生素B2含量分别为0.871、0.237、0.282mg10。花生粕中含有大量的有效成分，以花生粕作为饲料并不能充分利用这种资源，所以花生粕这一副产品具有进一步研究及开发利用的潜力。1.2 花生蛋白的研究现状1.2.1花生蛋白及其组分花生中含有2536的蛋白质。对于花生蛋白质的种类，国内报道大多将花生蛋白分为两大类即水溶性蛋白和盐溶性蛋白，其中大约有10%的蛋白质是水溶性蛋白，称之为乳清蛋白，其余的90%为盐溶性蛋白。韦一能等11采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳、等电聚焦和等电聚焦后分别取不同等电点的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，研究花生蛋白的主要种类，结果显示花生蛋白有两种主要组分和一种次要组分。国内大多报道认为盐溶蛋白的主要成分包括花生球蛋白和伴生花生球蛋白，花生球蛋白为两个亚基组成的二聚体，伴生花生球蛋白是由67个亚基所组成12。杨晓泉等13通过SDS-PAGE分析显示花生的盐溶蛋白主要由花生贮藏性蛋白质组成，包括花生球蛋白、伴花生球蛋白和2S蛋白。SDS-PAGE显示花生球蛋白有两个酸性亚基和三个碱性亚基组成，伴花生球蛋白仅有一个亚基，而2S蛋白由6个多肽组成；其通过激光质谱法测定了花生2S蛋白各组分的分子量，确认2S蛋白六个主要多肽是以离解形式而非亚基形式存在14。花生中的蛋白的营养价值与动物性蛋白质差异不大，而且不含胆固醇，花生蛋白的生物价(BV)为58，蛋白效价(PER)为1.7(酪蛋白为2.5)，比面粉(1.0)，玉米(1.2)均高15，其营养价值在植物性蛋白质中仅次于大豆蛋白。1.2.2 花生蛋白的应用从具有代表性的欧美等发达国家的花生产业的发展历程来看，花生生产目的是以油用为主逐步向食用方向发展的，花生生产不单是为了榨油，而是为了获得高蛋白的营养食品。近年来，我国在花生蛋白的加工技术及其利用方面，取得了一定的进展。2001年河南久宝生物工程公司研制开发出常温环保一步法“花生制油与蛋白提取”技术，使我国在花生蛋白质的研究方面取得了进展。这种技术在一定程度上解决了传统工艺中存在的蛋白质变性等难点。国内利用花生仁经低温脱脂、水循环冷却磨粉工艺制取的花生蛋白粉，功能性与大豆蛋白粉接近，是食品加工中的理想原料。目前，国内已经开发出多种花生蛋白制品。我国花生蛋白产量在国内各种油料植物蛋白中居第二。专家预测，在我国随着花生蛋白开发的逐渐深入，花生作为天然植物蛋白资源的作用将得到充分发挥。在欧美等发达国家，花生主要被用来制作花生酱、花生蛋白制品以及各种糖果糕点、休闲食品，由于花生蛋白良好的功能性质和营养特性以及花生的良好风味，花生蛋白已经被应用于许多食品加工中16。发达国家的一些研究机构，相继开发出各种高蛋白食品、减肥食品等花生深加工产品。1.2.3 花生蛋白的制取方法（1）冷榨法 冷榨法即在60以下的低温状态下，对去红衣的花生进行压榨以实现在尽量保持原料本身营养前提下的花生油和花生蛋白的分离。冷榨法可以较好的保持花生蛋白的营养，降低蛋白的变性，但其出油率较低，脱脂不太彻底，饼中的含油量较大17，因此常与浸出法同时使用。在国外，德国的油料冷榨技术发展最快18，德国CIMBRIA SKET公司与埃森综合大学合作已研制生产出KR26型螺旋冷榨机并用于生产食用植物油。在国内，武汉工业学院与安陆市天星粮油机械设备有限公司也已经联合研制开发出LYZX系列螺旋冷榨机，张世鸿等19 利用此冷榨机生产出低变性花生粉。（2）浸出法 浸出法可分为直接浸出法和预榨浸出法。低温浸出和脱溶工艺，出油率较高，生产的花生饼粕中的蛋白变性小，所得的花生粉水溶性蛋白含量高。但其采用挥发性易燃溶剂，工艺要求复杂，成本较高，易有残留有机溶剂污染。樊云霞等17采用预榨浸出法利用4号溶剂浸出制取了花生脱脂蛋白粉。（3）水剂法水剂法是一种利用水剂作用把油、蛋白质和碳水化合物分离的新工艺。与传统方法相比，水剂法不用易燃易爆溶剂，提高了生产的安全性，降低了对空气的污染；可以同时生产出蛋白粉、油脂等产品，缩短了生产过程，出油率一般为9294%，蛋白质回收率可达70%以上；生产出的花生油纯度高、磷脂含量低、色泽浅、酸值及过氧化值也低。但实践证明，水剂法也存在一些限制其进一步发展的问题，如出油率低于溶剂浸出法(约为浸出法的95%)、蛋白与油脂分离能耗大、生产过程中的卫生要求高，并且生产中还产生大量的乳清液及废水尚需回收处理。最主要的一点是，蛋白产品具有较高的含油率，这使贮藏变得困难，油的氧化酸败给蛋白质带来了不利的气味和味道，严重限制了花生蛋白的应用。（4）膜分离技术 膜分离技术主要是与水剂法结合使用，经水剂法分离出蛋白，油脂及不溶物，而后用超滤技术提取蛋白，再用反渗透处理废液，可提高所得的蛋白氮溶解指数，并使整个原料无废料流出。但所使用的膜不可以二次应用，成本较高，污染严重。（5）水酶法 随着生物工程技术的发展，酶制剂逐渐在食品工业上得到应用。在植物油料中，油脂存在于细胞内，并通常构成脂多糖等脂类复合体。采用能降解植物细胞壁的酶或对油脂复合体有降解作用的酶处理原料，在机械破坏的基础上，细胞被进一步“打开”，使释放油脂更为完全。这一类酶有纤维素酶(CE)、半纤维素酶(HE)、果胶酶(PE)、蛋白酶(PR)、a一淀粉酶(aAM)、a一聚半乳糖醛酸酶(a-PG)和葡聚糖酶(-GL)等。这方面的研究，国外一直在继续，其研究成果也日趋成熟。研究表明，应用水酶法取油与传统取油工艺相比，具有一定优越性。处理条件较为温和，使粕饼中的其他成分(尤其是蛋白质)变性小，可利用价值高；可提高油的得率，而且所提取的植物油质量较高；可以提高设备的处理能力，降低能耗，但其会改变花生蛋白的某些功能特性。(6) 花生浓缩蛋白的制备花生浓缩蛋白的制备方法20主要包括酸沉淀制备法、乙醇洗涤制备法、酸沉淀和醇沉淀相结合制备法和己烷含水乙醇混合溶剂制备法。这些方法都是以花生蛋白粉或冷榨花生饼为原料，通过调节pH值或有机溶剂沉淀的方法除去少量水溶性糖分、灰分和其他可溶性成分，而淀粉和纤维素随凝集的蛋白质集中为一体；随后再通过低温干燥、粉碎即制得花生浓缩蛋白。刘大川等21曾采用一步法制备花生浓缩蛋白，制得的产品品质和功能性质较佳，尤其是溶解性较好.4种浓缩蛋白的制取工艺尽管不同，但产品得率都相差不大。用酸沉淀法生产的花生浓缩蛋白色泽和风味较差，用醇洗法及酸沉淀和醇洗涤相结合法制备的产品色泽和风味均较好，但产品的NSI值降低。用己烷95乙醇混合溶剂制备的花生浓缩蛋白，大大提高了产品的NSI值，其功能性也比较优良，但该工艺存在乙醇回收及己烷/95乙醇混合溶剂的混合比难以保持恒定的问题20。(7) 花生分离蛋白的制备花生分离蛋白含量高于花生浓缩蛋白，它的制备方法主要包括碱浸提酸沉淀制备法和超滤膜制备法。李明姝等人对碱提酸沉法制取花生分离蛋白的工艺进行了优化，制取的花生分离蛋白纯度可达90.21，蛋白质回收率可达75.7422。刘大川等人采用超滤膜法制备花生分离蛋白，产品蛋白得率高达95.8，水溶性蛋白含量为92.323。前者是通过调节pH值，利用碱提酸沉的方法不仅除去可溶性糖分，还除去淀粉、纤维素等成分，所得产品蛋白质含量较高(90%)。酸沉时大部分蛋白质从溶液中沉淀析出，只有大约10的蛋白质仍留在溶液中，这部分溶液称为乳清。乳清中含有可溶性糖分、灰分以及其他微量组分；后者则是在碱性条件下，根据花生蛋白与其他物质分子量上的差别，通过超滤的方法来分离花生蛋白质，通常与碱提酸沉法结合使用。用超滤膜法制备的花生分离蛋白纯度明显优于碱提酸沉法制备的花生分离蛋白，且功能特性也有显著的提高。但目前尚需解决的技术问题是超滤膜的污染及适宜的清洗方法。根据对各种制备方法的综合分析，为了制备高纯度，高质量的花生蛋白，我选择碱浸提酸沉淀的方法来进行实验。1.3花生多肽的研究现状1.3.1 肽的定义肽这个生物专用名词正从生命科学的实验室迈进我们的生活，并且开始深刻地影响改造着我们的生活品质。上世纪初科学家开始关注一类由氨基酸组成，比蛋白质小，结构简单，生理活性强的物质，它们与蛋白质没有本质的区别，但又不同于蛋白质。于是把这类物质称做“肽”或“多肽”，在其后的研究中，把其中的一部分功能明确将调节生物生理功能的多肽称作: 生物活性肽或功能肽。功能肽是由氨基酸构成，活性高，在极微量的使用下，都能发挥作用，它们在人体内被利用后迅速的被代谢，最终变为氨基酸或水，无残留，无副作用。1.3.2国内外对多肽的研究20世纪80年代，国际上如日本、韩国、美国等国家及欧洲都已经有了专业的多肽经营企业进行产业化运作。交流和研究课题涉及生物、化学、制药、食品等众多与多肽相关联的产业。近年来，在欧美和日本，已经形成广泛的多肽市场。产品主要有两个方面，一类是多肽药品和试剂，世界上100多种多肽药物已上市，这类产品纯度非常高，价格也非常昂贵；另一类是以活性多肽为功能因子的低抗原保健食品和含多肽普通食品。国内从20世纪80年代也开始花生多肽开发和应用方面研究，一些教育研究机构进行花生肽研究，对花生蛋白酶水解方面进行深入探索，已在蛋白酶选择，酶解工艺参数，水解液脱苦、脱盐、分离精制等方面取得一定进展。最近有报道武汉肽类物质研究所的科技人员在美国科学家的配合下，利用内切酶修饰复合酶技术，对花生蛋白进行定向酶切处理，制得了花生多肽，这可以说是一个前人从未尝试过的创新之举。 多肽的生产主要有合成与蛋白质体外水解两种方法。合成法主要有化学合成、DNA重组技术合成、酶法合成3种方法24。合成法虽然可按人们的意愿合成任意活性肽，但目前因为成本高、副反应物多及残留物等问题制约着其发展。重组DNA技术如果有望成功将会有广阔前景25 。体外水解蛋白质为肽有3种方法：酸水解、碱水解及酶法水解。前两种方法简单易操作，但可能存在营养和毒理方面有害的效应，因此其应用受到了一定的限制。蛋白质酶法水解能在一定的条件下进行定位水解产生特定的肽，且易于控制水解进程，并具有高度的专一性，一般不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理上的问题26。同时酶作用具有特异性，可在温和条件下进行，能耗低，因而能较好地满足肽的生产需要。因此，本实验我们选用酶解法来制备花生多肽。1.3.3花生多肽的应用花生多肽在很多方面都被应用：医院病人营养食品。运动员食品。 老年人保健食品。花生多肽饮料。新型发酵食品的开发。 减肥食品。用于各种花生制品。用于鱼、肉等高蛋白制品。用于培烤食品。用于糖果、糕点27。1.4实验的分析方法1.4.1正交试验直观分析法在单因素试验的基础上，为获得最佳提取工艺条件，确定出最优提取工艺，通常我们选择进行正交试验来验证。在正交试验中，我们将所要考虑的问题称为试验指标，如何安排试验才能获得最高的提取率，这里我们只有通过试验来解决。在一个有不同的因素和水平的实验中，如果每个因素的每个水平都互相搭配着进行全面实验，必须做试验多次实验，这时将花费很多时间，耗费不少人力、物力，我们想减少试验次数，但又不影响试验的效果，因此不能随便减少试验，应当把又代表性的保存下来，这就是正交试验。按照此正交试验方案我们进行试验，需要分析的内容包括（1）计算极差，确定因素的主次顺序首先解释三个符号： Ki：表示任一列上水平号为i（本例中i=1，2，3或4）时，所对应的试验结果之和。 ki：ki= Ki/s,其中s为任一列上各水平出现次数，所以ki表示任一列上因素取水平i时所得试验结果的算术平均值。 R:称为极差，在任一列上R=maxK1,K2,K3minK1,K2,K3,或R=maxk1,k2,k3mink1,k2,k3.一般情况下，各列的极差是不相等的，这说明各因素的水平改变对试验结果的影响是不相同的，极差越大，表示该列因素的数值在试验范围内的变化，会导致试验指标在数值上更大的变化，所以极差最大的那一列，就是因素的水平对试验结果的影响最大的因素，也就是最主要的因素。（2）确定最优实验方案极差最大的因素即是我们要考虑的主要因素，它的几个水平中对应的数值最大的，说明该水平为最好。数据分析的结果表明，各因素对实验指标的影响程度，从而确定最优方案。如果我们所分析出的最好方案在所做的n次试验中没有出现过，我们需要做验证试验进一步验证。（3）优化验证试验按照（2）所得到的最好条件进行试验，与上面所做的正交试验的结果进行比较，找出的最好方案。1.4.2极差分析法在试验的数据处理中，为了更加有效的检验出有关因素对实验结果的显著性，方差分析是一种非常实用的检验方法。在试验中我们将表示试验结果特性的值如温度，时间等作为试验指标，可以用它们来考虑实验结果。利用正交表Ln(rm)来安排试验，r为因素的水平数，m为正交表的列数，n为总试验次数，假设实验结果为yi（i=1，2，n）。方差分析的基本步骤如下：1计算离差平方和(1)总离差平方和。； ； ;则 SST =Q-P.SST 即为离差平方和，根据上述公式，我们可以计算出各组的总离差平方和，它反映了实验结果的总差异。(2)各因素引起的离差平方和。由于因素A安排在正交试验的第一列，它引起的离差平方和为： SSA = A因素离差平方和表示出各组因素实验结果间的差异，这是由于它所取的水平的不同作用造成的，其他各因素相同。(3)试验误差的离差平方和。 SSe = SST - SSA -SSB -SSC -SSD表示出在各水平内，各实验值间的差异程度，它是由于随机误差的作用产生的。2 计算自由度 总离差平方和的自由度 dfT =试验总次数-1=n-1 正交表任一列离差平方和的自由度 dfA = dfB = dfC = dfD = 因素水平数-1=r-1 误差的自由度 dfe = dfT - dfA dfB dfC dfD由离差平方和的计算可以看出，在同样的误差程度下，数据越多，离差平方和越大，因此我们还要考虑数据的多少对实验造成的影响。3 计算平均离差平方和 MS=；MSB =；MSC = ； MSD =。试验误差的均方 MSe =均方表示各实验结果间的平均差异情况，它的值用离差平方和与自由度的比值得到。4 计算F值 将各因素的均方除以误差的均方，得到F值。 从各因素的F值可以看出，几个因素F值的大小，进而可以看出显著性的关系。5 显著性检验通常情况下，如果，就称为因素A对实验结果有非常显著的影响，用两个“*”号表示；若，则因素A对实验结果有显著的影响，用两个“*”号表示；若,则因素A对实验结果的影响不显著，不用“*”号表示。根据方差分析便可以检验出有关因素的显著性及实验数据间的误差情况。1.5实验的目的和意义长期以来，中国这个花生生产大国花生总量的55左右用于榨油，大多数的副产品被浪费掉。花生粕作为压榨花生油的一种副产物，产量大，来源广，价格低，且其中含有30 50的花生蛋白质，大部分花生粕作为饲料使用。为了弥补这种现象，本实验利用花生粕采用碱浸提酸沉淀的方法和酶解法来制备花生蛋白和多肽，确定最佳制备方案，使我们能更好地开发和利用花生蛋白质资源。在我国动物性蛋白资源严重不足而难以满足人们需要的情况下，这方面的研究将会达到更好改善资源匮乏的目的。本实验的研究将是人们回归理性的趋势，这对于改善人们的膳食结构，增加植物蛋白的产品竞争力具有极其重要的意义。 2.实验部分2.1花生粕制备花生蛋白的实验2.1.1花生粕制备花生蛋白实验的原理花生粕中的蛋白质大部分能溶于稀碱溶液，将它用稀碱液浸提后，离心分离去除花生粕中的不溶性物质(主要是多糖和一些残留蛋白质)，然后用酸把浸提液的pH调至4.5左右。通过测定蛋白溶液在不同pH溶液里650nm处的光吸收值大小的变化来判断，吸收值最大的pH溶液即为其相应的等电点溶液。我们可以测出花生蛋白的等电点pH4.528.此时蛋白质处于等电点状态而凝集沉淀下来，经分离得到的蛋白质沉淀物，再经洗涤、中和、干燥即得花生分离蛋白。2.1.2花生粕制备花生蛋白实验的材料及仪器1 实验材料花生粕粉末。烘干，粉碎过100目筛；盐酸；氯化钾；活性炭；PH分别为4.0，6.86，9.18的标准溶液； 考马斯亮蓝G-250染料试剂、标准蛋白质溶液BSA；氢氧化钠，天津市风船化学试剂科技有限公司； 2主要仪器乳钵，试管，试管架，试管夹，离心管，玻璃棒，洗耳球，锥形瓶（150ml,250ml）；移液管（1 ml，5 ml，10 ml）；量筒(10ml,100ml)；容量瓶 (100ml,250ml)；小烧杯（100 ml，150）；天平，上海精科天平仪器厂；量筒，上海亚荣生化仪器厂；标准检验筛，浙江省上虞县纱筛厂；JW-1A型固体样品粉碎机，江苏姜堰市分析仪器厂；DK-S26电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司； CCHN86801型pH计；VIS-7220可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；电子分析天平，上海天平仪器厂；LD5-10型低速离心机，北京医用离心机厂。2.1.2 花生粕制备花生蛋白实验2.1.2.1工艺流程碱浸提酸沉淀法：花生粕粉碎 烘干 浸出 碱溶 酸沉干燥花生蛋白产品2.1.2.2工艺操作粉碎与烘干先用铁锤和扳手把花生粕敲成绿豆大的小块，再用粉碎机粉成粉末。将粉末放入烘箱里烘2小时，过100目筛。1. 单因素实验（1）花生粕中蛋白沉淀酸沉最适pH值确定准确称取5g花生粕粉末在温度60 ，料液比1：20的条件下，先调pH为7.58.0之间放入水浴锅中浸提90分，然后在3000r/min的转速下离心10min后取上清液，再次用盐酸调pH分别为3.51，4.02，4.51，5.00，5.26，6.12，。加酸时，需要不断搅拌(一般搅拌速度为3O40 rmin)，同时不断抽测pH，静置2O30 min，使蛋白质能形成较大颗粒而沉淀下来，沉淀速度越快越好。再离心、干燥、恒重，并且多次进行平行实验。（2）提取时间对花生粕中蛋白提取率的影响在浸提时间分别为20min,40min,60min,80min下，按照（1）的步骤，酸沉时pH取4.5进行多次平行实验。（3）提取温度对花生粕中蛋白提取率的影响在浸提时间分别为60min下，温度分别为30，40，50，60，70，80下按照（1）的步骤，酸沉时pH取4.5进行多次平行实验。（4）料液比对花生粕蛋白提取率的影响在料液比分别为1：10，1:20，1:30，1:40，1:50，浸提时间为60min，浸提温度60 ，酸沉时pH取4.5的条件下，按照（1）的步骤进行实验并多次进行平行试验。（5） NaOH溶液浓度对蛋白提取率的影响 先分别用浓度为0.3mol/l，0.4mol/l，0.5mol/l，0.6mol/l，0.7mol/l，0.8mol/l的NaOH溶液调节花生粕粉末的pH，然后在浸提温度60 ，料液比1：20的条件下，浸提时间为90min，酸沉pH为4.5的条件下，按照（1）的步骤进行实验并且多次进行平行实验。2. 正交实验通过对影响蛋白提取率的单因素分析，得出较优工艺参数范围如下：提取时间80110min,提取温度5080，料液比1：151：30，NaOH溶液浓度0.30.6mol/l，为获得最佳提取工艺条件，按照 L16（44）正交实验表，依据单因素试验中（1）的步骤进行实验。2.1.3花生粕提取蛋白含量的测定蛋白质含量测定目前有五种方法，我们采用的考马斯亮蓝法是近几年普遍使用起来的，是根据蛋白质与染料结合的原理设计的。这一种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。具体步骤为：（1）分别称取0.5g提取所得的花生粕蛋白加少量水在乳钵中仔细的研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入150ml锥形瓶中，用少量4050 oC温水洗涤乳钵，将洗涤液移入锥形瓶内。加入10ml0.1mol/lNaOH溶液。把锥形瓶放到50oC水浴中，并小心旋转锥形瓶，直到蛋白质完全溶解。将锥形瓶内的溶液全部移至100ml容量瓶内，加水至刻度，塞紧瓶塞，混匀。（2）取两支100ml容量瓶，分别取上述样品10ml，定容至100ml作为待测样。取9支试管，2支留作样品测定，其余试管按表中顺序分别加入样品、水、试剂，即用1.0mg/ml的标准BSA溶液给个各试管分别加入：0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后用无离子水补充到1.0ml。最后试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250染料试剂。加完试剂25min后，可开始用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸收值A595，空白对照为第1号管，即1.0mlH2O加5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂。2.2花生蛋白制备花生多肽的实验2.2.1花生蛋白制备花生多肽的实验原理蛋白质的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。它的反应条件温和，副反应少。生物水解植物蛋白因其反应条件温和，对设备要求低；水解植物蛋白的食用安全性高，不会形成羟基化合物和羟基化合物的络合物等剧毒物质，风味良好，不会产生分解臭等优点，因此我们选用酶来分解植物蛋白制备多肽。2.2.2花生蛋白制备花生多肽的实验材料及仪器2.2.2.1实验材料花生粕粉末。烘干，粉碎过100目筛；盐酸，；氯化钾；活性炭；PH分别为4.0，6.86，9.18的标准溶液，；双缩脲试剂；氯化钠；木瓜蛋白酶，测得酶活力为6000U/g，无锡杰能科生物工程有限公司；柠檬酸，湖北省化工科技开发公司武汉华飞试剂厂；亚硫酸钠，天津市科密欧化学试剂开发中心。2.2.2.2实验仪器乳钵，离心管，玻璃棒，洗耳球，锥形瓶（150ml,250ml）；移液管（1 ml，5 ml，10 ml）；量筒(10ml,100ml)；容量瓶 (100ml,250ml)；小烧杯（100 ml，150）；天平，上海精科天平仪器厂；量筒，上海亚荣生化仪器厂；标准检验筛，浙江省上虞县纱筛厂；电子分析天平，上海天平仪器厂；JW-1A型固体样品粉碎机，江苏姜堰市分析仪器厂；DK-S26电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司； CCHN86801型pH计；VIS-7220可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；LDZX-40KB型立式电热压力蒸汽器，上海申安医疗器械厂；LD5-10型低速离心机，北京医用离心机厂；SHZ-型循环水真空泵，郑州长城科工贸有限公司。2.2.3花生蛋白制备花生多肽的实验步骤2.2.3.1工艺流程水酶法：花生粕粉碎 烘干 浸出 碱溶 酸沉煮沸 冷却酶水解灭活脱色抽滤 真空干燥花生多肽，冰箱保存2.2.3.2工艺操作 1. 花生蛋白制备花生多肽的单因素实验（1） 木瓜蛋白酶作用温度的确定 将所得蛋白质沉淀溶于25毫升水中，将其放入100的恒温水浴锅中加热30分钟。然后将其放入温度分别为30，35，40，45，50，55的恒温水浴锅中，加入一定量的Na2SO3,调pH为7.0左右且要不停的搅拌，用6500U/g原料的木瓜蛋白酶水解3小时，停止酶解。水解液中加入柠檬酸，调节pH=4.0到4.5，使酶失活，冷却。将水解液放入离心机中，以3000转/分的速度离心10分钟，除去下层沉淀，留上层清液。在清液中加入其重量5%的活性碳，于30的水浴锅中保持0.5h且持续搅拌，然后将此液体用循环水真空泵抽滤得水解蛋白质的清液，即多肽溶液。最后将清液放入真空干燥箱中真空干燥，六小时后得成品。（2） 木瓜蛋白酶最佳酶解时间的确定调节酶作用温度为45，酶作用时间分别为1 h ，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h的条件下，按照（1）的步骤进行多次实验。（3） 木瓜蛋白酶最适用量的确定 调节酶作用温度为45，酶作用时间分别为4 h，加入木瓜蛋白酶的量分别为5500U/g，6000U/g，6500U/g，7000U/g，7500U/g，8000U/g，按照（1）的步骤进行多次实验来测定不同酶用量下所得多肽含量。（4）最适pH值的确定 调节酶作用温度为45，酶作用时间分别为4 h，加入木瓜蛋白酶的量分别为5500U/g，调节pH分别5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，按照（1）的步骤进行多次平行实验。2.花生蛋白制备花生多肽的正交实验通过对影响蛋白提取率的单因素分析，得出如下较优工艺参数范围：pH值6.57.5；加酶量6500U/g7500U/g原料；时间79h；温度为4050。为了得到最佳的浸提效果，以蛋白质水解度为指标，对上述选择范围再进行正交优化实验。2.2.4多肽含量测定（1） 测定波长选择精密量取7的标准蛋白5ml置50 mI量瓶中，用0.9氯化钠溶液稀释至刻度，作为贮备液。取1 ml置测量管中加双缩脲试剂4 ml。取0.9氯化钠液1 ml置空白管中加双缩脲试剂4 ml，两管各自混匀后在30 下保温15min，放置，用自动紫外分光光度计在400700 nm间扫描，在波长540nm处有最大吸收峰.（2） 标准曲线绘制精密量取上述新鲜贮备液(7.0mg/ml )0.1，0.2,0.4,0.8,1.0ml分别加入各测量管中，均加0.9氯化钠液至1m1再加4ml双缩脲试剂，按（1）法测定吸收度。（3） 样品测定精密量取花生蛋白溶液1ml加双缩脲试剂4ml作为测定管，精密量取7标准蛋白0.05m1加0.9氯化钠液0.95 ml，再加4ml双缩脲试剂作为标准管，精密量取0.9氯化钠液1ml加双缩脲试剂4 ml作为空白管。按上法在540nm处测定各管吸收度值，计算多肽含量在0.20以上。多肽含量(gm1)= 7 0.053 结果与讨论3.1酸沉时最适pH值的确定在花生粕制备花生蛋白试验中，用盐酸调节酸沉时上层清液的pH分别为3.51，4.02，4.51，5.00，5.26和6.12，进行5次平行实验，所得结果见表1.表3-1.酸沉最适pH值实验数据Table3-1. Acid pH optimum value of the experimental datapH提取量（g）平均值标准偏差(%)3.511.6501.6581.5891.6641.5641.6254.064.021.7061.7331.6791.7871.6551.7124.574.512.5582.5332.5252.5402.4392.5194.155.002.1122.0982.0362.1752.0492.0944.965.261.4211.3851.3161.3851.4431.3904.316.120.5920.7030.6280.6360.5960.6313.99通过表3-1可以看出在试验过程中随着盐酸的不断加入，pH值不断变小，花生蛋白的提取量的变化趋势为先变大后变小，根据计算出的标准偏差，可以发现pH值为3.51时的标准偏差最小，表明改组数据的误差最小，分散度最低；而pH值为5.00时标准偏差最大，其分散度最高，精确度也最差。观察几组数据的标准偏差我们发现，其误差都在5%以内，说明该表中数据可用，从而便可以考虑pH值对花生蛋白提取率的影响。图3-1.酸沉时pH值对花生蛋白得率的影响Fig3-1Effect of pH of acid extraction solution on peanut protein yield从图3-1中可以看出，pH值从3.51变到4.02的过程中提取率增加缓慢；而当pH值从4.02增加到4.51时，提取率迅速增加，此时花生蛋白提取率最大；当pH值再次逐渐增加时，提取率不断下降，直到pH值为6.12降到降到5组实验中的最低值，由此变化量我们可以看出随着pH值的增加，花生蛋白的提取率先增加后减少，且在pH值从4.55到6.12之间减少得较快。故调节酸沉时的 pH值来沉淀花生粕中蛋白时，pH值应控制在4.414.55之间。检测结果也发现花生蛋白在等电点即4.5时，乳清水中蛋白含量很高，表明花生蛋白中乳清蛋白(等电点不沉淀蛋白)较多。即取酸沉时的最佳pH值为4.5。3. 2 花生粕提取花生蛋白单因素试验分析3.2.1提取时间对花生粕中蛋白提取率的影响实验过程中浸提时间是很重要的因素之一，在不同提取时间的条件下，花生粕溶解于稀碱的程度也不一样，进而使花生蛋白的提取率也不相同，因此我们需要考虑浸提时间的影响才能使试验结果更准确，更有说服性。试验结果见表3-2。表3-2 .最佳提取时间实验数据Table3-2. Experimental data of the best extraction time提取时间（min）提取量（g）平均值标准偏差(%)201.3911.4231.3941.5091.3841.4194.64401.5121.4981.5591.4561.4851.5023.40601.4751.5461.5241.5761.5891.5424.05801.6071.7021.6731.7551.6921.6874.791001.6031.7021.6071.711.6521.6554.531201.4021.5011.5031.4051.4341.4494.47通过表3-2我们可以看到，不同提取时间下花生蛋白的提取量不同，从各组数据的标准偏差，可以发现在各提取时间下标准偏差相差不大，当提取时间为40min时的标准偏差为4.05时最小，表明它的平均值离测量值值最近，精确度最好；而提取时间为80min时标准偏差4.79最大，其分散度最高，也说明该组数据误差很大。每组的标准偏差在5%以内也说明此组实验所得出的数据。花生蛋白提取率计算公式：蛋白质提取率（%）=浸提后蛋白质量（g）/称取的花生粕总量（g）计算出其提取率。提取率和时间的关系见图3-2。图3-2.浸提时间对花生蛋白含量的影响Fig. 3-2Effect of time on the content of peanut protein提取时间主要影响蛋白质溶出率，在一定条件下，时间越长，其溶出率越高。由图3-2我们可以看出，当提取时间由20min延长到40min又延长到60min时，蛋白的提取率也随之由20min时的28.38%增加到40min时的30.04%，然后又增加到60min时的30.84%，这两个过程较缓慢，变化幅度较小；而从60min增加到80min时，变化幅度急剧变大，增加量达到33.74%；随着时间的继续增加到100min时提取率则缓慢降低，而后时间增到120min时提取率又急剧下降为28.98%。从上图我们可以观察出当提取时间达到90 min时，蛋白质的溶出率趋于动态平衡，因此我们可以选择90 min为花生粕提取花生蛋白的最佳提取时间。3.2.2 提取温度对花生粕中蛋白提取率的影响浸提温度不同时所得试验结果见表3-3。表3-3 不同温度下提取花生蛋白实验数据Table 3-3 The experimental data extracted peanut protein of different temperatures温度（） 沉淀量（g） 平均值标准偏差（%）301.0261.1161.0841.1551.1241.1014.38401.111.0831.1091.0471.1711.1044.06501.3931.2931.2951.3961.3481.3054.79601.761.7481.7691.7421.6791.7453.18701.6091.6041.5851.5421.5351.5753.09801.3851.4661.4731.4541.4221.443.26根据表3-3所得实验数据，从各组数据的标准偏差，可以发现当提取温度为70时的标准偏差为仅5.11时最小，表明它的精密度最好，最不分散；而根据提取温度为70时的标准偏差3.09，说明改组数据的误差很小，准确性很高，各测量值都在均值附近波动，相差并不大；提取温度为50时的标准偏差4.79显示出此组数据最不准确，其分散度最高。因为该组数据的标准偏差在正常范围内，便可以这组数据画出提取时间与花生蛋白提取率的关系曲线。图3-3.浸提温度对花生蛋白含量的影响Fig3-3. Effect of temperature on the content of peanut protein提取温度的高低对花生蛋白的溶解度有较大影响，观察图3-3我们可以看出，该曲线刚开始时的变化较缓，即花生蛋白的提取率变化并非很大。当提取温度由30上升到40时，曲线接近于直线，两个温度下的提取率基本相同；当提取温度升高到50时，蛋白的提取率才发生了些许变化，但变化量只有4.02%；提取温度从50变到60时，提取率的变化幅度稍大些，60时提取率最大；之后即使温度在增加，提取率的变化仍然很缓慢，变化幅度也仅从34.9%降到31.5%又降到28.8%。这样的变化是因为在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作用下，蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来。这种凝结是不可逆的，不能再使它们恢复成原来的蛋白质，蛋白质的这种变化叫做变性。蛋白变性会影响产品的功能性，而且黏度增加，分离困难，萃取耗能也增加。为了避免蛋白质在过高的温度下发生变性，因此通过以上分析我们可以选择60为花生粕提取花生蛋白的最佳提取温度。3.2.3料液比对花生粕蛋白提取率的影响制备花生蛋白过程中，所加液体多少会使花生粕粉末溶解状况不同，因此我们需要在不同料液比的条件下进行试验，而且多次进行，这样可使我们能得到更加准确的数据，试验所得结果见表3-4。表3-4不同料液比时提取花生蛋白实验数据Table3-4 The experimental data extracted peanut protein of different proportions of stuff and solvent料液比(g/ml)沉淀量（g）平均值标准偏差(%)1:101.241.2491.1961.2781.3031.2553.621:201.4551.5331.5571.4611.5341.5084.181:301.481.431.5261.4781.4761.4783.041:401.4091.3771.451.4461.3631.4093.521:501.4051.3581.411.4571.411.4083.141:601.3831.3151.4211.3871.4291.3874.03利用表3-4所得数据，从标准偏差的数值可以看出各组实验所得数据的变化情况及波动大小都在5%以内，表明这组实验数据可用于下面的进一步计算中。表3-4的数据中，料液比为1：20时数据最不准确，标准偏差最大，最分散。应用蛋白提取率公式可以计算出提取率，它和料液比的关系见下图。图3-4.料液比对花生蛋白提取率的影响Fig. 3-4Effect of proportion of stuff and solvent on the content of peanut protein加水量越多，蛋白质的溶出率和提取效率越高，但如果加水量过大，酸沉时乳清液中溶解的球蛋白量增加，蛋白的损失量也增加，成品的得率反而下降，设备投资加大，且分离时间长，从经济角度考虑不适用。若加水量过少，大豆蛋白的溶出率大大下降，成品的得率也减少。观察图3-4我们可以看出，刚开始时当料液比由1：10增加到1：20的过程中，蛋白质的提取率增加趋势较明显，由25.09%变化到30.15%；在图3-4中，当料液比为1：20时提取率最高，随着料液比的继续增加，提取率逐渐下降，下降趋势较平缓；当料液比由1：50增加到1：60时，下降趋势显著。因此提取花生粕中花生蛋白的最佳固液比为1：20。3.2.4 NaOH溶液浓度对花生粕中蛋白提取率的影响在制备花生蛋白过程中，碱的浓度不宜过大，因此我们应该选择稀碱进性试验，这样可以得到较优质蛋白。实验结果列于表3-5中。表3-5不同NaOH溶液浓度提取花生蛋白数据Table3-5 The experimental data extracted peanut protein of different concentrations of NaOH solutionNaOH浓度（mol/l)沉淀量（g）平均值标准偏差(%)0.30.7380.7770.8050.6800.7900.7584.490.40.9500.8830.8941.0030.9030.9234.450.50.9700.8920.9151.0160.9290.9184.520.60.9090.9800.9910.