（微生物学专业论文）副干酪乳杆菌素抑菌活性及抑菌机理的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 本文以副干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e ih d l 7 ) 的发酵液为原料，采用 提取、分离纯化技术，得到副干酪乳杆菌素粗提物，并对其抑菌活性及抑菌机理 进行了系统的研究。为新型乳酸菌素的开发以及作为天然食品防腐剂的应用提供 了理论基础，相信在不久的将来副干酪乳杆菌素一定能成为一种理想的天然食品 防腐剂。 副干酪乳杆菌素是一种由三6 p a r c a s e l l - i d l 7 分泌的一种抗菌小分子热稳定肽， 可以抑制食品中常见的腐败菌。本论文对副干酪乳杆菌素抑制腐败菌的活性及其 抑菌机理进行的初步研究，得出以下主要结果： 副干酪乳杆菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有明显的抑制作用，抑菌 谱广。液体倍比稀释法测定结果表明，副干酪乳杆菌素对革兰氏阳性菌金黄色葡 萄球菌的最小抑菌浓度( m i c ) 和最小杀菌浓度( m b c ) 为7 7 5 i u f m l ；而对革兰 氏阴性菌大肠杆菌的m i c 为1 5 5i u 1 l 和m b c 为3 1 0n i m i ，。 本文研究了p h 值、温度、金属离子对副干酪乳杆菌素抑菌活性的影响，结果 表明：当p h 为3 o 时，副干酪乳杆菌素的抑菌效果最佳；当p h 为6 0 时其抑菌活 性明显下降。副干酪乳杆菌素对温度有很好的耐受性，经1 2 1 处理3 0 分钟后， 副干酪乳杆菌素对两种指示菌的抑菌率仍达7 8 以上。随着金属离子浓度的增加， n a + ，k + 一价金属离子对副干酪乳杆菌素的抑菌作用较小，既不促进也不抑制； m 9 2 + , c a 2 + 二价金属离子对副干酪乳杆菌素抑菌作用较大，抑制了副干酪乳杆菌素 的抑菌活性；而f e 3 + a 1 3 + 三价金属离子对副干酪乳杆菌素的抑茵作用是先促进后抑 制。 电导率法结果表明，副干酪乳杆菌素显著提高指示菌细胞膜的通透性。当以 大肠杆菌为指示菌时，6 h 后1 5 5 i u m l 细菌素组相对渗透率为6 4 4 5 ，比对照组 增加5 2 5 1 。当以金黄色葡萄球菌为指示菌时，6 h 后7 7 5 i u m l 细菌素组对渗透 率为7 5 3 2 ，比对照组增加7 2 1 9 。这种变化表明副干酪乳杆菌素影响了菌体细 黑龙江大学硕士学位论文 胞质膜选择通透性，导致胞内电解质不断外渗，并随着时间的延长，胞内电解质 相对外渗率不断增大，可能引起质子动力势的耗散，导致细胞死亡。 荧光染色法结果表明，副干酪乳杆菌素处理的大肠杆菌，随着时间的延长， f d a 荧光强度逐渐下降，在4 5 h 之后，f d a 的下降趋于稳定。大肠杆菌在0 5 1 h 内，活菌数减少了1 8 3 ；在1 5 h 内，活菌数下降了4 1 5 5 ，这证实了副干酪乳 杆菌素使大肠杆菌细胞膜通透性增加，破坏了细胞膜的保护功能，从而抑制大肠 杆菌的生长。副干酪乳杆菌素对金黄色葡萄球菌处理o 5 h 后，f d a 荧光强度明显 下降，在1 5 h 内，荧光强度下降缓慢。金黄色葡萄球菌在0 5 1 h 内的活菌数减少 了1 4 1 ，在1 5 h 内，活菌数下降了6 0 6 7 ，证实了副干酪乳杆菌素对金黄色葡 萄球的杀菌效果。以上结果说明，副干酪乳杆菌素对金黄色葡萄球菌的作用时间 短，破坏了细胞膜的完整性，荧光染剂从胞浆中外漏，导致细胞死亡。 副干酪乳杆菌素对指示菌胞内核酸蛋白类物质泄漏的影响结果表明，副干酪 乳杆菌素处理大肠杆菌3 h 后，核酸类物质泄漏明显增加；6 h 后有部分蛋白质类物 质泄漏，说明该细菌素对其造成一定的伤害，导致核酸蛋白质类物质的部分外泄。 副干酩乳杆菌素处理金黄色葡萄球菌3 h 后，核酸、蛋白质物质泄漏均明显增加， 随时间的延长，量还在增加；以上说明该细菌素对金黄色葡萄球菌的损伤较严重， 可能在其细胞膜上形成了孔洞，导致细胞内容物泄漏，细胞死亡。 关键词：副干酪乳杆菌素；抑菌活性；影响因素；抑菌机理 a b s t r a c t a b s t r a c t a n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c et h a tw a sp r o d u c e df r o mf e r m e n t a t i o no fl a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e ih d 1 7b ye x t r a c t i o n ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n t h ea n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c ew a s b a c t e r i o c i nt h a tw a ss t u d i e ds y s t e m a t i c a l l ya ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n da n t i b a c t e r i a l m e c h a n i s mi nt h i sw o r k t h er e s u l t so f f e r e dat h e o r e t i c a lb a s ef o rt h ed e v e l o p m e n ta n d u l t i l i z a t i o no fb a c t e r i o c i na sak i n do fn a t u r a lf o o dp r e s e r v a t i v eo fa n t i b a c t e r i a l b a c t e r i o c i n i ti sb e l i e v e dt h a tt h ea p p l i c a t i o no fb a c t e r i o c i no fl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e i h d l 7a sak i n do fn a t u r a lf o o dp r e s e r v a t i v ew i l lb ev e r yb r o a d l yi nt h ef u t u r e t h eb a c t e r i o c i no fl b p a r c a s e i h d1 7 p r o d u c e db yl b p a r c a s e z i - t d1 7 i sas m a l l h e a t s t a b l ep e p t i d ew h i c hc a ni n h i b i t s p o i l a g em i c r o o r g a n i s m si nf o o d r e c e n t l y , a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m so fl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nw a st h a ti tc a nm a k e s e n s i t i v ec e l l sd e a t hb ya f f e c t i n gt h ec y t o p l a s m i cm e m b r a b , e i nt h i sw o r k , a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t ya n dm o d eo fa c t i o no fl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i na g a i n s ts p o i l a g e m i c r o o r g a n i s m sw e r es t u d i e da n dm a j o rf i n d i n g sw e r el i s t e da sf o l l o w s ： t h er e s u l t ss h o w e db a c t e r i o c i no fl b p a r c a s e i h d1 7h a do b v i o u sa c t i o ni n a n t i b a c t e r i a lu p o ng r a m n e g a t i v eb a c t e r i aa n dg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a , a n da n t i b a c t e r i a l s p e c t r u mw a sw i d e t h em i c r o d i l u t i o nb r o t hm e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n et h e m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) a n dt h em i n i m u mb a c t e r i c i d a lc o n c e n t r a t i o n ( m b c ) o f t h eb a c t e r i o c i n t os t a p h y l o c o c c u sa u r e u so fg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a , t h em i c a n dm b co fb a c t e r i o c i nw e r e7 7 5 i u m l ；t oe s c h e r i c h i ac o i lt h em i ca n dm b co f b a c t e r i o c i nw e r e15 5i u m la n d310i u m l i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ee f f e c t so fp hv a l u e ，t e m p e r a t u r e ，a n dm e t a li o no n b a c t e r i o c i no f 三6 p a r c a s e i h d1 7a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h eb a c t e r i o c i nw a st h eb e s tw h e np hv a l u e sw a s 3 0 ；w h i l ep hv a l u e sw a sa d j u s t e dt o6 0 ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h eb a c t e r i o c i nw a s i i i 黑龙江大学硕士学位论文 g r e a t l yr e d u c e d t h eb a c t e x i o c i nh a dag o o de n d u r a n c et ot e m p e r a t u r e w h e nt h e s t a p h y i o c o c c u sa u r e u sa n de s c h e r i c h i ac o l iw e r et r e a t e db yb a c t e r i o c i na t121 f o r 3 0 m i n ，t h ea n t i b a c t e r i a lr a t i ow a s7 8 t h ee f f e c to fn a + ，k + o na c t i v i t yw a sal i u l e a l o n gw i t hi o nc o n c e n t r a t i o n t h eb a c t e r i o c i nw a sn o to n l yp r o m o t e db u ta l s oi n h i b i t e d ； t h ee f f e c to fm 9 2 + , c a 2 + o na c t i v i t yw e r ei n h i b i t e dv e r ys t r o n g l y ；t h ee f f e c to ff e 3 + 瑚3 + o na c t i v i t yp r o m o t e dg r o w t ha tf i r s t ，a n dt h e ni n h i b i t e dg r o w t ha tl a s t l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nc a ni n c r e a s et h ec e l lm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y o fe s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb ye l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t ym e t h o d w h e n e s c h e r i c h i ac o l iw e r et r e a t e db yl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i n ( 15 5 i u m l ) f o r6 h ，t h er e l a t i v es e e p a g e v i t yr a t i ow a s6 4 4 5 ，a n da tt h es a m et i m et h ep e r m e a b i l i t y c h a n g ew a s5 2 51 w h e ns t a p h y l o c o c c u s a u r e u sw e r et r e a t e db yb a c t e r i o c i n ( 7 7 5 i u m l ) f o r6l l ，t h er e l a t i v es e e p a g e v i t yr a t i ow a s7 5 3 2 ，a n da tt h es a m et i m et h e p e r m e a b i l i t yc h a n g ew a s7 2 19 t h er e s u l ts h o w e dt h em e m b r a n ep e r m e a b i l i t yw a s a f f e c t e db yt h eb a c t e r i o c i n t 1 1 er e l a t i v es e e p a g e v i t yr a t i oo fm e m b r a n eo b v i o u s l y a s c e n d sw h i c hr e s u l t e di nt h ed i s s i p a t i o no ft h ep r o t o nm o t i v ef o r c e ( p m f ) a n di n d u c e d t h ec e l l sd e a t h t h er e s u l t si n d i c a t et h a tf l u o r e s c e n tp r o b ei sf e a s i b l ei nt h ed e t e r m i n a t i o no ft h e a l t e r a t i o no fe s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s w h e ne s c h e r i c h i ac o l iw e r e t r e a t e db yl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nf o r4 5 h ，f l u r e s c e n ti n t e n s i t yo ff d a d e c l i n e dg r a d u a l l y 、析t l lt h ei n c r e a s eo ft i m e t h en u m b e ro f l i v i n ge s c h e r i c h i ac o l iw a s l e s st h a nt h ec o n t r o la b o u t1 8 3 f r o m0 5 ht olh t h er e l a t i v ei n c r e a s i n gr a t i ow a s 4 1 5 5 f r o ml ht o5 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nc a n i n c r e a s et h ec e l lm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yo fe s c h e r i c h i ac o l i ，b r e a kt h ec e l lm e m b r a n e a n di n h i b i tt h eg r o w t ho fe s c h e r i c h i ac o l i w h e ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw e r et r e a t e db y l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nf o r0 5 h ，f l u r e s c e n ti n t e n s i t yo ff d ad e c l i n e d s t r o n g l y w h e ns t a p h y l o c o c c u s a u r e u sw e r et r e a t e db yl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e i b a c t e r i o c i nf r o mlht o5 h ，f l u r e s c e n ti n t e n s i t yo ff d ad e c l i n e d g r a d u a l l yw i t l lt h e 一 a b s t r a c t i n c r e a s eo ft i m e t h en u m b e ro fl i v i n gs t a p h y l o c o c c u sa u g e t l 哼w a sl e s st h a nt h ec o n t r o l a b o u t14 1 f r o m0 5 ht olh t h er e l a t i v ei n c r e a s i n gr a t i ow a s6 0 6 7 f r o mlht o5 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nc a n q u i c k l y k i l l s t a p h y l o c o c c u s a u r e u sb yb r e a kt h ec e l lm e m b r a n ew i t ht h ef l u o r e s c e n t p r o b e p e n e t r a t i n gt ot h eo u t s i d e t h e l e a k a g eo f n u c l e i ca c i da n db i gp r o t e i nf r o mc e l l so fd e t e r m i n a t i o nt h a tt u r n e d o u tal a r g en u c l e i ca c i do b v i o u s l ya s c e n d e dw h e ne s c h e r i c h i ac o l iw e r et r e a t e db y l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i nf o r3 h , a n dt h e nb i gp r o t e i na s c e n d e da f t e r6 h t h e r e s u l ts h o w e de s c h e r i c h i ac o l iw e r ed a m a g e db yb a c t e r i o c i nf o rt h el e a k a g eo fn u c l e i c a c i da n db i gp r o t e i np a r t l y i tw a si n c r e a s i n go ft h el e a k a g eo fn u c l e i ca c i da n db i g p r o t e i nf r o ms t a p h y l o c o c c u sa u r e u st r e a t e db yb a c t e r i o c i na t3hl a t e r t h er e s u l t s h o w e ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw e r eb r o k e ns t r o n g l yb yb a c t e r i o c i n t h e r ew o u l db ea p o r eo nt h ec e l lm e m b r a n eo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，w h i c he n s u r e dk i l l i n go ft a r g e t b a c t e r i a k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ib a c t e r i o c i n ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；e f f e c t i n g f a c t o r ；a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m v 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特j l , 1 ) j l l 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉江太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：讳诫武 签字日期训髫年石月纽日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉迤太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉婆态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：醉栽式 导师签名： 辩少 签字日期：捌年月，z 日签字日期：娜年月俚e t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章前言 1 1 立题背景 第1 章前言 随着经济与社会的发展，人们的生活节奏加快，生活水平不断提高，对食品 提出了更高的要求。近年来，食品安全已成为全球关心的问题。来自美国疾病控 制和预防中心截止2 0 0 6 年报道显示：在美国每年有76 0 0 万有关食品腐败引起疾 病的案例，导致了50 0 0 人死亡。e s c h e r i c h i ac o l i 0 1 5 7 ：h 7 ，l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ， s a l m o n e l l a s p s t a p h y l o c o c c u sa u g e t t s 和t o x o p l a s m ag o n d i i 等腐败菌所引发的疾病 导致了6 5 3 4 9 亿美元的经济损失i l 】。 我国的微生物污染情况更为严重每年仅果蔬腐败一项引起的损失就达到 7 5 0 亿元，卫生部对1 3 个省市1 0 年的监测结果也显示，微生物引起的食物中毒最 多，占总事件的8 0 1 2 l 。 防止食品腐败变质，延长食品货架期的主要方法是添加食品防腐剂。食品防 腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂。目前我国大量使用的还是苯甲酸及其盐、 山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类等化学合成防腐剂 3 1 。由于化学合成防腐剂或多 或少对人体产生一定毒害作用，因此，近年来天然防腐剂的开发受到广泛的重视。 天然防腐剂具有化学合成防腐剂无法比拟的优点，如：抗菌性强、安全无毒、水 溶性好、热稳定性好、作用范围广等1 4 1 。因此，寻求广谱、高效、无毒、天然的食 品防腐剂是目前食品科学研究中的热点之一。 乳酸菌( 1 a c t i ca c i db a c t e r i al a b ) 是一类能从可发酵碳水化合物( 主要 指葡萄糖) 产生大量乳酸的细菌的统称。长期以来，乳酸菌广泛地应用于乳制品、 蔬菜及肉制品的发酵和防腐中f 5 】。乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双 乙酰等多种天然抑菌物质，具有维持肠道内菌群平衡，提高免疫力，促进营养物 质吸收等多种功能。 乳酸菌产生的抑菌活性代谢产物乳酸菌素，是目前公认的一种具有潜在开发 价值的天然生物性食品防腐剂。乳酸菌素可以抑制食品中的致病菌和腐败菌，包 黑龙江大学硕士学位论文 括蜡状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生利斯特氏菌、 金黄色葡萄球菌等。 乳酸菌素一般是带正电荷的小分子蛋白( 3 0 6 0 个氨基酸残基) ，大部分乳 酸菌素对热稳定、具有高等电点和亲水特性，可以在食品加热时使用、减少加热 时间、节省食品加工过程中的能耗，降低营养成分的破坏程度。乳酸菌代谢产生 的乳酸菌素种类繁多，大部分基因位于质粒上，含有修饰氨基酸，是蛋白质工程、 分子遗传、基因工程改造的好材料。很多乳酸菌素能抑制大量食品腐败菌和致病 菌，呈现不可逆的杀菌作用，并具有皮肤保健、治疗口腔炎症、调节肠道菌群等 功效嘲。 我国是一个乳酸菌资源丰富的国家，但对乳酸菌素的研究起步较晚，除n i s i n 外，新型乳酸菌素的大规模生产和在食品工业上的应用，还面临以下困难：1 ) 大 多数乳酸菌素抑菌谱较窄，作用不广泛；2 ) 有些乳酸菌素的产量较少，且抑菌活 性不稳定；3 ) 大部分乳酸菌素的抑菌机理还不清楚；4 ) 还需要相关的试验来证 明乳酸菌素应用于人的食品中是否安全，无毒，易被分解。 因此，大力进行乳酸菌素的研究尤其是抑菌活性及抑菌机理等方面的基础研 究，不仅具有重要的理论意义，而且具有广阔的应用前景。相信不久的将来副干 酪乳杆菌素定能成为一类具有广阔开发应用前景的天然食品防腐剂，将对人类的 健康发挥巨大作用。 1 2 乳杆菌素简介 1 2 1 乳酸菌素的定义 细菌素( b a c t e r i o c i n ) 是19 2 5 年g r a t i a 等对一种大肠杆菌菌株抑制其它菌株现 象研究时发现的，以后f r e d e r i c q 把这株大肠杆菌产生的抑菌物质称为大肠杆菌素 ( c o l i c i n s ) 1 6 1 。后来由于许多细菌能够产生类似的物质，j o c o b 将细菌产生的基因编 码的抗菌肽定名为细菌素c o a e t e r i o e i n ) 1 7 1 但到目前为止，乳酸菌素的定义尚无定 论，结合前人的观点得出以下共识：由乳酸菌产生的细菌素称为乳酸菌素，其为 第1 章前言 乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多 肽或前体多肽；这些物质可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物；所 有产生乳酸菌素的乳酸菌都存在特异性免疫基因，产生的乳酸菌素不会对产生茵 本身造成伤害【8 】。此外，乳酸菌素能够在胃肠道内降解，因而是无毒的。 1 2 2 乳酸菌素的分类 随着乳酸菌细菌素研究的深入，不断分离和鉴定出新的乳酸菌细菌素，所以 其分类也在不断变化，基于它们的组成、大小、热稳定性、作用方式、输出机制 和抑菌谱的不同，将乳酸菌产生的细菌素分为三类、四类或五类【9 1 0 1 1 1 。 1 2 2 1 根据乳酸菌的种属不同而将其所产的细菌素分为6 类 ( 1 ) 乳球菌属细菌素，包括双球菌素( d i p l o c o c c i n ) 、乳球菌素( 1 a c t o e o c c i n ) 、乳链 菌素( 1 a c t i c i n ) 、乳链菌肽( n i s i n ) 。 ( 2 ) 片球菌属细菌素，已报道的有a c h ，p a - 1 , a ( p e d i o c i n a c h , p e d i o e i n p a 1 ，p e d i o e i na ) 及由e c e r e v e s i a ef b b 6 3 和e a c i d l a c t i c i p c 产生的2 种未命名的细 菌素。它们均由片球菌属中的乳酸片球菌( a c i d i l a c t i e i ) 、戊糖片球菌( p p e n t o s a c e u s ) 和啤酒片球菌( p c e r e v i s i a ) 产生【1 2 1 。 ( 3 ) 明串珠菌属细菌素，已报道的有m e s e n t e r o c i n 5 ，l e u c o c i n a ，i e u c i n o c i n s 和 c a r n o c i n ，但只是一般性的描述，缺乏完整的生化遗传特性。 ( 4 ) 肉食杆菌属细菌素，已报道的有c a r n o b a c t e r i o c i n a l ， c a r n o b a c t e r i o c i n a ，c a m o b a c t e r i o c i n a 3 ，c a m o c i n u l 4 9 ，c a m o b a c t e r i o c i n b l ，c a m o b a c t e r i o c i n b z 及由c p i s c i c o l a l k s 产生的一种未命名的细菌素，但都缺乏详细的资料报道。 ( 5 ) - 孚l 杆菌属细菌素，包括p l a n t a r i c i n a ，b ，c ；p l a n t a r i c i n b n ；s a k a c i n a , m , p ； l a c t o c i n s ，b a v a r a c i n m n ，f e r m e n t i c i n ，l a c t a c i n f , l a c t a c i n b 等近2 0 种。 ( 6 ) 其它乳酸菌细菌素，嗜热链球菌代谢产生的物质具有抗烟曲霉、寄生曲霉 和根霉等真核生物的能力。c a s a u s 等报道e n t e r o c o c c u s f a e c i u mt 1 3 6 菌株可同时产 生肠菌素a ，b ( e n t e r o c i n a ，b ) t 1 3 1 。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 2 2 基于分子量、热敏感性和是否含修饰性氨基酸，将乳酸菌素大致分为4 类 ( 1 ) 羊毛硫抗生素( l a n t i b i o t i c s ) 分子量通常小于5 k d a ，显著特点是有诸如羊毛硫氨酸( 1 a n t h i o n i n e ) 、d 甲基 羊毛硫氨酸( 1 3 - m e t h y l l a n t h i o n i n e ) 、脱氢丙氨酸( d e h y d r o a l a n i n e ，d h a ) 和脱氢丁氨 酸( d e h y d r o b u t y r i n e ，d n b ) 等稀有氨基酸【1 4 , 1 5 1 。羊毛硫抗生素又分两类：a 类是长 的、两亲性的多肽，带有正电荷，包括n i s i n ，l a c t i c i n4 8 1 等。b 型细菌素是球型多 肽，不带电荷或带负电荷，包括m e r s a c i d i n ，a c t a g a r d i n e 等。l a c t i c i n3 1 4 7 ，l a c t i c i nj 4 9 ， p l a n t a r i c i nc ，l a c t o c i ns ，c y t o l y s i n 也属于羊毛硫抗生素，其中l a c t i c i n3 1 4 7 和 c y t o l y s i n 是二肽细菌素【1 6 1 。 ( 2 ) 小分子热稳定肽( s 舱llh e a t - s t a b l ep e p t i d e ，s h s p ) 分子量小于1 0 k d a ，对热稳定，有疏水和亲水脂区域。通常为阳离子的，进行 翻译后修饰，如n 一端前导肽或者信号肽序列的切除和二硫键的形成，不含有翻译 后修饰氨基酸残基如羊毛硫氨基酸。 小分子热稳定肽可以分为以下4 个亚类： i ia 类：该亚类含有3 7 4 8 个氨基酸，序列相似性为4 0 6 0 ，具有抗李斯特杆 菌的活性。这些肽链可大致分为两个区：n 一端高保守区和c 一端低保守区【1 7 1 ，成熟 细菌素n 末端氨基酸序列为t y r - g l y a s n - g l y - v a l ，并有两个半胱氨酸构成的s s 桥 【1 8 】。该类乳酸菌素包括：p e d i o c i np a 一1 ，p e d i o c i n a c h 1 9 2 0 1 ，l e u c o c i i l a 【2 l 】，m e s e n t e r i c i n y 1 0 5 2 2 ，c a m o b a c t e r i o c i n a 、b m l 和b 2 t 2 3 1 ，s a c k c i n a l 2 4 ，s a k a c i np 【2 5 】，e n t e r o c i l l a l 2 6 】。 i ib 类：该亚类为双组分细菌素，由两个肽类寡聚体形成。又可分为两类： 第一类双肽细菌素的每一个多肽都有活性，但多肽联合会增强它的活性；另一类 型是活性依赖于两个多肽，任何一个单独多肽都没有活性。l a c t a c i nf 是前者的代 表，l a c t o c o c c i ng 则属于后一种。其他双组分乳酸菌素包括：e n t e r o c i n1 0 7 1 ， e n t e r o c i nl 5 0 ，l a c t o c i n7 0 5 ，t h e r m o p h i l i n13 ，l a c t o c o c c i nm n ，l e u c o c i nh ，p l a n t a r i c i n w ，p l a n t a r i c i ns ，p l a n t a r i c i ne f , p l a n t a r i c i nj k ，b r o c h o c i nc ，m u t a c i ni v ， s t a p h y l o c o c c i nc 5 5 t 2 7 1 。 i ic 类：此类细菌素属于分泌依赖型细菌素，该类细菌素前体n 端为信号肽 第1 章前言 序列，通过g s p 机制转运，包括d i v e r g i c i na 2 8 1 。 i id 类：此类细菌素包括不属于上述任何一类的其它细菌素且分泌不需要前导 肽或者信号肽，例如e n t e r o e i n sl 5 0 ( e n t l5 0 a ，e n t l5 0 b ) 1 2 9 , 3 0 1 。 ( 3 ) 大分子热敏感蛋白质( 1 a r g eh e a tl a b i l ep r o t e i n ，l h l p ) 这类细菌素分子量通常大于3 0 k d a ，对热不稳定，1 0 0 。c 或更低温度下3 0 s 即 丧失活性，抑菌谱一般较窄。属于该类细菌素的有h e l v e t i e i nj f 3 ， c a s e i c i n8 0 t 3 2 1 ， l a c t o e o c e i nm m t 0 5 1 3 3 】等。 ( 4 ) 复合细菌素 复合细菌素，其活性除需要蛋白部分外还需要其他化学成分，如：类脂和碳水 化合物等，脂酶和淀粉酶的作用能使之失活。此类细菌素包括：l a c t o e i n2 7 t 3 4 1 ， l e u c o c i ns 3 s ，m e s e n t e r o c i n 5 2 【3 6 】等。 1 3 乳酸菌素的抑菌活性 1 3 1 乳酸菌素对食品腐败菌的抑菌活性 乳酸菌素在人工培养基上可以抑制来源于乳制品、肉制品、蔬菜等不同食品 微生物的生长。r a y m a n 等提出n i s i n 可作为腌制肉制品中硝酸盐的替代剂或佐剂， 以减少或避免亚硝胺类物质对人体健康的威胁。据袁秋萍的试验，按传统工艺制作 的香肠，亚硝酸盐的添加量为0 1 5g l 【g ，经检测菌落总数为1 2 0 0 0c f u g ，若添加n i s i n 0 2g k 岛亚硝酸盐的添加量减少到0 0 4g l 【g ，则香肠中的菌落总数降低到3 2 0 0c f u g ， 抑菌效果明显，而且香肠的色、香、味没有明显的变化【了7 1 。 由于n i s i n 在肉制品防腐中的局限性，研究人员将目光投向其他的细菌素 l e u c o c i na ，e n t e r o c i n s , k a c i n s ，c a r n o b a c t e r i c i n s 等，经过比较确定在肉制品中抑菌效果 最好的是p e d i o c i np a 1 ( 和p e d i o c i n a c h 具有相似的氨基酸序列) ，p e d i o c i np a 1 对肉 制品中的腐败菌，如单核增生李斯特菌、弯曲乳杆菌具有较好的抑制作用。有报道 说p e d i o c i np a 1 ( a c h ) 比较适合用于鸡肉中来抑制李斯特菌，使用2 4 0 0a u g 的 p e d i o c i n ，在5 c 保存2 8d 后，鸡肉中李斯特菌下降到2 8l o g ( c f u g ) ，而对照组菌落数 黑龙江大学硕士学位论文 是8 1 l o g ( c f u g ) 。 r s c l m e i d e r 等从新鲜肉中分离到一株产p c d i o c i n 的细菌p e d i o c o c c u sp a r v u l u s 1 3 3 并对它作了部分性能研究，这种细菌所产细菌素的抗菌谱相对较窄，但具有较高 的抗李斯特菌活性，而且具有较高的耐热性能，1 2 1 处理后仍有活性，此菌产生的细 菌素n 端的1 7 个氨基酸与报道的p e d i o e i na 1 ( a c h ) 的氨基酸具有同源性【3 8 】。mj c o v e n t r y 等对由p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c ip 0 2 分泌的细菌素p e d i o c i np 0 2 进行了研究， 并比较了其与n i s i n 作为肉制品防腐剂的性能，结果同样显示它的抑菌谱较n i s i n 窄， 但对李斯特菌有较强的抑制能力，两者对革兰阴性菌均无抗性1 3 9 1 。r o s a l i n d au r s o 等 在自然发酵香肠中筛选到一株沙克乳杆菌l a c t i c b a c t e r i as a k e i , 该菌株能产细菌素 s a k a c i np ；对它进行定性分析，结果表明此细菌素不但能较好地抑制香肠中的肠球菌， 而且对香肠的风味没有不良影响1 4 0 1 。 近年来有研究者发现- 孚l s d 品丙酸杆菌代谢还合成一种重要的多肽或蛋白质， 称之为丙酸杆菌细菌素，它能抑制乳制品中革兰氏阴性菌的生长并杀死乳品中的 霉菌和酵母，从而抑制乳制品酸败。丙酸杆菌素s m l 是詹氏丙酸杆菌产生的一种 细菌素，从瑞士生乳中分离得到，具有抑菌作用，于3 0 可保持2 周，4 c 冷藏至 少保存半年，强抗真菌，对该种其它菌有杀菌或轻微抑制作用1 4 l 】。 1 3 2 乳酸菌素对人体及其它动物致病菌的抑菌活性 k a n o l q ) o m 等人从