（食品科学专业论文）谷胱甘肽纳米脂质体的研制.pdf

摘要 摘要 谷胱甘肽( g s h ) 是一种生物活性三肽，在生物体内具有多种重要的生理功能，在 食品工业、临床医药及有关生物研究领域都有着广泛的用途。但g s h 易氧化，货架期 短，不易透过细胞膜，这些因素限制了它的应用。因此，本论文对g s h 的纳米脂质体 和前体脂质体的制备进行了研究，旨在提高谷胱甘肽的稳定性、保持其功效。 本论文首先探讨了制备g s h 纳米脂质体的可行性。研究结果显示，g s h 在酸性的 正辛醇水的体系中分配系数均远远小于0 3 ，水溶性好；脂质体膜材( 卵磷脂、胆固醇 和吐温8 0 ) 以及制备工艺过程( 旋转蒸发、p h 的调节和超声乳化) 对g s h 的稳定性影 响较小，不会引起g s h 失活。因此，脂质体可以用来包埋谷胱甘肽。 本研究采用凝胶过滤法来分离脂质体和游离的g s h ，以0 0 5 m o l l d p b s ( o 5 m o l l 4 n a c l ) 为洗脱剂，不同浓度的g s h 溶液经凝胶柱分离后平均回收率可达9 4 o 。 选择了p h 梯度法、反相蒸发法、乙醇注入法和乙醚注入法来制备g s h 脂质体，以 包封率、粒径、多分散性指数( p d i ) 以及贮藏稳定性为指标，对这四种方法进行了比 较。综合考虑，确定采用p h 梯度法制备g s h 脂质体。 p h 梯度法制备g s h 纳米脂质体的最佳工艺条件和配方为：g s h 载量( w w ) 为 2 5 ，胆固醇卵磷脂( w 厂w ) 为0 2 5 1 ，吐温8 0 卵磷脂( w w ) 为o 5 1 ，乙醚柠檬 酸缓冲液( v v ) 为3 1 ，p h 梯度范围为p h 3 6 ，水合温度为4 0 ，水合时间为3 0 m i n ， 超声强度为2 0 0 w ，超声时间为5 m i n 。制备得到的g s h 脂质体的包封率为9 0 3 ，平 均粒径为1 0 2 1 n m ，p d i 为0 0 3 1 ，微观形态良好，囊泡分散均匀。然后考察了g s h 脂 质体在不同贮藏条件下的物理化学稳定性。结果表明，温度对脂质体的稳定性影响很大， 4 条件下贮藏的脂质体的稳定性较好。 对制备g s h 前体脂质体所用的冻干保护剂进行了筛选，结果表明，在七种保护剂 中，甘露醇的保护效果最好。甘露醇与磷脂质量比为1 5 1 时，制得的g s h 前体脂质体 颜色均匀，结构致密，形态饱满，复水后包封率为8 5 4 ，保留率达到了8 8 1 ，粒径 为4 6 9 9 n m 。f t i r 红外光谱分析显示甘露醇对脂质体膜的完整性起到了保护作用。g s h 前体脂质体经2 0 。c 和4 0 。c 下储藏3 0 天后，粒径、包封率、p h 值、丙二醛含量( m d a ) 等均未发生显著的变化，储藏稳定性较好，说明了将脂质体制备成前体脂质体提高了脂 质体的稳定性。吸湿平衡试验结果表明，较低湿度对g s h 前体脂质体的稳定性影响很 小，脂质体稳定；高湿环境对前体脂质体的稳定性影响较大。因此，脂质体冻干粉应储 藏于干燥或低湿的环境中。 关键词：谷胱甘肽纳米脂质体p h 梯度法包封率 前体脂质体 a b s t r a c t ab s t r a c t g l u t a t h i o n e ( g s h ) ，ab i o a c t i v et h r e e - p e p t i d e ，w h i c hh a sb r o a da p p l i c a t i o ni n f o o d i n d u s t r y , c l i n i c a lm e d i c i n e a n db i o l o g y r e l a t e da r e a s ，s h o w sm i s c e l l a n e o u s b i o l o g i c a l f u n c t i o n si nv i v o h o w e v e r , g s hi se a s yt oo x i d i z ea n dh a r dt og ot h r o u g ht h ec e l lm e m b r a n e ， w h i c hl i m i ti t sa p p l i c a t i o ng r e a t l y i no r d e rt oi m p r o v et h es t a b i l i t ya n de x t e n dt h es h e l fl i f eo f g s h ，t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so fg s hn a n o - l i p o s o m ea n dp r o - l i p o s o m ew e r es t u d i e di nt h i s p a p e r f i r s t l y , t h ep r e p a r a t i o nf e a s i b i l i t yo fg s hn a n o l i p o s o m ew a ss t u d i e d g s hs h o w e d g o o ds o l u b i l i t yi nw a t e r , f o rt h ea p p a r e n tp a r t i t i o nc o e f f i c i e n to fg s h i na c i d i f i e dn o c t a n o l w a t e rs y s t e mw a sf a rl e s st h a n - 0 3 t h em e m b r a n em a t e r i a lo fl i p o s o m e ( p h o s p h o l i p i d ，c h o l e s t e r o la n dt w e e n8 0 ) a n dt h e l i p o s o m ep r e p a r i n gp r o c e s s ( r o t a t o r ye v a p o r a t i o n ，p ha d j u s t i n ga n ds o n i c a t i o n ) s h o w e dl i t t l e i n f l u e n c eo nt h es t a b i l i t ya n da c t i v i t yo fg s h t h e r e f o r e ，l i p o s o m ec o u l db eu s e dt oe n t r a p g s h i no r d e rt od e t e r m i n ee n t r a p m e n te f f i c i e n c y , g e lf i l t r a t i o nw a su s e dt os e p a r a t eg s h l i p o s o m ef r o mf r e eg s h t h ea v e r a g er e c o v e r yo fg s h w i mt h eg s hs o l u t i o n so fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n sw a sa b o u t9 4 0 w i t ho 0 5 m o l l 。1 p b s ( c o n t a i n e d0 5 m o l l 。1n a c l ) a se l u t i n g r e a g e n t f o u rm e t h o d sp r e p a r i n gg s hl i p o s o m e ，p hg r a d i e n t ，r e v e r s ep h a s ee v a p o r a t i o n ， e t h a n o li n j e c t i n ga n de t h e ri n j e c t i n g ，w e r ec o m p a r e db ye n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y , p a r t i c l es i z e ， p o l y d i s p e r s i t yi n d e x ( p d l ) a n ds t o r a g es t a b i l i t y p hg r a d i e n tm e t h o dw a sc h o s et op r e p a r e g s h l i p o s o m e t h eo p t i m a lp r o c e s s i n gp a r a m e t e r so fp r e p a r i n gg s hl i p o s o m eb yp hg r a d i e n tm e t h o d w e r e ：p hg r a d i e n tf r o m3 0 t o6 0 ，h y d r a t i o nt e m p e r a t u r e4 0 c ，h y d r a t i o nt i m e3 0 m i n ， s o n i c a t i o ni n t e n s i t y2 0 0 wa n dt i m e5 m i n m o r e o v e r , t h eo p t i m a lf o r m u l ao fp r e p a r i n gg s h l i p o s o m ew a sg s hl o a d i n gc a p a c i t y2 5 ，c h o l e s t e r o l p h o s p h o l i p i d ( w w ) ：0 2 5 1 ，t w e e n 8 0 p h o s p h o l i p i d ( w w ) ：o 5 1 ，e t h e r c i t r i ca c i db u f f e r ( v v ) ：3 1 t h ee n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y o ft h eg s hl i p o s o m ep r o d u c tw a s9 0 3 p r e p a r e db yt h ea b o v ep a r a m e t e r s a n dt h eg s h l i p o s o m es h o w e dg o o dm i c r o c o s m i cc o n f o r m a t i o na n de v e ns p r e a d i n gv e s i c a , a v e r a g e p a r t i c l es i z e10 2 1n m p d io 0 31 t h e nt h es t a b i l i t yo fg s hl i p o s o m eu n d e rd i f f e r e n ts t o r a g e c o n d i t i o n sw a ss t u d i e d t h et e m p e r a t u r es h o w e dt h es t r o n g e s ti n f l u e n c ea n dt h eb e s ts t o r a g e t e m p e r a t u r ew a s4 c t h ec r y p r o t e c t a n t su s e df o rt h ep r e p a r a t i o no fg s h p r o l i p o s o m ew e r es e l e c t e d ，a n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec r y p r o t e c t i n ge f f e c to ft h em a n n i t o lw a st h eb e s ti nt h es e v e n c r y p r o t e c t a n t s w h e nm a n n i t o l p h o s p h o l i p i d ( w w ) w a s15 1 ，t h eg s hp r o l i p o s o m eh a da e v e nc o l o r , i n t e n s es t r u c t u r e ，f u l ls h a p e ，a n dw i t he n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yb e i n g8 5 4 ， r e t e n t i o nr a t i or e a c h i n g8 8 1 a n dp a r t i c l es i z eb e i n g4 6 9 9 n ma f t e rr e h y d r a t i o n g s hp r o - l i p o s o m ew a sa n a l y z e db yf t i ri n f r a r e ds p e c t r u m ，t h er e s u l ts h o w e dt h a t m a n n i t o lc o u l dp r o t e c tt h ei n t e g r a l i t yo fl i p o s o m em e m b r a n e w h e nt h eg s hp r o - l i p o s o m e s t o r e du n d e r2 0 。ca n d4 0 cf o r3 0d a y s ，t h ep a r t i c l es i z e ，e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y , p ha n d m d ah a dn os i g n i f i c a n tc h a n g e s ，a n dt h es t o r a g es t a b i l i t yw a sg o o d ；t h u s ，i tw a sr e v e a l e dt h a t p r o l i p o s o m ei m p r o v e dt h es t a b i l i t yo fl i p o s o m e t h er e s u l t so fh y g r o s c o p i ce q u i l i b r i u mt e s t s h o w e dt h a tl o wh u m i d i t yh a dl i t t l ei m p a c to nt h es t a b i l i t yo fg s h p r o - l i p o s o m ew h i l eh i g h a b s t r a c t h u m i d i t yh a ds t r o n gi m p a c to ni t ，s og s hl i p o s o m ef r e e z e - d r y i n gp o w d e rs h o u l db es t o r e di n d r yo rl o wh u m i de n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：g l u t a t h i o n en a n o - l i p o s o m ep hg r a d i e n tm e t h o de n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y p r o - l i p o s o m e i i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签 名：日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 谷胱甘肽 1 1 1 谷胱甘肽的性质及分布 谷胱甘肽，即y l 谷氨酰l 半胱氨酰甘氨酸( 7 - l - g l u t a m y l l c y s t e i n y l g l y c i n e ， g l u t a t h i o n e ) ，是由l 一谷氨酸、l 一半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有y 一谷 氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物，其化学结构见图1 1 。 ： 0：0： ：h： n h 2 - c h c h 2 一c h 2 一c 十n h c h c 十n h c h 2 - c o o h li h h 2 l ： j - i ： -o 几 图1 - 1 谷胱甘肽的化学结构 f i g 1 - 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fg l u t a t h i o n e 早在1 8 8 8 年，法国科学家d er e y p a h l a d e 就在面包酵母的乙醇萃取物中首先发现 了谷胱甘肽，将其命名为p h i l o t h i o m1 9 2 1 年，英国生化学家h o p k i n s 从酵母抽提物中 分离得到了谷胱甘肽并正式命名为g l u t a t h i o n e l l l ；其后，经过化学分析、酸碱滴定、降 解与合成等方面工作1 2 1 ，谷胱甘肽的化学分子结构才最终被确定。作为生物体内的非蛋 白巯基化合物，谷胱甘肽主要有还原型( g s h ) 和氧化型( g s s g ) 两种形态，在机体 中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽。酵母细胞中氧化型和还原型谷胱甘肽之 间的相互转化过程见图1 - 2 3 4 。 雠 9 8 0 )美国a m r e c o 公司 蛋黄卵磷脂( 生化试剂)国药集团化学试剂有限公司 胆固醇( c h o l ，分析纯)国药集团化学试剂有限公司 吐温8 0 ( t w e e n8 0 ，化学纯)国药集团化学试剂有限公司 乙醇、乙醚、柠檬酸、正辛醇等( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司 0 0 5 m o l l 以磷酸盐缓冲液( p b s )自制 2 2 2 主要设备 r e 5 2 c s 型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂 s h z 3 循环水多用真空泵上海沪西分析仪器厂有限公司 江南大学硕士学位论文 b s z 1 0 0 自动部分收集器 磁力搅拌器 u n i c e2 0 0 0 型可见分光光度计 v c x 5 0 0 探头式超声波发射仪 n a n o z s 9 0 型粒径分析仪 3 2 0 一s 电子p h 计 2 3 试验方法 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海沪西仪器厂 龙尼科( 上海) 仪器公司 美国s o n i c s & m a t e 砒a l s i n c 英国m a l v e mi n s t r u m e n t sl t d 梅特勒托力多仪器上海有限公司 2 3 1 谷胱甘肽的正辛醇水分配系数的测定 配置一定浓度的g s h 溶液。将g s h 溶液按一定比例与正辛醇溶液混合，搅拌1 2 h ， 静置分层，将油相和水相分离，测定水相中g s h 的浓度，此即为水相体系中的g s h 浓 度。将上述油相与不同p h 的p b s 按一定比例混合进行再次分配，搅拌1 2 h ，静置分层， 将油相与水相分离，测定水相中g s h 的浓度，此即得正辛醇体系中的g s h 浓度。计算 g s h 正辛醇水分配系数【5 7 1 。 2 3 2 谷胱甘肽纳米脂质体的制备方法 2 3 2 1 反相蒸发法 称取一定量的卵磷脂和胆固醇，溶于乙醚得到透明澄清的类脂溶液；称取配方量的 谷胱甘肽和吐温8 0 溶于p b s 中；将谷胱甘肽的p b s 溶液加入类脂溶液中，将两者的混 合液在冰浴中短时超声5 m i n ( 间歇超声，l s l s ) ，得乳状液，在4 0 。c 水浴中旋转蒸发除 去乙醚( 真空度以不爆沸为主) ，待乳状液在烧瓶壁上形成均匀的薄膜后，加入一定量 的p b s ，继续旋转蒸发水合3 0 m i n 除去剩余的乙醚，所得牛奶状混悬液即为脂质体。置 于4 。c 冰箱贮藏1 5 引。 2 3 2 2 乙醇注入法 称取配方量的g s h 和吐温8 0 ，溶于p b s 中，形成溶质溶液，于6 0 水浴中充分搅 拌；称取配方量的卵磷脂和胆固醇，溶于无水乙醇中，形成脂质溶液，于6 0 水浴中保 温至溶解完全形成脂质溶液，用注射器将其快速注入溶质溶液中，保温3 0 m i n ，脂质体 形成；将脂质体悬液于4 0 。c 水浴中减压旋转蒸发3 0 m i n 至乙醇挥发完全；将上述脂质 体混悬液在冰浴中短时超声5 m i n ( 间歇超声，l s l s ) ，即得脂质体【5 引。置于4 。c 冰箱贮 藏。 2 323 乙醚注入法 称取配方量的g s h 和吐温8 0 ，溶于p b s 中，形成溶质溶液，于6 0 水浴中充分搅 拌；称取配方量的卵磷脂和胆固醇，溶于乙醚中，形成脂质溶液，用注射器将其匀速注 入溶质溶液中，保温3 0 m i n ，脂质体形成；将上述脂质体在冰浴中短时超声5 m i n ( 间歇 超声，l s l s ) ，即得脂质体1 5 8 】。置于4 冰箱贮藏。 2 3 2 4p h 梯度法 称取一定量的卵磷脂、胆固醇和吐温8 0 ，溶于乙醚得到类脂溶液；将类脂溶液置于 圆底烧瓶在4 0 。c 水浴中旋转蒸发除去乙醚，待类脂物在烧瓶壁上成膜后，加入一定p h 值的0 3 m o l l 1 柠檬酸缓冲液1 0 m l ，继续旋转蒸发水合3 0 m i n ，得空白脂质体溶液；将 1 2 第二章谷胱甘肽纳米脂质体的制备方法的研究 谷胱甘肽加入空白脂质体溶液中，用0 5 m o l l - 1 的磷酸氢二钠溶液调节p h ，使p h 值增 加3 ，将上述混合液在冰浴中短时超声5 m i n ( 间歇超声，i s i s ) ，静置2 h 即得脂质体【5 9 1 。 置于4 冰箱贮藏。 2 3 3 脂质体包封率的测定方法 2 3 3 1 谷胱甘肽的测定方法 优化的e l l m a n s 测定法 6 0 l ，在试管中顺序加入0 2 m l2 m m o l l d t n b ，0 4 m l i m o l l t r i s h c l 缓冲溶液和3 4 m l 适当浓度样品，5 m i n 后测定4 1 2 n m 处的o d 值， 根据标准曲线( 图2 1 ) 计算出样品中浓度。 1 2 1 暑0 8 舌o 6 o 0 4 0 2 o 0o 2o 4o 60 8l1 21 4 g s h 浓度r n g - m l 1 图2 - 1g s h 测定标准曲线 f i g 2 - 1t h es t a n d a r dc u r v eo fg s hc o n c e n t r a t i o n 2 3 3 2 包封率的计算方法 将脂质体与游离谷胱甘肽分离，测定游离的谷胱甘肽量，然后根据公式( 1 ) 计算 脂质体包埋率： e e = ( i c f c t ) x 1 0 0 ( 1 ) ( 1 ) 式中 e e g s h 脂质体包封率； c f _ 游离g s h 含量； c t - - g s h 总含量。 2 3 4 脂质体的分离方法 2 34l 凝胶柱过滤法 选用s e p h a d e xg 2 5 凝胶柱进行分离。取l m l 脂质体混悬液进行上样分离，采用一 定的洗脱剂洗脱，洗脱速度控制在o 5 1 0 m l m i n 一，进行分部收集，测定游离的谷胱甘 肽总量，计算包封率。 2 3 4 2 透析法 准确吸取l m l 脂质体悬浮液移至透析袋中( 截留分子量5 0 0 0 d ) ，悬于1 0 0 m l 磷酸 盐缓冲液( p h7 0 ，o 0 5m ) 中透析8 h ，慢速搅拌。测定透析外液中的谷胱甘肽总量， 即为游离谷胱甘肽总量，计算包封率。 1 3 江南大学硕士学位论文 2 343 洗脱剂的选择 取l m g m l 。1 的谷胱甘肽溶液l m l 上柱分离，分别选用去离子水、n a c i 、乙醇、p b s 、 柠檬酸和p b s ( n a c l ) 为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度控制在0 5 1 0 m l m i n ，进行分部 收集，测定洗脱液中的谷胱甘肽总量，计算回收率。 2 3 5 脂质体平均粒径和粒度分布 采用动态光散射( d l s ) 技术进行测定，测定温度2 5 ，准确吸取脂质体样品，用 o 0 5m 、p h7 0p b s 缓冲液稀释至磷脂浓度0 0 2 5 。每个样品测定经过至少1 0 次运行。 水的粘度( o 8 8 7 2 m p a s ) 和折光指数( 1 3 3 ) 作为样品的测定参考。脂质体的平均粒 径分布和多分散性指数( p d i ) 自动由设备累积分析给出。 2 4 结果与讨论 2 4 1 谷胱甘肽纳米脂质体制备的可行性分析 2 4 1 1 谷胱甘肽的正辛醇水分配系数的测定 包埋物在正辛醇水相体系中的分配系数是用来表示包埋物亲水性或疏水性的一个 物理参数。一般将包埋物在正辛醇和水中的表观质量分配系数p 作为判断包埋物能否被 脂质体包封的标准【6 1 】。水溶性物质( l o gp 4 5 ) 能够 较为容易的被脂质体所包封，表现较好的物理化学稳定性。本实验中，测定了g s h 在 p h 2 5 7 0 之间的l o gp 为一0 7 9 6 至1 8 5 ( 如表2 1 所示) 。 表2 - 1 谷胱甘肽在正辛醇水相体系中的分配系数 t a b 2 1c o m p a r i s o no fa p p a r e n tp a r t i t i o nc o e f f i c i e n to fg l u t a t h i o n ei nn - o c t a n o l w a t e rs y s t e m 由表2 1 可知，g s h 在酸性条件下的l o gp 均远远小于o 3 ，水溶性很好，从而揭 示了g s h 能够被脂质体很好的包埋。 2 4 1 2 脂质体制备所用壁材磷脂、胆固醇和吐温8 0 对g s h 稳定性的影响 脂质体制备常用的膜材主要是天然磷脂，天然磷脂主要有大豆磷脂和蛋黄卵磷脂， 天然磷脂的主要优势是可以被机体消耗吸收，对机体的副作用小，而且价格上比合成材 料要便宜。相比于大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂具有乳化性能好、杂质成分比较少、包封 率高等优点，所以本试验选用蛋黄卵磷脂作为膜材来制备g s h 脂质体。胆固醇是制备 脂质体常用的脂质，主要用于提高脂质双分子层的稳定性。吐温g o 是食品工业中常用 的_ 种乳化剂，在脂质体制备中主要用于提高脂质体的稳定性。 g s h 是一种生物活性物质，容易失活，而卵磷脂等膜材含有杂质，成分复杂，所以 本文研究了脂质体制备所用膜材磷脂、胆固醇和吐温8 0 对g s h 稳定性的影响。 本试验将卵磷脂、胆固醇、吐温8 0 以及三者的混合物分别与g s h 溶液通过超声乳 化处理( 作用时间5 m i n ，强度2 8 0 w ，间歇超声，l s 1 s ) 进行机械性的混合( 这种机械 1 4 第二章谷胱甘肽纳米脂质体的制备方法的研究 性混合并不形成脂质体) ，然后分时间段测定乳状液中g s h 含量的变化，结果如表2 2 所示。 表2 - 2 脂质体制备所用膜材对g s h 稳定性的影响 t a b 2 2e f f e c to fp h o s p h o l i p i d ，c h o l e s t e ra n dt w e e n - 8 0o nt h es t a b i l i t yo fg s h 从表2 - 2 中可以看出，与不同膜材机械混合1 0 天后，体系中的g s h 含量没有发生 显著的减少，从而说明了制备脂质体所用的膜材卵磷脂、胆固醇以及吐温8 0 对g s h 的 稳定性影响很小。 2 4 1 3 脂质体制备工艺对g s h 稳定性的影响 在脂质体制备过程中，需要在恒温水浴中旋转蒸发来促进水合、体系p h 的调节以 及超声处理等操作，这些过程可能会引起g s h 的失活，所以本文研究了不同的制备过 程对g s h 稳定性的影响。本部分分别研究了旋转蒸发前后、调节体系p h 值前后以及超 声前后体系中g s h 总含量的变化，结果如表2 3 所示。 表2 - 3 制备工艺对g s h 稳定性的影响 t a b 2 3e f f e c to fp r e p a r i n gp r o c e s so nt h es t a b i l i t yo fg s h 由表2 3 可以看出，4 0 。c 恒温水浴下旋转蒸发3 0 m i n 、调节体系p h 从3 o 至6 0 以 及超声处理( 作用时间5 m i n ，强度2 8 0 w ，间歇超声，i s i s ) 都不会造成体系中g s h 含量的显著减少。从而可以说明，这些方法的制备工艺对g s h 稳定性的影响很小。 2 4 2 脂质体与游离g s h 的分离 2 4 2 1 分离方法的比较 测定包封率的前提是将未包被的芯材与包封芯材的脂质体分离。脂质体的分离方法 有很多种，主要有超速离心法、透析法、凝胶过滤法、超膜过滤法及微型柱分离法等。 不同的方法适用的药物类型不同。结合g s h 的性质和本实验室的条件，选用了凝胶过 滤法和透析法来分离脂质体并对二者的分离效果作一比较。 实验结果显示，凝胶过滤法具有经典、准确、方便、重现性好、耗时短的优点，能 将g s h 和脂质体充分分开。透析法操作简单，但是耗时长，且存在稀释问题，给测定 会带来一定影响。故综合考虑，本试验选用s e p h a d e xg 2 5 凝胶柱来分离游离g s h 和脂 质体。 2 4 2 2 洗脱剂的选择 根据文献资料报道，水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和p h 值的 缓冲液。为了使s e p h a d e xg 2 5 凝胶柱能够有效地分离脂质体和游离的g s h ，从而准确 江南大学硕士学位论文 地测定游离的g s h 总量，选择了不同的洗脱剂对上样g s h 进行洗脱，测定回收率，结 果如表2 4 所示。 表2 - 4 洗脱剂的选择 t a b 2 - 4c h o o s i n go fe l u t i n ga g e n t s 洗脱剂 g s h 回收率 水 0 5 m 0 1 l 。1n a c i o 0 5 m 0 1 l 。lp b s 4 0 乙醇 0 5 m o i l 1 柠檬酸溶液 0 0 5 m 0 1 l 。1 p b s ( o 5 m 0 1 l 。1 n a c i ) 7 1 1 8 3 5 8 0 7 8 0 2 8 3 1 9 4 1 从表2 4 可以看出，以0 0 5 m o l l 。1 p b s ( o 5 m o l l n a c l ) 为洗脱剂，谷胱甘肽经分 离后可以得到较高的回收率，故本实验选用0 0 5 m o l l 。1 p b s ( 0 5 m o l l 1 n a c l ) 作为凝胶 柱分离的洗脱剂。 2 422g s h 浓度对回收率的影响 研究洗脱剂对g s h 回收率的影响时，上样所用的g s h 溶液的浓度为l m g m l ，但 是在后续试验中g s h 的浓度会根据试验的安排作相应的变化而不是一个定值，故需选 择不同浓度的g s h 溶液( 每个浓度做三次平行试验) 进行上样分离，以0 0 5 m o l l 。p b s ( o 5 m o l l 。n a c i ) 为洗脱剂，研究g s h 浓度对回收率是否有影响。结果如表2 5 所示。 表2 - 5g s h 浓度对回收率的影响 t a b 2 - 5e f f e c to fg s hc o n c e n t r a t i o n so nr e c o v e r yr a t i o 由表2 5 可以看出，选用0 0 5 m o l l dp b s ( o 5 m o l l 。1 n a c i ) 为洗脱剂时，不同浓度 的g s h 经s e p h a d e xg 2 5 凝胶柱上样后均有较高的回收率，平均回收率可达9 4 0 ，从 而说明g s h 的浓度对回收率影响很小，进一步确定了可以选用凝胶柱过滤法来分离脂 质体和游离的谷胱甘肽，测定脂质体的包封率。 2 4 3 脂质体制备方法的比较 脂质体的制备方法有很多种，方法不同，制得产品的包封率、粒径、多分散性系数 ( p o l y d i s p e r s i t yi n d e x ，p d i ) 和储藏稳定性等亦不同。结合芯材g s h 的特点以及实验 室的具体条件，本试验选择乙醇注入法、乙醚注入法、反相蒸发法和p h 梯度法这四种 方法进行比较，从而确定一种较优的方法来制备g s h 脂质体。 通过预备试验和文献资料的报道，确定用这四种制备方法制备g s h 脂质体时均采 用相同的实验配方和试验条件为，卵磷脂2 0 0 m g ，胆固醇5 0 m g ，吐温8 01 0 0 m g ，g s h 5 0 m g ，水合时间3 0 m i n ，水合温度4 0 ( 因乙醇沸点较高，故乙醇注入法的水合温度 为6 0 ) ，缓冲液体积1 0 m l ，超声时问5 m i n ( 间歇作用，l s 1 s ) ，超声强度2 8 0 w 。 1 6 第二章谷胱甘肽纳米脂质体的制备方法的研究 2 4 3 1 不同制备方法对包封率的影响 舳 7 0 6 0 摹 蒋5 0 蔼4 0 3 0 2 0 1 0 o p h 梯度法反相蒸发法乙醇注入法乙醚注入法 图2 - 2 不同制备方法对包封率的影响 f i g 2 - 2e f f e c to fd i f f e r e n tp r e p a r a t i o nm e t h o d so ne n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yo fg s hi i p o s o m e s 如图2 2 所示，相同配方和条件下p h 梯度法制备的g s h 脂质体的包封率最高，可 以达到8 5 以上，而其它三种方法的包封率均不超过7 5 ，按包封率从大到小依次为 p h 梯度法、乙醇注入法、反相蒸发法和乙醚注入法。由此可以看出，制备方法不同对 脂质体的包封率有很大影响，这与制备方法的原理、过程等有关。乙醚注入法制备过程 中，g s h 直接与有机溶剂乙醚长时间接触，对g s h 有很大破坏，故而包封率很低。反 相蒸发法、乙醇注入法和乙醚注入法的载药原理都是被动载药，所以包封率不高。而p h 梯度法是一种主动载药方法，通过脂质体内外的p h 梯度，使脂质体外水相中的药物自 发地向脂质体内部聚集，从而大大提高了包封率，并改变了水溶性物质难以被包埋的情 况。 2 4 3 2 不同制备方法对脂质体粒径分布的影响 不同制备方法制备得到不同粒径分布的g s h 脂质体，四种方法的粒径分布图如图 2 3 所示。 s i z ed i s t r i b u t i o nb yi n t e n s i t y d i a m e t e r ( n m ) ( a ) 1 7 江南大学硕士学位论文 邑 蓄 岳 董 8 眨bd i s t r i b u t i o nb yi n t e n s 咐 d i a m e t e r ( n m ) ( b ) 8 1 z ed i s t r i b u t i o nb yi n t e n s 咐 d i a m e t e r ( n m ) ( c ) d i a m e t e r ( n n l j ( d ) 图2 - 3 不同方法制备的脂质体的粒径分布图 ( a ) p h 梯度法( b ) 反相蒸发法( c ) 乙醇注入法( d ) 乙醚注入法 f i g 2 - 3p a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o no fg s hi i p o s o m e sp r e p a r e db yd i f f e r e n tm e t h o d s ( a ) p hg r a d i e n tm e t h o d( b ) r e v e r s ep h a s ee v a p o r a t i o nm e t h o d ( c ) e t h a n o li n j e c t i o nm e t h o d( d ) e t h e ri n j e c t i o nm e t h o d 由图2 3 可以看出，p h 梯度法、乙醇注入法和乙醚注入法的粒径分布图的峰形是 呈对称性的，而反相蒸发法的峰形不对称，分布不规则，而且峰宽跨度大，说明反相蒸 发法制备的脂质体的粒径分布不规则，粒度不规整。另外，p h 梯度法的峰宽较之乙醇 注入法和乙醚注入法的都要窄，出峰很集中，说明了其脂质体的粒径分布很规则、均匀。 表2 _ 6 不同制备方法对g s h 脂质体粒径分布的影响 t a b 2 - 6e f f e c to fd i f f e r e n tp r e p a r a t i o nm e t h o d so np a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o no fg s hl i p o s o m e s 表2 - 6 列出了这四种方法制备的脂质体的平均粒径和多分散性指数。由表中数据可 1 8 第二章谷胱甘肽纳米脂质体的制备方法的研究 看出，只有乙醇注入法的平均粒径超过了2 0 0 n m ，其他三种方法的平均粒径均在2 0 0 n m 以下，达到了纳米级。多分散性指数( p d i ) 是反映胶体体系中粒径大小分布范围的一 个指标，p d i 的值越小，表示粒径分布的范围越窄，即体系中粒子的粒径具有较好的规 整度【6 2 1 。从表2 - 6 中可看出，p h 梯度法的p d i 要远远小于其他三种方法的，这说明p h 梯度法制备的脂质体的粒径分布范围相对很集中，粒子的规整性好，体系的均匀性好， 有较均一的分散性。 2 433 不同制备方法对脂质体储藏稳定性的影响 脂质体贮藏期间的稳定性是脂质体应用的一个非常重要的方面，因为脂质体在体内 循环过程中为了达到缓释或靶向释放的功能必须能够保证脂质体囊泡结构的完整性【6 3 j 。 脂质体芯材的渗漏与脂质膜材的氧化水解有关，这些化学反应将导致脂质分子层的破坏 6 4 ，6 5 】。磷脂中酯键的氧化水解受p h 值的影响较大，不饱和的酰基键容易引起氧化，氧 化是水解反应的中间步骤，最终产生游离脂肪酸、溶血磷脂和甘油磷脂，这些水解产物 会使体系的p h 值下降，又进一步加速脂质的水解。因此，可以用p h 值的变化来说明 脂质体的稳定性。另外，脂质体在贮藏过程中，粒子之间会发生聚集融合作用，从而导 致粒径增大甚至产生沉淀，所以，观察脂质体贮藏中粒径的变化也是考察其稳定性的一 个方面。表2 7 揭示了不同方法制备的脂质体在4 条件下贮藏过程中p h 值和粒径的 变化情况。 表2 7 不同方法制备的脂质体4 2 2 f g ：藏过程中p h 值和粒径的变化 t a b 2 - 7t h ec h a n g eo fp ha n dp a r t i c l es i z eo fg s hl i p o s o m e sp r e p a r e db y d i f f e r e n tm e t h o d sd u r i n gs t o r a g ea t4 2 2 从表2 7 中可以看出，不同方法制备的g s h 脂质体在贮藏过程中都出现p h 值下降 的趋势。乙醚注入法制各的g s h 脂质体在贮藏6 0 天后p n 值最低，只有5 6 7 。而p h 梯度法制备的g s h 脂质体的p h 值在贮藏过程中下降缓慢，6 0 天后只下降了o 0 3 。脂 质体悬浮液p h 的下降是由磷脂水解生成的脂肪酸等产物造成的。另一方面，不同方法 制备的g s h 脂质体的粒径在贮藏过程中随着时间的增加而出现不同程度的增加。其中 p h 梯度法的粒径在贮藏6 0 天后只发生了微小的变化，而其他三种方法的粒径都出现了 大幅度的增加，乙醇注入法和乙醚注入法的粒径都超过了1 0 0 0 n m 。 图2 4 是四种方法制备的g s h 脂质体4 下贮藏6 0 天后的外观形态。从图中可以 看出，反相蒸发法、乙醇注入法和乙醚注入法制备的脂质体都出现了明显的沉淀现象， 这与它们的粒径增大有一定的关系。根据分散体系的稳定