（细胞生物学专业论文）日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的差异表达.pdf

日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 捅斐 本实验采用f i c o l l 密度梯度离心法分离出同本七鳃鳗单个核细胞层，并得 到分离单个核细胞层的最佳分离液比重为1 0 9 2 。利用流式细胞仪对分离到的单 个核细胞层细胞进行分选，根据细胞的前向光及侧向光散射特征成功分选出类 淋巴细胞，分选效率为9 5 6 8 ，每毫升外周血可分离纯化得到类淋巴细胞 2 4 x 1 0 6 个。通过透射电镜观察七鳃鳗类淋巴细胞，细胞为圆形或椭圆形，细胞 表面有突起、无微绒毛，胞质内含有板状嵴线粒体、粗面内质网、游离核糖体 和液泡等。 通过淋巴细胞转化实验分析了日本七鳃鳗类淋巴细胞的异质性。首先，日 本七鳃鳗类淋巴细胞的a n a e 染色结果没有出现类似高等脊椎动物t 细胞所具 有的阳性棕红色反应颗粒。之后，用p h a 与s p a 做刺激剂，分别激活t 、b 淋 巴细胞的转化而分裂，检测淋巴细胞的异质性，也未发现t 淋巴细胞、b 淋巴 细胞的分化。以上实验仅从细胞形态和组织化学研究等侧面分析了同本七鳃鳗 类淋巴细胞的异质性，表明在同本七鳃鳗的类淋巴细胞中可能尚未分化出t 、b 两大类群。 本文将限制片断差异显示聚合酶链反应技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n td i f f e r e n t i a l d i s p l a yp c r ，r f d d p c r ) 应用于日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫基因的研 究。建立了免疫处理后的日本七鳃鳗血液类淋巴细胞的基因表达谱，获得基因 片段1 6 8 3 个，其中与正常饲养日本七鳃鳗血液类淋巴细胞有表达差异的片段为 9 7 个，占表达数的5 7 6 。初步分析比较在混合抗原特异性免疫刺激条件下， 日本七鳃鳗类淋巴细胞差异表达基因的特征，9 7 条差异条带中有6 4 条( 约 6 6 9 ) 序列能够通过同源比对获得其生物学功能信息，大致分为8 类，包括初 级代谢、蛋白质合成、转录、能量代谢、细胞结构、信号转导、细胞凋亡、免 疫防卫等功能。其中属免疫防卫功能的基因有1 3 条，约占差异数的2 0 3 ，并 筛选出2 条特异性免疫相关的候选基因v l r ，与海七鳃鳗的v l r 基因有很高 的同源相似性。同时得到一些可能是新基因的候选片断，有待进一步研究证实。 通过差异片段的分析来推断和研究无颌类特异性免疫系统产生的机理与发生机 制，为进一步研究提供线索。 关键词：日本七鳃鳗；特异性免疫；类淋巴细胞；限制片断差异显示聚合酶链 反应 a b s t r a c t t oi s o l a t ea n dp u r i f yp e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e - l i k ec e l l sf r o mt h e a r c t i cl a m p r e y ，l a m p e t r aj a p o n i c a ，c e n t r i f u g a t i o no nf i c o l l - p a q u ew e r e p e r f o r m e d a n d au n i f o r m p o p u l a t i o n o f l e u c o c y t e sc o n t a i n i n g l y m p h o c y t e - l i k ec e l l s w i t ht h em i x t u r eo ff i c o l l - u r o g r a f i ns o l u t i o na t p r o p o r t i o no f1 0 9 2w a sy i e l d e d w i t ht h ef s ca n ds s c c h a r a c t e ro ft h e c e l l so nf l o wc y t o m e t e r ，l y m p h o c y t e - l i k ec e l l sw e r es e p a r a t e ds u c c e s s f u l l y , t h ep u r i t yw a s9 5 6 8 ：a b o u t2 4 x 1 0 6l y m p h o c y t e l i k ec e l l sc o u l db e p u r i f i e df r o m1m lp e r i p h e r a lb l o o d u n d e rt e m ，l y m p h o c y t e 。l i k ec e l l sa r c r o u n do re l l i p s ew i t h o u tm i c r o v i l l u s t h e r ea r em i t o c h o n d r i o nw i t hc r i s t a e ， r o u g he n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，d i s s o c i a t e dr i b o s o m ea n dv a c u o l ei n t h e i r c y t o p l a s m t h el y m p h o c y t eh e t e r o g e n e i t yi s a n a l y z e db yt h ee x p e r i m e n to fc e l l m u l t i p l i c a t i o n t h er e s u l to fa n a er e v e a l st h a tt h e r ei sn op o s i t i v er e d d i s h b r o w ng r a i ni nt h el e u c o c y t e so fl j a p o n i c a t h e n ，t h es t u d i e so nt h e c a p a c i t i e so fi m m u n er e s p o n s e so fl y m p h o c y t e si np e r i p h e r a lb l o o do f l f a p o n i c a t op h aa n ds p aw i t ht h ea c t i v ed e t e r m i n eo fm t i a l s o i n d i c a t e dt h a tt h e r ei sn oc l e a rd i f f e r e n t i a t i o no fta n db l y m p h o c y t ei nt h e l e u c o c y t e so flj a p o n i c a b u tt h i sr e s u l ts c a n t l ya n a l y z e dt h ea s p e c tf r o m c y t o m o r p h o l o g ya n dh i s t o c h e m i s t r yo ft h el y m p h o c y t eh e t e r o g e n e i t yo f l j a p o n i c a , p r e s u m i n gt h a tt h e r ei sm a y b en oc l e a rd i f f e r e n t i a t i o no ft a n db l y m p h o c y t ei nt h el e u c o c y t e so fl j a p o n i c a t h er e s e a r c ho ft h ea d a p t i v ei m m u n eg e n ee x p r e s s i o ni nl y m p h o c y t el i k e c e l lo fl j a p o n i c a ，h a sb e e ns t u d i e du s i n gr f d d - p c r g e n ee x p r e s s i o n p r o f i l eo fi m m u n i z e da d u l th a sb e e nc o n s t r u c t e dc o v e r i n g16 8 3f r a g m e n t so f i m m u n i z e dl a m p r e y , a m o n gt h e s ef r a g m e n t s ，9 7 ( 5 7 6 ) s e q u e n c e so f i m m u n i z e da n dn o r m a ls h o w e dd i f f e r e n c e si na b u n d a n c eo rp r e s e n c e t h e s e d i f f e r e n te x p r e s s e dg e n ef r a g m e n t sa r ea n a l y z e da n db l a s tf o rh o m o l o g y t h e r ea r e6 4o f9 7d i f f e r e n te x p r e s s e dg e n ef r a g m e n t sh a v eg o tb i o l o g i c a l f u n c t i o ni n f o r m a t i o nf r o mh o m o l o g ys e q u e n c ew i t ht b l a s t xi nn c b i t h e s e f u n c t i o n sw e r ec l a s s i f i e di n t o8d i f f e r e n tf u n c t i o n a lc a t e g o r i e s i n c l u d e l l 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的著异表达 p r i m a r ym e t a b o l i z e ，p r o t e i ns y n t h e s i s ，t r a n s c r i p t ，e n e r g ym e t a b o l i s m ，c e l l s t r u c t u r e 、s i g n a lt r a n s d u c t i o n 、c e l la p o p t o s i s 、i m m u n ed e f e n c e t h e r eh a v e 1 3i m m u n ed e f e n s ef u n c t i o ng e n e s a p p r o x i m a t e l y2 0 3 o ft h ed i f f e r e n c e s a n d s e l e c t e dt w os p e c i f i cc a n d i d a t eg e n e sr e l a t e dt oi m m u n ev l r ，h a st h ev e r y h i g hh o m o l o g o u ss i m i l a r i t yw i t ht h es e al a m p r e y sv l rg e n e a tt h es a m e t i m eg e ts o m em a yb en e wc a n d i d a t eg e n ef r a g m e n t s ，p e n d i n gf u r t h e rs t u d y c o n f i r m e d t h r o u g h t h e a n a l y s i s o fd i f f e r e n t s e g m e n t s t oi n f e rt h e m e c h a n i s mo fa g n a t h a n v e r t e b r a t e s a d a p t i v ei m m u n es y s t e m ，a n dt o p r o v i d e c l u e sf o rf u r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：l a m p e t r aj a p o n i c a ；a d a p t i v ei m m u n e ；l y m p h o c y t e - l i k ec e l l s ； c y t o m e t e r y ；c e l lh e t e r o g e n e i t y i i i 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论 文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表 过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论 文中做了明确的声明并表示谢意。 靴敝储雠：历7 筋毛 日肌批“。 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 靴敝储戳疡1 1 触签署 6 2 日本七鳃鳗( l a m p e t r aj a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的著异表达 第一章文献综述 长期以来，有关特异性免疫的起源与进化问题一直是人们研究的热点。以 前人们普遍认为特异性免疫系统起源于硬骨鱼类1 1 1 。但随着研究的不断深入， 人们发现以七鳃鳗和盲鳗为代表的无颌类脊椎动物处在进化出特异性免疫系统 的边缘【z j ，无颌类脊椎动物在一定范围内存在特异性免疫的现象和多种参与特 异性免疫相关的免疫因子，这可能提供揭示人类特异性免疫系统演化起源的关 键线索。早在1 9 7 2 年，g o o d 等人便对七鳃鳗的免疫反应进行了初步研究，发现 它对同种异体间的组织移植物有排斥和超敏感反应【3 l 。1 9 9 0 年，v a m e r 等人运用 蛋白分离与纯化等技术从盲鳗的血液中分离出了一种血清蛋白，鉴定它与免疫 球蛋白在结构与序列上具有同源性1 4 j 。在七鳃鳗类淋巴细胞中，发现有多种与 脊椎动物淋巴细胞的分化、增殖、迁移和信号转导相关的同源基因的表达，但 是与抗原多样性相关重组免疫球蛋白同源基因却一直没有在七鳃鳗中被发现 1 5 j 。近年来，人们发现无颌类脊椎动物存在一种特异性免疫响应，但是在免疫 应答过程中产生的抗原受体，并不是我们在有颌类脊椎动物中看到的重组抗原 受体，而是在类淋巴细胞上发现了新型可变受体，利用一种不寻常的基因重排 过程来产生受体多样性【引。随着基因组计划和生物信息学的迅猛发展，为免疫 基因的进化研究提供了便捷有效的方法后，相继在盲鳗，七鳃鳗等无颌类脊椎 动物的淋巴样细胞中证实有与t 细胞受体，c d 4 等免疫相关基因的同源基因的表 达1 6 j 。这些免疫相关基因的发现，为研究特异性免疫在无颌类脊椎动物中的起 源与进化提供了可能的证据。 1 1 无颌类脊椎动物免疫器官的进化 高等脊椎动物的主要特异性免疫组织和器官有骨髓、胸腺、淋巴结、脾及 扁桃体等；硬骨鱼类的主要免疫器官有胸腺、肾、脾脏及粘膜相关淋巴组织， 它与高等哺乳动物在免疫器官组成上的主要区别在于没有骨髓和淋巴结。然而 作为脊椎动物中最低等的一个类群无颌类，虽然没有进化出完善的免疫组 织和器官，但是具有独特的鳃呼吸器官鳃囊，在幼体时期有胸腺样组织的 形成1 7j 。没有完善的淋巴结，只有弥散的淋巴细胞，在鳃囊组织中有小淋巴细 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的筹异表达 胞的产生【引。这些小淋巴细胞的产生，为无颌类特异性免疫的进化提供了组织 基础。 1 2 无颌类脊椎动物淋巴细胞的进化 特异性免疫是通过淋巴细胞表达特异性受体来识别外界抗原的。淋巴细胞 作为一类特殊的具有免疫活性的细胞，其在进化过程出现的具体时间目前尚没 有明确的证明。在无颌类脊椎动物中，虽然尚未发现胸腺、脾脏、淋巴结等免 疫组织，但已出现了小淋巴细胞。盲鳗消化道的固有层组织，七鳃鳗鳃囊附近 的造血组织，其周围常见有小淋巴细胞集聚。这些小淋巴细胞在结构上，有一 个浓缩染色质的细胞核，周围包被一层薄染色质，其中有相关的细胞器结构1 8 l 。 这些类淋巴细胞在受到外界抗原或异物刺激时，能够形成成熟的淋巴细胞，完 成一系列活化和增殖等过程。从形态学上分析，无颌类的这些类淋巴细胞，主 要产生于一些造血组织。如幼鳗期的褶皱前肠，成体期的脊椎弓和鳃囊等组织 都能被发现有小淋巴细胞的产生1 9 1 。s h i n t a n i 等人于2 0 0 0 年，在七鳃鳗的消化 管淋巴样细胞中发现p u 1 s p i b 同源基因的表达，p u 1 s p i b 基因是在高等脊 椎动物淋巴细胞中特异表达的一类蛋白基因家族l l 们，它的研究成果在分子水平 上进一步验证了淋巴细胞在无颌类脊椎动物中的存在。 早在1 9 8 2 年，国外学者f u j i i ，就通过电子显微镜观察了七鳃鳗幼体一沙隐 虫的血细胞1 3 1j 。我国学者文兴豪等也于1 9 9 7 年对日本七鳃鳗的全血细胞进行了 显微、亚显微研究，也证实其有类淋巴细胞存在1 3 引。作为特异性免疫的重要免 疫细胞，七鳃鳗类淋巴细胞的存在，是研究其免疫进化的重要基础。要研究七 鳃鳗的免疫机制，获得足够数量、纯度高的淋巴细胞是基本条件。国外学者较 早报道了鱼类血液中淋巴细胞有效分离技术【3 4 j ，国内也有分离草鱼 ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) i ”j 、鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 3 6 j 和真鲷 ( p a g r o s o m u sm a j o r ) 1 3 7 j 淋巴细胞的研究报道。有关同本七鳃鳗血液中类淋巴 细胞的分离纯化及细胞异质性分析目前尚未见报道。 1 3 无颌类脊椎动物免疫相关因子的研究 在无颌类脊椎动物的类淋巴细胞中，有大量与高等脊椎动物淋巴细胞的分 化、增殖、迁移、信号传递等相关的同源基因表达。高等脊椎动物免疫应答的 2 日本七鳃鳗犯口，印p f ，口脚f ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的著异表达 特异性是建立在t 、b 淋巴细胞表面抗原识别受体的多样性的基础上，而抗原 识别受体的多样性又是通过抗原识别受体编码基因的v ，j ，c 基因片段的重组 来实现的1 1 1j 。在无颌类中，它的类淋巴细胞尚未完成成熟t 、b 淋巴细胞的进 化，虽然发现有t 细胞抗原受体( t c r ) 等特异性免疫相关同源基因的表达， 但是t 、b 淋巴细胞表面抗原识别受体的重组机制在无颌类的免疫系统中却不 存在。那么无颌类是如何实现它的特异性免疫的呢? 无颌类通过其特有的重组 机制，来产生一系列多样的抗原识别受体，实现特异性免疫。 1 3 1t 细胞受体( t c r ) 和c d 4 t 细胞表面的抗原识别分子称为t 细胞抗原受体( t c r ) 。未分化成熟的前t 细胞中都含有胚系基l 因( g e r ml i n eg e n e ) ，每种胚系基因都由许多分隔状态的带有 编码前导肽( l ) 的可变区基因( 、联接恒定区基因( c ) 的连接基因( j ) 、多样性基 因( d ) 等组成。胚系基因无转录和表达功能，转录前必须经过基因重排( g e n e r e a r r a n g e m e n t ) ，形成含有v j c 或v d j c 基因的完整d n a 才能转录m r n a ，翻 译t c r 的一条肽链。通过重组构成不同的t c r 分子，由此决定了t 细胞识别 抗原的多样性和特异性，从而可对环境中千变万化的抗原产生特异性应答【1 2 1 3 j 。 c d 4 分子是t 细胞的分化抗原，分布于部分t 淋巴细胞和胸腺细胞表面，在免 疫识别中为辅助受体，分别与t c r 共同组成复合抗原受体。 2 0 0 4 年，p a n c e r 等人对海七鳃鳗肠壁组织类淋巴细胞和血液免疫激活类淋 巴细胞的转录产物进行研究，鉴定出t c r 和c d 4 同源基因的表达1 6 l 。序列结构 特征分析表明七鳃鳗的t c r 1 i k e 和c d 4 1 i k e 基因具有特异性免疫抗原受体基因 序列的基本特征，暗示其可能是t c r 基因和c d 4 基因的祖先基因。将七鳃鳗 中表达的t c r 1 i k e 基因与其他脊椎动物的t c r 基因作多序列比对，发现前者 在序列结构上包含可变区v ，连接区j 和跨膜区t m 三段与后者同源的基因片 断，而c d 4 同源基因则包含v ，c ，t m 三段同源的基因片断。从序列结构的 特征分析，七鳃鳗的t c r 1 i k e 和c d 4 1 i k e 基因具有特异性免疫抗原受体基因序 列的基本特征，鉴定其很可能是现代t c r 和c d 4 基因的祖先基因。但是，分 析发现，在海七鳃鳗中发现的这种t c r 1 i k e 基因，它的可变区v ，只具备有一 个单拷贝序列，因此无法象脊椎动物t c r 基因一样，通过不同的v 区基因与c ， j 基因的重排，来实现多样抗体的表达。因此推测，海七鳃鳗的这种t c r 1 i k e 基因仅仅只是现代t c r 基因的前体，但在功能上还没有达到免疫活性的进化。 3 日本七鳃鳗犯口，印曲肋记口) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 1 3 2b 细胞受体 目前，在无颌类的类淋巴细胞中，尚未发现有高等脊椎动物b 淋巴细胞表面 受体的同源基因的表达。那么，我们是否就能断定，在无颌类免疫系统中就不 存在由b 淋巴细胞介导的特异性体液免疫的进化痕迹呢? 磷脂酰肌醇3 激酶b 细 胞接头( b c a p ) 的发现，为我们提出了进一步的思考。b c a p 是一种新型的b 细胞 接头蛋白，其主要功能是使抗原受体结合的蛋白质酪氨酸磷酸化，可以调控下 游的效应分子，同时介导纤维原细胞生长因子受体间的信号传递1 1 4 1 5 1 。2 0 0 2 年， u i n u k o o l 等人在海七鳃鳗淋巴样细胞中发现了b c a p 同源基因的表达，鉴定其 与家鸡的b c a p 基因有3 7 的同源性1 1 6 】，同时将其翻译成蛋白质，其蛋白结构和 特性与人类、家鸡、大鼠的b c a p 蛋白相似，包括3 3 6 4 0 4 氨基酸残基问的锚蛋 白重复区，6 3 6 6 6 6 残基间的盘绕区，4 3 6 4 5 3 残基间的脯氨酸富集区，和三个酪 氨酸磷酸化位点t y r 3 7 8 、t y r 4 2 3 矛n t y r 4 4 8 。2 0 0 5 年，c a n n o n 等人从七鳃鳗的 c d n a 文库中筛选出一段信号肽序列，它与哺乳动物的v p r e b 基因在结构上具有 同源性，包含有一段具有识别位点的跨膜结构域1 1 7 1 。b c a p ，v p r e b 在七鳃鳗中 的表达，暗示在无颌类脊椎动物中也有可能存在b 细胞介导的特异性免疫应答。 1 3 3 可变淋巴受体( v l r ) 有颌类脊椎动物通过淋巴细胞表面抗原识别受体编码基因的v ，j ，c 基因 片段的重组来产生多样的抗原识别受体。然而对于无颌类脊椎动物，也存在一 种特异性免疫响应，但不是我们在有颌类脊椎动物中看到的重组抗原识别受体， 而是在类淋巴细胞上发现了一种新型可变受体，利用一种不寻常的基因重排过 程来产生受体多样性。这种新型可变受体被称为可变淋巴受体( v a r i a b l e l y m p h o c y t er e c e p t o r , v l r ) ，它通过另一种不同的方式来生成多种抗原识别受 体，实现自身的特异性免疫1 1 & 引。这种可变淋巴受体的重组方式是在一个发育 不完全的胚系细胞可变淋巴受体基因( g e r m l i n ev l rg e n e ，g v l r ) 中，随机插 入亮氨酸富集重复( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t ，l r r ) 单元，产生多种成熟的可变淋巴 抗原识别受体。通过这种方式，理论上来说，一个胚系淋巴细胞可变受体基因 就可以生成1 0 1 4 个特异性抗原受体，其多样性足以应对外界多变的抗原。研究 发现，海七鳃鳗具有一个胚系细胞可变淋巴受体基冈1 5j ，而盲鳗具有两种，分 别是v l r a 和v l r b 【1 9 l 。成熟可变淋巴受体的基本结构是由多个亮氨酸重复 4 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 单元的插入形成，它包括3 0 3 8 残基的n 末端l r r ( l r r n t ) ，1 8 残基的首位 l r r ( l r r l ) ，2 4 残基的可变l r r ( l r r v s ) ，1 3 残基连接肽( c p ) 和4 8 6 5 残基的c 末端l r r ( l r r c t ) 1 2 0 l 。由于这种可变淋巴受体的存在，为无颌类 脊椎动物提供了大量的多样性抗原识别受体，为特异性免疫的发展提供了分子 基础。 1 3 4 其他免疫因子 此外，在无颌类脊椎动物中，还发现存在与特异性免疫相关的多种免疫因 子。u i n u k o o l 等人在海七鳃鳗淋巴细胞中还发现c d 4 5 免疫因子的表达【2 1 】，它 是脊椎动物免疫系统主要的跨膜酪氨酸磷酸酶( p t p ) ，用来调节t 细胞和b 细 胞的激活与增值1 2 2 l 。成熟的c d 4 5 蛋白由1 2 8 1 个氨基酸残基组成，一段跨膜序 列( t m ) 将一条肽链分割成n 末端胞外区( e c ) 和c 末端胞质区。七鳃鳗中 的c d 4 5 同源蛋白在c 末端胞质区9 0 6 9 7 2 和1 1 0 4 1 6 6 1 两段氨基酸残基处与 人类的c d 4 5 具有同源性。 最近c o o p e r 等人，运用生物信息学等方法，分析海七鳃鳗免疫相关的e s t 数据，发现c d 8 ，c d 9 8 ，t a p 等特异性免疫相关因子的同源基因也在七鳃鳗淋 巴细胞中有表达【2 2 之4 1 ，在高等动物中，这些因子对淋巴细胞的活化，迁移，分 化等具有调解作用。 1 4 无颌类脊椎动物特异性免疫机制 特异性免疫是通过淋巴细胞表面各种不同的抗原受体识别异物，多种多样 的抗原受体则通过一系列重组机制产生。在高等脊椎动物中，通过免疫球蛋白 和t 细胞受体胚系基因的v 、j 、c 等基因片段的重组来产生多样的抗原受体。然 而，在无颌类脊椎动物中发现的一些与特异性免疫相关的可变受体基因 ( t c r 1 i k eg e n e ) ，虽然它们的结构与有颌脊椎动物的可变受体基因有一定的 相似性，都具有可变区v ，连接区j ，固定区c 。但是t c r 1 i k e 基因的可变区只有 一个拷贝，因此它不能象高等脊椎动物的t c r 基因那样，以v 、j 、c 基因片断 重组的方式发生重排，以产生多种可变受体。后来研究发现，在无颌类脊椎动 物的免疫系统中却存在着另一种重组方式用以生成多种可变受体，其抗原受体 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 是可变淋巴受体1 2 5 1 。它的重组方式是在一个不完全胚系细胞可变淋巴受体基因 ( i n c o m p l e t eg e r m l i n ev l rg e n e ) 中插入亮氨酸富集重复单元( 1 e u c i n e r i c h r e p e a t ，l r r ) ，以产生多种体细胞可变淋巴受体，来对外界多种抗原，产生特 异性免疫反应。无颌类所特有的这种抗原识别受体编码基因的重组机制与高等 脊椎动物的重组方式类似，推测无颌类脊椎动物的这种重组受体的方式，与有 颌类脊椎动物的特异性免疫有一定的进化关系，很可能是一种特异性免疫的初 级形式。 1 5 限制片段差异显示聚合酶链反应在基因差异表达方面的研究 1 9 9 2 年由l i a n gp 和p a r d e e na b 4 9 j 建立的m r n a 差异显示p c r ( d i f f e r e n t i a l d i s p l a yp c r ，d d p c r ) 是分离编码产物未知目的基因的一种快速而有效的方 法。它可从一对细胞群体或一对基因型各自产生的所有m r n a 中有效地鉴定并 分离出差异表达的基因。该方法建立以来已成功地分离到多种基因【5 0 , 5 1 】，目前 在基因研究领域已被广泛采用。但d d p c r 的主要缺点是存在较高的假阳性 5 2 , 5 引。限制性片段差异显示技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n td i f f e r e n t i a ld i s p l a yp c r r f d d p c r ) 是近年来发展起来的一种新技术，它充分利用了限制性片段长度 多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 的可靠性和p c r 的高效性，对基因组d n a 酶切片段进行选择性扩增，被称为第二代差异显示技 术，它解决了在标准差异显示中重复性的问题，在第二代差异显示中，使用特 殊设计的与c d n a 配对接头和一系列特殊设计的引物，特异性的p c r 引物的使 用和下游的p c r 反应使r f d d p c r 分析具有高度的重复性。因为r f d d p c r 技术不使用以p o l y ( a ) 为引物的p c r 扩增，因而该系统对原核和真核系统皆适 用。由于在原核组织中有相对较低m r n a 拷贝，因此只需要3 2 个表达窗，而 在真核生物中需6 4 个表达窗。特点：高度严谨的p c r 可以产生结果一致的基 因表达图谱；重点放大和展示编码区；对原核及真核r n a 都有用；完全消除假 阳性。由于使用了限制性内切酶和选择性碱基，r f d d p c r 极大程度的改进了 d d 假阳性高等及基因确认困难等缺陷，能以较高的覆盖率显示各转录子的情 况，基本达到对基因表达谱进行普查的要求。本研究旨在利用r f d d p c r 这一 新技术，并通过生物信息学分析比较，同本七鳃鳗在免疫刺激条件下，与正常 生长条件之间基因表达的差异，以此来筛选与r 本七鳃鳗特异性免疫相关的候 6 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 选基因，为同本七鳃鳗特异性免疫系统的发生机制研究提供新线索。 1 6 讨论 根据目前的研究成果不难看出，在无颌类脊椎动物中明显存在着特异性免 疫的现象和多种参与特异性免疫相关的免疫因子。虽然在无颌类脊椎动物中还 没发现真正抗体的存在，但许多结构上与脊椎动物特异性免疫分子具有同源性 或与其具有相同结构域的免疫因子，或功能上与其类似的免疫分子陆续得以分 离、纯化和鉴定，这为探索无颌类脊椎动物的特异性免疫机制奠定了基础。 一直以来，人们普遍认为存在于高等脊椎动物中的特异性免疫是由先天免 疫系统进化来的1 2 62 7 】。然而，无颌类脊椎动物可变淋巴受体及其重组机制的发 现，使得先天性免疫进化学说受到冲击，这种在无颌类脊椎动物中的亮氨酸插 入重组机制，极有可能是现代特异性免疫的进化起源。至于其存在的普遍性、 具体的免疫分子、免疫机制以及与脊椎动物特异性免疫之间的异同尚无定论【孤 2 9 j 。而且，在七鳃鳗中还缺少一个编码淋巴细胞表面使免疫系统能够区分和记 住不同入侵细胞的关键受体基因1 3 。因此有关特异性免疫的起源问题，还需要 更为深入的研究。主要有以下三个方面：第一，无颌类类淋巴细胞的起源问题， 未分化的淋巴干细胞来源何种组织? 第二，类淋巴细胞成熟分化的信号传导途 径如何? 与现代特异性免疫的t 、b 淋巴细胞的分化有何联系? 第三，无颌类 特异性免疫相关基因及标记性作用分子之间的相互作用，它们是通过怎样的协 调来对外界抗原做出免疫应答的? 以上三个方面的研究对于我们深入探究特异 性免疫的起源与进化，会有很大启示。 近年来，随着生物信息学与基因组学研究的快速发展，也为我们对免疫相 关基因的进化研究提供了一个方便有效的平台与方法，相信在不久的将来，有 关特异性免疫的进化起源和进化机制问题必定会被阐明。 7 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 第二章日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离，纯化及细胞学特征 2 1 日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离、纯化 2 1 1 材料与方法 2 1 1 1 材料 日本七鳃鳗采自黑龙江省松花江流域同江地区，选取健康、体表完整的个 体1 0 尾，置于水温1 0 的水缸中充气饲养，观察7 天，证实无病后用于实验。 采血抗凝管购自南昌市赣达医疗器械有限公司；通用型细胞分离液l t s l l 3 为天津市灏洋生物制品公司产品；g i e m s a 染液，瑞氏染液及台盼蓝为s o l a r b i 公司产品；其余试剂均为市售纯度最高的产品。 不同比重的细胞分离液：将通用型细胞分离液l t s l l 3 ( l l 重1 1 1 3 ) 按厂商说 明书要求加不同体积比的p b s ( 1 0 0 m m o l l ，无c a 、m g 离子，p h 7 2 ) ，配成 比重为1 0 7 7 ，1 0 8 0 ，1 0 8 5 ，1 0 9 2 ，1 1 1 0 的细胞分离液。0 2 的台盼蓝染液： 用上述的p b s 配制1 3 8 j 。 2 1 1 2 方法 2 1 1 2 1 类淋巴细胞形态的光镜观察 七鳃鳗外表消毒后，断尾取血，抗凝管收集血液，加2 倍体积h a n k s 液稀 释。分别用g i e m s a 染液，瑞氏染液染色，光学显微镜观察细胞种类及形态。 2 1 1 2 2 外周血白细胞的分离 七鳃鳗外表消毒后，断尾取血，抗凝管收集血液，加2 倍体积h a n k s 液稀 释。取不同比重的分离液各3 m l ，分别置于离心管中，用移液器取稀释血液4 m l ， 沿管壁缓缓的叠加到淋巴细胞分离液界面上。水平转头离心1 5 m i n ( 2 0 ， 1 2 0 0 r m i n ) 。用微量移液器小心吸取中间白膜状单个核细胞层到1 5 m l 离心管 中，加5 倍体积以上的h a n k s 液重悬洗涤细胞，然后1 3 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 收 集细胞。将其重悬于适量h a n k s 液中再行洗涤1 次，定量加入h a n k s 液重悬混 8 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 匀细胞【3 6 1 。并通过改变分离时的离心温度、速度、时间，及洗涤细胞时的离心 温度、速度、时间，以此来确定最佳分离条件。 2 1 1 2 3 细胞计数 取1 滴细胞悬液与1 滴0 2 台盼蓝染液混合均匀，加入血球计数板上，按 公式细胞密度( 细胞数m 1 ) = 4 个大方格内的细胞总数4 1 0 4 2 ( 稀释倍数) 进行 计算。同时进行细胞活力检测，死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色，按公 式活细胞百分率= 活细胞数总细胞数x 1 0 0 ，计数4 0 0 个白细胞，计算出活细 胞的百分率。 2 1 1 2 4 类淋巴细胞的流式细胞仪分选 将通过密度梯度离心得到的单个核细胞层的细胞离心，用1 0 0 m m o l l 的p b s 洗涤2 次后重悬，吹打均匀后调整细胞浓度为l x l 0 6 个m l 。用f a c sv a n t a g es e 分选型流式细胞仪( 美国b d 公司) ，根据仪器手册设置好各项参数，安装分选 器，使用标准荧光球来调试最佳滞后时间( d e l a yt i m e ) 和驱动( d r i v e ) 值。 将上述单个核白细胞用常规方法进行分析，细胞经前向光散射特征( f s c ) 和 侧向光散射特征( s s c ) 在二维d o t p l o t 图中划出类淋巴细胞区，然后对其进行 分选预试验，如显示良好的分离效果，则进行大批量的分选。收集完后测定类 淋巴细胞的含量，计算回收率、细胞纯度，用台盼蓝测定细胞活率，瑞氏染色 观察形态。 2 1 1 2 5 类淋巴细胞形态的透射电镜观察 将分选后的类淋巴细胞离心后，去除上清液，细胞团用2 5 的戊二醛固定， 按常规方法制成透射电镜样品，在j e m 2 0 0 0 e x 型透射电镜下观察并拍照。 2 1 2 结果 2 1 2 1 日本七鳃鳗全血细胞的观察 采用g i e m s a 染色法在1 0 0 倍光学显微镜下观察同本七鳃鳗的全血细胞，初 9 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的筹异表达 步从形态上能够区分出红细胞、类淋巴细胞、单核细胞、血栓细胞和粒细胞。 红细胞数量占血细胞总数的9 0 以上，为圆形或椭圆形，一侧凹陷，似豌豆状， 大小不均，直径7 - 1 跏m ，表面光滑，有一细胞核。类淋巴细胞是白细胞中数量 最多的一种，圆形或椭圆形，直径6 一趴m 左右，核较大，位于细胞中央，周围 包被一层薄细胞质。单核细胞近似椭圆形或梨形，体积较大，1 吮m 左右，细胞 表面有凸起。粒细胞，不规则形，6 1 吮m 左右，表面有伪足。各类细胞的数量 及形态的结果和f u j i i 3 1 l 与文兴割3 2 j 所报道的一致。 2 1 2 2 外周血单个核细胞的密度梯度分离效果 用配制的4 种不同比重的分离液来分离日本七鳃鳗的血细胞。从图1 可见， 只有当分离液比重为1 0 9 2 以上时，在血浆与分离液交界处可以观察到单个核 细胞层。经光镜检验，在分离液比重为1 0 9 2 分离时，单个核细胞层中含大量 的类淋巴细胞( 7 5 9 0 ) 、少部分的单核细胞( 1 0 2 5 ) 、极少部分的血栓 细胞和个别的红细胞，分离液层中无任何细胞，粒细胞层紧贴在压积的红细胞 层上，呈一层很薄的白膜。用比重低于1 0 9 2 的分离液进行细胞分离，发现单 个核细胞层不明显，有时看不到细胞层，镜检单个核细胞数量也很低。而用比 重为1 1 1 0 的分离液分离细胞时，发现单个核细胞层明显，镜下类淋巴细胞及 粒细胞数量均增多，分离液中也有相当数量的粒细胞。由此可见，日本七鳃鳗 类淋巴细胞的比重大约为1 0 9 2 。 1 0 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的著异表达 舟 u 1 0 7 71 0 8 01 0 8 51 0 9 2 注：a 箭头所指处为单核细胞层；b 图下数字为比重 n o t e ：a m o n o c y t e sl a y e rw a ss h o w nb ya l la r r o w ； b t h en u m b e r sb e l l o wa r es p e c i f i cg r a v i t i e s 图1 四种不同比重分离液的分离效果 f i g 1t h es e p a r a t i o nr e s u l to fl y m p h o c y t e l i k ec e l l sb yf o u rd i f f e r e n tp r o p o r t i o ns e p a r a t i o n l i q u i d 2 1 2 3 类淋巴细胞的流式细胞仪分选 为尽可能多地获取类淋巴细胞，采用比重为1 1 1 0 的分离液分离得到的单个 核细胞层细胞用流式细胞仪进行了分选试验。根据f s c 及s s c 可将同本七鳃鳗单 个核细胞大致分为三个区域( 图2 a ) ；分选前的细胞中类淋巴细胞约占6 4 4 6 ， 粒细胞约占2 6 7 8 ，单核细胞约占8 1 1 。分选后，类淋巴细胞比例上于t - 至j j 大约 9 5 6 8 ( 图2 b ) 。经多批次人最分选后的统计数字表明，采用本方法可从每毫 升外周血中纯化得到2 4 x 1 0 6 个类淋巴细胞。 日本七鳃鳗( l a m p e t r a j a p o n i c a ) 类淋巴细胞特异性免疫相关基冈的差异表达 注：a 分选前；b 分选后；r i ：粒细胞；r 2 ：类淋巴细胞；r 3 ：单核细胞 n o t e ：a b e f o r es e p a r a t i o n ；b a f t e rs e p a r a t i o n ；r i ：g r a n u l o c y t e s ；r 2 ：l