（食品科学专业论文）棉织物固定化菊粉酶酶解菊粉的研究.pdf

摘要 摘要 本文主要研究了棉纤维对甲苯磺酰氯活化法固定化菊粉酶技术。菊粉酶是一种菊糖水 解酶，系统名称为口一d 果糖水解酶。本实验室保存的一株爿印p 愕f ，“j ；c “s k 0 0 4 菌株能 产菊粉酶，在优化的发酵条件下制备菊粉酶，采用对甲苯磺酰氯活化法使菊粉酶共价连接 在棉纤维上。 通过对15 种不同种类织物的固定化试验筛选出纯棉绒布为固定化载体，并用s e m 观 察了酶固定化前后棉纤维表面超微结构的变化。棉织物固定化菊粉酶有较好的储存稳定 性，4 缓冲液中保存8 周，固定化酶活几乎没有降低。固定液中剩余的游离酶经透析， 超滤浓缩后，可再次用于制备固定化酶；棉织物经再生活化后，可重新作为酶的固定化载 体。 通过单因素和正交实验得出最佳的固定化条件：n a o h 浓度0 5m o l 几，处理时间3h ； 干吡啶：棉布= 1 0 m l ：l g ，处理时间3h ；对甲苯磺酰氯：干吡i 庭= l g ：1 m l ，处理时间3h ；缓 冲液p h 值4 5 ，离子强度o 2m o l l ，加酶量8 0u g ，固定化温度2 5 ，固定化时间1 2h ， 在此条件下得到固定化酶活回收率达到8 3 6 0 。 将。4 单g 馏讲肥“卅s k 0 0 4 菌株所产菊粉酶进行部分分离纯化，先后通过活性炭脱色、 硫酸铵分级沉淀及透析，纯化倍数56 7 ，活力回收率8 3 7 3 。在此基础上固定化菊粉酶， 动力学常数k 。为1 6 7 1 4 m m l ( 菊糖) ，酶经固定化后对菊糖或蔗糖的k 。值均上升，i s 比值略有下降。 固定化菊粉酶的最适反应温度为6 0 ，与游离菊粉酶的相同；最适反应p h 值5 o ，与 游离酶相比向碱性方向偏移o 5 个单位。固定化酶温度稳定性稍有提高，p h 稳定性基本不 变。酶经固定化后，c a 2 + ，n a + ，z n 2 + 较大地提高了酶的活力，e d l a 等也由原来的抑制剂 变为激活剂。 在5 0 、进料速度o 2m l m i n 的操作条件下，固定化酶填充床反应器酶解5 菊糖溶 液，水解率可达到1 0 0 ，定容产率为4 3g l 。1 h ：酶解1 0 菊糖溶液水解率7 0 ，定 容产率为5 3g l o h 1 。1 0 的菊糖溶液在分批式反应器酶解，当底物与固定化酶比例 1 0 0 m l ：l g 时，反应4h ，产率2 4 2 3 6m g l h ，转化率9 6 9 4 。填充床反应器中固定 化菊粉酶具有较好的操作稳定性，4 0 下，固定化酶的操作半衰期3 2d ；5 0 下其操作半 衰期为1 9d 。 关键词：菊粉酶，固定化，棉纤维，对甲苯磺酰氯 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t i n u l i n a s et m m 彳置p 已，g f ，w c “脚s k 0 0 4w a sl m m o b i l i z e do nc o t t o nc l o t ha c t i v a t e dw i t l p - t o i u e n e s u i f o n y lc h i o r i d e ( t o s y lc h l o “d e ) t h eb e s tc a r r i e rw a sc o n o nc l o t hw i t hs o rn a p s e l e c t e df r o mn f t e e nk i n d so fc a r r i e r s t h ea n a l y s i so f 缸b mm i c m g r a p l l sb ys e mp r o v e dm a t c o t t o nc l o 血w i ms o rn a pw a sag u j t a b l em a t e r i a lf o rm u l i i l a s ei m m o b m z a t i o n t h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e di n u l i n a s ei n0 2m o l la c e t i cb u n 研( p h4 5 ) w a ss t a b l ef o r8w e e k sa t4 t h e e n 2 y m er e m a i n e d i nm es u p e m a t a n ta r e ri m m o b i l i z a t i o nc a nb er e u s e df o rp r e p a r a t i o no f i m m o b i l i z e di n u l i n a s ea 丘e rd i a l y s i sa n du l t r a f i l t r a t i o n t h er e u t i l i z a t i o nc 印a c i t yo ff i b e ru s e d f o rt h ep r e p a r a t i o no f t 1 ei m m o b i l i z e di n u l i n a s ew a sa s s e s s e d t h eb e s tc o n d i t i o n sw a so b t a i n e dt h r o u 曲也es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s c o n o nc l o m w a ss o a k e d i no 5m o l l n a o hs o l u t i o n f o r3h d r yp y r i d i n e w a s t h e na d d e d t o t h e c i o t h 、v i t ht i l eo p t i i l l a i 锄o u l l to fi o m lt oe a c hg r 锄o f d r yc o t t o nf o r3h t h er a t i oo f t o s y iq ) p y r i d i n e ( m l ) w a s1g ：1m l ，t o s y l a t i o nt i m ew a s3h 8 0ue n z y m ep e rgd r yc o t t o nc l o t l lw a s i m m o b i l i z e df o r l 2ha t2 5 n l eo p t i m a lc o u p l i n gp h 啪sf o u ! l dt ob e4 5a n di o n i cs 仃e n g t l l w a s0 2m 0 1 l t h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yy i e l da c h i e v e d8 3 6 0 t h ec r u d ei n u l i n a s ep r e p a r a t i o nw a sp a r t i a l l yp u r 王6 e db ya c t i v ec a r b o n ，猢o n i u r ns u l f 如 矗a c t i o n a t i o na n dd i a l y s i s a n dm ep u r i f i c a t i o nm u l t i p l ew a s5 6 7 ，e n z y m ea c t i v i t yy i e l dw a s 8 3 7 3 t h e k mw a s1 6 7 】4 m 咖l ( f o r j n u ) a & r i m m o b i i i z a “o n ，k mr a i s eb o 亡 1 f o r i n u l j n e a j l ds u c r o s e ，i sr a t i os i i 曲t l yd r o p e d t h eo p t i m mt e m p e r a t u r ea 1 1 dp hf o ri n u l i nh y d r o l y s i sw i mm ei m m o b i 王i z e di i l u l i i l a s ew e r e 6 0 a 1 1 d5 0 ，r e s p e c t i v e l y ，w h e r e a sf o r 丘e ee n z y m e ，w e r e6 0 a i l d4 5 t h e r n l a ls t a b m t ya 1 1 d p hs 乜b i l i t yh a dn os i 鲥6 c a mc h a n g e c a 2 + ，n a + a n dz n 2 + a c t i v a c e de n z y m ea c t i v 畸r e l a t i v e l y e d t at u r l l e d 舶mo r i g i n a li 出b i t o ri n t oa c t i v a t o l c o n t i n u o u sp r o d u c t j o no f 疗c t o s e 矗d mi n u l i n ，a s i j 】v e s t j g a t e du s i n gm ei m m o b i l j z e d i n u i i n a s ei na p a c k e d - b e dc o i u m nr e a c t o l a t t h es p a c ev e l o c i t ) ，o f o 2 m l m i n ，5 ( w v ) i n u l i n e s o l u t i o nw a sc o m p l e t e l yh y d m l y z e da n dt h ev 0 1 u m e t r i cp m d u c t i v i t ) ，w a s4 3g l h _ a t5 0 ；t h e d ho f1 0 ( w v )i n u l i n es 0 1 u t i o n 啪s7 0 锄dm ev o l m e t r i cp r o d u c t i v i t yw a s5 3g l _ i h 1 t h eo p e r a t i o n a lh a l f - l i f eo f 也ei m h m b i l i z e di n u l i n a s ew a s1 9da t5 0 a n d3 2da t4 0 h b a t c hr e a c t o rt t l ee x t e n to f1o i n u l i n eh y d r o l y s i sa t t a i n e d9 6 9 4 i n4ha 1 1 dt h ep r o d u c t i v i t y w a s2 4 2 ，3 6m g l h 1w h e nt l l er a t i oo f s u b s t r a t ea n di m m o b i l i z e di n u l i n a s ew a s1 0 0 m 1 ：1 9 k e yw o r d s ：i n u l i n a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；t 0 s y lc h l o r i d e ；c o t t o nc l o t h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 垄壁导师签名： ；二勿舌 日期： b 6 年月f 7 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 菊糖、低聚果糖及高果糖浆 菊糖( i n u i i n e ) 于i8 0 4 年被德国科学家发现，之后命名为“菊糖”，又称菊粉、土木 香粉，是一种生物多糖。菊糖是由果糖分子通过b ( 2 1 ) 键连接，形成寡糖或多糖的形式， 终端都含有一个葡萄糖分子，敌可用g f 。来代表其分子式( 其中g 为2 i u c o s e 的缩写，f 为f r u c t o s e 的缩写，n 为f r u c t o s e 的聚合度) ，聚合度2 6 0 ，平均为1 0 左右，分子量为 3 0 0 0 一5 0 0 0 ，其分子的大小因植物种类、气候条件及收获季节而异。菊糖微溶于冷水，而 在热水中能很快溶解，与碘不呈颜色反应，没有还原性，有旋光性，在水中为左旋【2 1 。 菊糖在自然界分和很广，存在于植物、海藻、真菌和细菌中，但主要来源于植物。菊 糖作为植物的储备多糖广泛存在于3 6 0 0 0 种植物内，尤其大量存在于菊科植物例如菊芋 ( j u r u s a l e m a r l i c h o k e ，俗称洋姜) 、菊苣( c h i c o r y ) 等的块根中。生产菊糖的经济效益高， 经种植专家测算是甜菜种植业收益的7 倍口】。菊糖的提取类似于从甜菜中提取糖，分三步 进行：( 1 ) 原料清洗、切片后，热水拙提得菊糖汁：( 2 ) 去矿化、超滤、脱色、脱苦的精 制菊檐汁；( 3 ) 蒸发浓缩、喷雾干燥得产品f 4 】。 目前，对菊糖的利用主要是通过酸解或外切菊粉酶酶解制备高果糖浆( 简称h f s ) ， 或采用内切菊粉酶法生产低聚果糖( f r u c t 0 0 l i 2 0 s a c c h a r i d e ，简称f o s ) 。f o s 广泛存在于自 然界中，如菊芋、菊苣、梨、蜂蜜等都含有f o s 。作为一种功能性糖，f o s 具有低致龋性， 抗消化，改善肠道菌丛，促进双歧杆菌增殖作用，促进c a 、m g 的吸收及类似膳食纤维作 用等独特的生理活性，在日本、欧盟等国家和地区获得了广泛应用。f o s 可采用呋哺果糖 苷转移酶( 疗u c t o f u r a n o s i d a s e ，f f a s e ) 法和内切菊粉酶法生产。前者利用f f a s e 的转果糖基 作用，以蔗糖为原料生产f o s ，后者利用内切菊粉酶法从菊糖分子内部随机切断b 一果糖 苷键，从而产生聚合度降低的f o s ( d p 2 d p i o 。 高果糖浆又叫果葡糖浆，其英文全名为h i 曲f r u c t o s ec o ms y r u p ( h f c s ) 或h i 曲 f r u c t o s es y r u p ( h f s ) 。高果糖浆的分类有两种：4 2 高果糖浆( h f c s 4 2 ) ；5 5 高果糖浆 ( h f c s 5 5 ) ，后来，在4 2 高果糖浆的基础上进一步分离得到了9 0 以上的高纯度果糖浆 ( h f c s 9 0 ) 。用高纯度果糖浆与4 2 的高果糖浆混合可制造5 5 的高果糖浆| 6j 。 h f s 作为一种功能性甜味剂，具有许多优异的特性1 7 】：果糖的主要特性为甜，它是 自然界中最甜的糖。甜度为蔗糖的17 3 倍，不仅具有高甜性，还具有冷甜性；风味不 掩盖性；渗透性强，防腐效果佳；溶解度高；保湿性好，保鲜性能优良；冰点温 度低；发酵性能好；优越的保健与营养功效低热量、抗龃齿性，代谢转化为肝糖的 速度比葡萄糖快，能在无胰岛素的情况下代谢成糖元，不会引起血糖值增加，适宜于糖尿 病、肝脏病、低血糖病人及婴儿、孕妇和老年人食用。 由于h f s 良好的食品加工性能，且具有比葡萄糖、蔗糖明显优越的营养保健功效，因 望堕奎兰堡主兰垡堡兰 此越来越广泛地应用于饮料、罐头、焙制品等食品加工中隅】： ( 1 ) 在饮料工业中的应用高果糖浆中9 5 的糖为果糖和葡萄糖，在口感上具有越 冷越甜、清凉爽口之特性，特别适合饮料这种在冷冻条件下饮用的产品。高果糖浆中9 5 的糖为果糖和葡萄糖，可直接进入血液循环系统，而蔗糖需消化后才被吸收进入体内循环， 对运动员和职业人士而言，用高果糖浆配置的饮料可以快速消除疲劳、补充体力。 ( 2 ) 在雪糕、冰淇淋中的应用在冰淇淋的生产过程中，由于蔗糖在2 3 以下生成 含水晶体，聚合成球形如霉菌状的晶体，从而使得产品口感粗糙。若改用高果糖浆与其它 糖混合使用，则可抑制其结晶，改善冰淇淋中晶核生成和晶粒的成长，使产品细腻、柔滑。 另一方面，高果糖浆用于冰淇淋中具有改善其抗融性的作用。 ( 3 ) 在焙烤食品中的应用高果糖浆的热稳定性稍低于蔗糖和葡萄糖浆，在受热情 况下易分解生成有色物质，也易于氨基酸类物质发生美拉德反应。这些反应都能产生诱人 的金黄色和芳香物质，达到美观产品、吸引消费者的目标。其发酵性能比蔗糖和麦芽糖浆 都好，被充分用于面包、糕点等发酵型焙烤食品中。高果糖浆的抗结晶性、保湿性也被充 分用于面包、糕点、饼干脂肪夹心和果酱夹心等生产中，不仅给产品带来观感方面的好处， 而且简化了产品的配方和制作过程，在产品的销售过程中有效地防止了产品发干、变硬等 变质现象的发生。由于高果糖浆的渗透压大约是蔗糖的两倍，有效地改善了产品的防霉特 性，延长了蛋糕等产品的保质期。 ( 4 ) 在调味品、罐头及凉果中的应用果糖的渗透压高出蔗糖一倍，水分活度低， 因此能有效抑制微生物生长，具有良好的保藏效果。糖渍食品要求所用的糖液有高的溶解 度和抗微生物稳定性，这些方面果糖均优于蔗糖。高果糖浆具有良好的渗透性、发酵性、 保湿性及抗结晶性，并且甜度较高，使之在西式甜品如苹果酱调味品中的运用效果较好， 是果酱、蜜饯类食品的首选配料。同时在制造泡菜、果脯及相关的食品中，高果糖浆能缩 短工时，且具有护色及保持果实完整的功能。 长期以来，制备h f s 是采用淀粉通过双酶水解产生葡萄糖，再由葡萄糖异构酶异构化 的方法，其工艺复杂，副反应多，产品得率不高，果糖最大收率仅为4 5 。现在，利用菊 糖( 菊芋提取物) 为原料由酸法或酶法一步催化生产高果糖浆( 其中果糖含量可达9 0 以 上) ，简化了工艺，缩短了反应时间，提高了产率。尤其是菊粉酶法，成为生产果糖最有 前途和吸引力的一条途径。 1 2 微生物菊粉酶研究历史和现状 1 2 1 菊粉酶的来源 菊粉酶( i n u l i n a s e ) ，是一种菊糖水解酶，系统名称为b d 果糖水解酶。来源很广，自 然界中的植物以及土壤、水和动物消化道中的多种微生物都可以分泌菊粉酶。微生物来源 的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。l i n d e r l 9 0 0 年就发现勋c 如甜d 叨，c p s m 州f 彻淞以及其它一些酵母菌能够利用菊粉。随后，g r a f e 和v o u k 、k l u ) ，v e r 和s a c c h e m 都证实了剐砂v 8 加”2 j 删s 少昭f 凰能够在菊粉上生长。1 9 2 4 年，p r i n g s h e i m 首次报道了 爿印p 馏讲“s 嘲驴r 能产菊粉酶。几年后，a d a m s 等人发现从不同酵母菌中提取并经过纯化的 转化酶也表现出菊粉酶活力，而且菊粉酶的最适p h 和最适温度与转化酶明显不同。自此 以后，对产菊粉酶的微生物报道较多【9 】，尤其在日本、南朝鲜、加拿大和法国。据统计， 产菊粉酶的有丝状真菌1 7 个属4 0 余种，酵母菌1 0 个属2 0 余种，细菌1 2 个数l o 余种州。 其中产酶性能较好的是脆壁克鲁维酵母( 刚叫v e 加，驯c e 5 少昭i 凰) 、马克斯克鲁维酵母 ( 丘m d h f d “s ) 、德巴利酵母( d e 6 y c p jc d 月，口旭f f f ) ，曲霉的一些种( 爿印e 馏f ，“ss p p ) ， 青霉的一些种( p p f c f ，胁ms p p ) 。 1 2 2 菊粉酶的分类 菊粉酶有不同的分类方法。根据菊粉酶在微生物体内主要分布于细胞内、细胞壁和细 胞外，分别称为胞内酶、胞壁结合酶和胞外酶。 根据作用底物方式的不同，主要有以下三种l ：( 1 ) 2 ，l b d 果聚糖水解酶有两种类 型：一为外切酶( e x o i n u l i n a s e ) ( e c 3 2 1 8 0 ) 从非还原末端逐个水解p d 果糖苷键，生成 一分子果糖和少一分子果糖的果聚糖。最终水解物为葡萄糖、果糖和蔗糖。大多数微生物 菊粉酶为外切菊粉酶；另一种为内切酶( e n d o i n u l i n a s e ) ( e c 3 2 1 7 ) ：从菊糖分子内部随 机切断b 一果糖苷键，可能的模式是g f 4 一g f 十f 3 ，f 4 一f 3 + f ，f 5 一f 3 + f 2 。其产物为gf ( s ) 、 g f 2 、g f3 、g f 4 、f 2 、f 3 、f 4 、f 5 等，从而产生降低了聚合度的果聚糖。如爿f m 6 口c ，e ，s p ： m e “如册d ss p 和j 白n ，肋m d n 甜s p 都是产内切酶的典型菌株。( 2 ) b d 一呋喃果糖苷果糖 水解酶( e c 3 2 1 2 6 ) ：水解蔗糖产生果糖，此酶对蔗糖或对有较高聚合度的多聚果糖包 括菊糖的作用有专一性。( 3 ) 菊粉果糖转移酶( f r u c t o t r a l l s f e r a s e ，e c 2 4 1 9 3 ) ：水解菊粉 产生二聚果糖。少数杆菌会产此酶。 对于同时具有内切菊粉酶活性及外切菊粉酶活性的粗酶液，通常测定其对2 菊糖溶 液的活性( i ) 和对2 蔗糖溶液的活性( s ) ，计算出其i s 值并以此作为确定其作用方式 ( 内切外切) 的指标。一般认为当i s 1 0 时，粗酶液的外切活性被抑制，而表现为内切活 性。 1 2 3 菊粉酶的应用 1 2 3 1 利用菊粉酶生产高果糖浆 由于高果糖浆价格低廉，味甜，爽口，渗透压高，保藏效果好，热值低，不易造成龃 齿，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等发达国家被广泛用于食品和医药工业。2 0 世 纪7 0 年代以后，各国开始关注以菊粉为原料，以酸法和酶法水解制备果糖。酸法虽然产 量高，但副产物多，色素重，分离精制难。8 0 年代，美国、法国、比利时、加拿大等国的 研究人员开始研究利用菊粉酶制果糖，其工艺简单，转化率高，产物纯，果糖含量高，可 直接生产超高果葡糖浆( u h f g s ) ，果糖含量9 0 以上l l 。 坚堕查兰堡主兰垡堕苎 1 2 ，3 2 利用菊粉酶生产低聚果糖 低聚果糖( n l l c t o o l i g o s a c c h 硪d e s ) 是在蔗糖分子的果糖残基上以b l ，2 一键结合l 3 个果糖的低聚糖。它是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，同时也适于糖尿病食用。 工业上生产低聚果糖有2 种方法：一种是由蔗糖经口一果糖转移酶( 0 一f m c o s y i t r a n s f e r a s e ) 或转化酶( i n v e n a s e ) 的转果糖基反应而生成的蔗果糖类，其产品中副产品葡萄糖和蔗糖多， 反应不易控制。日本明治制果即采用此法，用黑曲霉进行工业化。另一种是由内切酶水解 菊粉而成，产物仅为低聚果糖和少量果糖，纯度高，原料便宜。比利时o r a f t i 公司投资 2 0 亿比利时法郎，历时数十年种植菊苣( 含菊粉1 5 2 0 ) ，开发生产低聚果糖和菊粉的 应用，分别作为食糖和油脂代用品。 1 2 3 3 和用菊粉酶生产酒精 利用菊粉酶生产酒精，国外相关研究较多。国外有报道指出，用4 印e 穆玎f 淞 门增8 r ( s c h o r 卜g a r l i n d o 。1 4 】等，1 9 9 5 ) 、k 馏站括( o h t a f l 5 1 等，1 9 9 3 ) 或五m 8 h 以，l 淞( m a r g a r i t i s i l 6 等，1 9 8 2 ) 发酵菊粉生产酒精，4 印e 曙f 地sn 啦r 转化率为8 3 以上( v ，v ) ，后两者几乎能完 全将菊粉发酵成酒精。发酵粗菊芋提取液，不需加其他营养物质，2 5h 内酒精产量8 7 8 。 1 3 固定化酶研究进展 酶的固定化( i m m o b i l i z a t i o no fe n z v m e s 、i m m o b i l i z e de n z _ y m e s ) 是指通过某些方式将 酶和载体相结合，酶被载体材料束缚或限制于一定区域内进行其特有的催化反应，并可回 收及重复使用的一类技术。早在1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i m n 最先发现了酶的固定化现象后， 固定酶的报道尚不足l o 篇。而在6 0 年代以k a t z i r k a t c h a i s k i 等教授为首的科学家对酶固 定化方法和固定化酶性质进行了大量研究。1 9 6 9 年日本的千烟一郎博士首先将固定化酶应 用于工业生产，开创了固定化酶应用的新纪元。此后，该术语在1 9 7 1 年第一届酶工程会 议上被提议确定，固定化酶及其应用研究开始在世界范围迅速发展，研究领域涉及生物工 程、医药工程、食品工程、生命科学、高分子材料、化学工程等许多相关学科l l7 ”j 。 1 3 1 固定化酶的特点 与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈 现稳定性高，对抑制剂的敏感性降低，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性；酶与产物的分 离回收容易、可多次重复使用；可以对反应进行精确控制，反应可随时中止、启动，恒态 反应可保证产品的质量稳定；适应多酶系同时反应或连续反应；连续操作及自动化控制、 工艺简便，且产品中不会带进蛋白或细胞，提高酶利用率，降低生产成本等一系列优点i i9 j 。 它在应用上和理论上的巨大潜力吸引了诸多领域的科研机构及企业科技部门研究人员的 注意力，成为现代酶工程领域的研究热点，在固定化载体与固定化方法的研究上都取得了 诸多进展，固定化酶的种类也日益扩展。 固定化酶也有其局限性：固定化时酶活力有一定损失：增加了酶利用成本；适宜于溶 解性底物和小分子底物反应。 第一蕈绪论 酶或多酶反应体系固定化后常常会引起酶性质的改变【2 们，这主要是由于固定化后酶 活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生改变：载体的理化性质对固定化周围 微环境产生影响，如形成能对底物传递产生影响的扩散层或静电作用，载体空间障碍以及 多孔类载体的内扩散限制等。这些影响主要表现在底物专一性的改变，p h 及温度稳定性和 最适条件的改变，动力学常数的改变等。 1 3 2 酶的固定化方法 酶的固定化方法可分为载体结合法、交联法、包埋法、膜法四种【2 ”。载体结合法是将 酶通过范德华力、疏水作用、离子键、共价键等结合于水不溶性载体的种固定化方法。 这类方法在目前的固定化研究中应用最多，许多已成功应用于工业化生产中，主要包括物 理吸附法、离子交换法、共价结合法和金属鳌合法；交联法亦称架桥法，游离酶的氨基酸 残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化，可得到蛋白浓度较高的固定化酶。此 法反应条件剧烈，酶活回收率低；包埋法分为凝胶包埋法、纤维包埋法和微囊包埋法三类。 这些方法其制备工艺简便且条件较为温和，酶只是包埋在载体中，在反应时仍可保持其自 然性质，因此可获得较高的酶活力回收。但此法对酶、底物和产物的分子及溶解性能要求 严格，不适合大分子和不溶性底物；膜法是利用物理方法把酶限制在半透膜、超滤膜、中 空纤维膜等组件中而使酶固定化的一种方法。底物和产物可透过膜组件而酶不能透过。此 法的优点是简单易行，可实现多酶同时固定化，酶作用时仍保持游离状态活性没有损失等， 但是该法与包埋法同样对底物或产物的要求较高，不适合大分子底物和产物，并且不能用 于溶解性差或不稳定的底物，否则会造成膜堵塞。 1 3 3 固定化菊粉酶研究进展 国外自8 0 年代以来即开始了菊粉酶的固定化研究，而我国在此领域起步较晚，研究 较少。吸附法是菊粉酶固定化最常用的方法，该法工艺简单，成本低。但酶易被脱落。采 用吸附法固定的内切菊粉酶( e c 32 i 7 ) 催化效率与糖苷链的长度成正比关系，因此，固 定后酶的催化效率很低。共价法固定菊粉酶的效率相当高，并且酶的稳定性也极为出色。 但由于交换过多，酶的活性部位变形而失去活性，提高固定化酶活成为问题的关键。 n a 】( a m u r a 【2 2 】等采用多孔纤维衍生物作为载体，通过碳二亚胺法共价固定化爿印e 馏肼船 岫即，m u t a n t 引7 来源的菊粉酶，微酸条件下，载体的游离氨基与酶蛋白的羧基共价结合形 成酰胺键。4 0 下，5 ( w v ) 的菊糖溶液在流速为1 om l m i n 的柱式填充床反应器中连 续操作4 5d ，菊糖得到完全降解，但酶活产率仅为1 5 。y u n 【2 3 4 4 j 等以阴离子交换树脂为 载体固定化船e “如m d n a ss p 来源的内切菊粉酶生产低聚果糖，平均固定化产率为5 6 ，固 定化后的活性回收率5 9 。5 5 下连续操作1 5d 酶活几乎没有损失，低聚糖含量8 3 ，定 容产率达5 5g l l l ，固定化酶半衰期3 5d 。e s t e b a l l l 2 5 j 等使用交联剂戊二醛将尉“8 r 0 ”7 y c e s d 肘f d 删s 细胞包埋于海藻酸钡内，经过5 批生产后，残留酶活8 5 。此外，产菊粉酶酵 母细胞可以直接进行固定化用于高果糖浆生产，三毛榉木屑为优选载体，其颗粒直径2 5 4 m m o l l ，排泄系数为o 7 2 ，表观体积1 0 6 9c m 3 g ，水合容积2 4 6c m 3 g ，在管状反应器中 坚蜜查堂堡主堂垡丝苎 进行细胞固定化，用于固定化的酵母细胞密度1 2 1 0 9 细胞m l ，固定化产率为2 9 0 个细 胞幢( 载体) ，流速3l n l m i n ，定容产率9 0 1 0 0 l m ，底物转化率8 0 9 0 1 2 6 五”。 魏文玲【2 8 j 等以部分纯化的削妙忱加n 砂c e ss p y _ 8 5 产菊粉酶为研究对象，试验了四种 不同的凝胶包埋方法，结果表明开孔明胶法制得固定化酶的活性产率最高( 4 6 6 ) ；同时， 还采用d 2 0 l g m 大孔径阴离子树脂吸附交联法固定化该酶，制得的固定化酶活性产率6 2 ， 在1 7 6 l 填充床反应器中以1 7h _ 1 速度进料，5 0 ，4d 可将4 5 的菊糖1 0 0 降解，反 应器定容产率7 7 1 矿仙，半衰期2 7d ，果糖含量8 5 【2 9 】。顾天成【3 0 】等报道了克鲁维酵母 突变株所产菊粉酶的固定化研究，在分批式反应器中，当底物和固定化酶的体积比为3 5 ：1 时，2 5h 洋姜提取液水解率达9 2 4 ，产率为2 8 7 玑m ：在连续填充床反应器中，稀释 率为o 5k 1 时，转化率9 3 6 ，产率1 5 ，7g l ，h ，半衰期达1 1 0d 。 1 3 4 棉织物在固定化酶中的应用 随着固定化技术的不断发展，固定化载体的种类日益丰富。棉织物作为一种纤维基质， 表面含有大量羟基，容易改性而与酶共价结合，因而被应用于固定化酶技术。在填塞式酶 反应器中拥有许多理想的物理特性口i 】：高空隙率( 9 5 9 8 ) ，呈敞开结构利于酶吸附； 比表面积高，低压降，传质阻力极低，扩散限制较弱；强机械性能，即使高黏度底物酶反 应器也可在高流速下操作：价格低廉，产地不受限制等，这些优点使其具有广阔应用潜力。 然而，棉布通常具有较高的结晶度，酶固定在天然的棉布上缺乏活性位点，因此，棉纤维 常常需要使用活化剂进行预处理。 棉织物作为一种优良的载体，在固定化酶的应用不断有报道。美国、印度、加拿大等 国利用各种织物进行酶的固定化研究，具体情况见表1 3 。 表卜3 织物在固定化酶的应用 t a b l e1 3 c o m p 州s o no f e 叼m ei m m o b i l i z a t i o nb yv a r i o u s 舶r o l l sm a t r i c e s 载体酶p h力酶量 蛋然率酶鬻率参考文献 毛巾布 嘉；蓍 4 5 4 5 m g 儋 8 55 5 3 1 】 人造丝 b s a7 52 5m 眺一一 3 2 】 黄麻布转化酶一 2 0m m l 9 0一 3 3 棉布脲酶一 1 2m g 但o 5 6 一 3 4 ，鬻爨黧一 4 0 m 鲍 5 29 6 3 5 水性棉布糖苷酶 一 4 0 m g 3 29 6 p 5 j 法兰绒脲酶4 5 三雩署 5 6 3 6 聊藉嚣一0 3 m c m 2 o d 0 5 9 8 0 0 6 7 3 7 舌冀薯幕鎏 6 o o 5 m g m l 包布氧化酶 “吲“ o 0 7 5 0 1 n 。1 u c m 2 l 删 迄今为止，棉织物在菊粉酶的固定化研究中尚未见报道。菊粉溶解性差，空间位阻和 6 笫一章绪论 载体扩散限制效应的影吼使得菊粉酶的固定化研究和应用受到大大的限制，选择适用于 难溶性大分子底物，性能优异且可控的固定化载体显得尤为重要。因此，本文选择棉织物 作为菊粉酶的固定化载体。 1 4 立题背景及意义 果葡糖浆是近2 0 多年发展起来的新型甜味剂，甜度高、热量低、风味好；良好的保 温性，防干燥能力强；营养丰富，能直接供给人体热量，补充体液，代谢转化为肝糖的速 度比葡萄糖快，能在无胰岛素的情况下代谢成糖元，不会引起血糖值增加，适宜于糖尿病、 肝脏病、肥胖患者及婴儿、孕妇和老年人食用，在医药保健品、食品饮料、饲料领域的研 究和应用越来越广泛。 早在1 9 2 3 年，人们就利用酸催化水解菊糖生产果糖，这一方法需要大量能量和制酸 剂，还会产生不利的副反应，因此，人们将注意力转向酶法生产果糖。先进国家生产果 葡糖浆已用三酶法生产工艺：n 淀粉酶的液化、糖化酶的糖化和葡萄糖的异构化，然而 整个生产过程步骤繁琐，且果糖的得率低。八十年代，加拿大、法国、比利时、荷兰等国 的科学家开始了微生物酶水解菊粉制取果糖的研究，即将菊粉酶加入菊粉溶液，在一定条 件下，反应生成高果糖糖浆，果糖得率可达9 0 以上。与淀粉转化法和酸法相比，用菊粉 酶法水解菊粉制取果糖仅需一种酶，转化过程简单，而且产物较单一，果糖纯度高。 工业上一般多从菊芋根中提取菊糖，菊芋的分布较广，在我国南北各地均有栽培， 其生产条件粗放，适应性和抗病能力都很强，耐贫瘠，耐寒，耐旱，尤其适合在贫瘠的山 地和不适宜种植粮食作物的废弃土地上种植，不用施任何肥料，长势旺盛，种植简易，一 次播种几次收获，平均亩产可达1 2 0 0 k g 一5 0 0 0 k g ，产量高。菊芋块茎中菊糖的含量约为每 亩3 4 0 k g 一6 0 0 k g ，因此它来源丰富，价格便宜，且可以干法保存，便于全年生产f 3 。所以， 在我国开发菊糖产品有着重要的意义和很大的市场开发潜力。 我国高果糖浆工业化始于七十年代中期，基本与日本、美国同步进行，然而现在总产 量不及美国1 ，究其原因，在于我国缺乏生产高果糖浆的先进技术。我国具有十三亿人口， 这个潜在的巨大市场，为我国高果糖浆及纯果糖的生产提出迫切要求。 高果糖浆的生产大多采用游离酶水解法，通常的酶水解中酶稳定性差，难以回收和重 复使用，不适用连续自动化生产，酶利用率低，成本高。与游离酶相比，固定化酶呈现稳 定性高：产物与酶分离回收容易：可多次重复使用；酶的利用效率高，生产成本低等一系 列优点，引起了人们的关注，成为现代酶工程领域的研究热点。然而，菊糖溶解性较差， 由于空间位阻和载体扩散限制效应的影响，使得菊粉酶的固定化研究和应用受到大大的限 制。开发简便、温和，适用于难溶性大分子底物的固定化方法，选择性能优异且可控的载 体，以及固定化酶水解工艺的优化成为亟待研究的课题之一。为此，国家自然科学基金立 项研究酶法降解菊粉的高效制备技术，本课题即在此背景下提出。 江南大学硕：b 学位论文 1 5 本课题的研究内容 本文主要是在研究固定化菊粉酶方法及载体的基础之上，进一步研究了菊粉酶的固定 化条件，并对固定化菊糖酶的酶学性质进行了探讨，提出了固定化菊粉酶制备高果糖浆的 工艺。具体研究内容如下： ( 1 ) 菊粉酶固定化方法及载体的选择； ( 2 ) 固定化菊粉酶工艺条件的研究； ( 3 ) 菊粉酶的初步纯化及固定化菊糖酶酶学性质的研究； ( 4 ) 固定化菊粉酶水解菊糖制备高果糖浆的研究。 第二章固定化菊粉酶方法及载体的选择 2 1 引言 第二章固定化菊粉酶载体的选择 不同来源的菊粉酶其结构和特性各不相同，载体和方法的适用性不同，不可能有一种 普遍的载体和固定化方法，因此固定化载体的选择仍是固定化研究中首要解决的问题。菊 粉溶解性差，空间位阻和载体扩散限制效应的影响，使得菊粉酶的固定化研究和应用受到 大大的限制，选择性能优异且可控的固定化载体显得尤为重要。 目前国内外固定化菊粉酶的研究报道较多，其中大多使用戊二醛吸附交联的方法 盼4 0 ，4 l 】：载体比较广泛：如几丁质，大孔树脂，海藻酸钙【2 8 j ，明胶【2 8 】等，却未发现使 用棉织物固定化菊粉酶。棉织物呈现高空隙率( 9 5 一9 8 ) ，比表面积高，低压降，传质阻 力低，扩散限制弱，机械性能强等优点，即使高黏度底物也可在酶反应器高流速下操作”， 因此被选为菊粉酶的固定化载体。 本文在彭英云f 4 3 1 对菊粉酶的发酵条件研究基础之上，对固定化方法及织物进行了选 择，通过s e m 观察了固定化酶在纤维上的超微结构，并对固定化酶的回收再利用进行了初 步探讨。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料和试剂 2 2 1 1 实验材料 菌种无花果曲霉s k 0 0 4 接种于马铃薯培养基，4 保存； 菊糖江苏帝益药业粗品，培养基碳源； 比利时o r a f t i 公司g r 型，分析测定： 棉织物购自无锡市后西溪布料市场。 2 2 1 2 主要化学试剂 葡萄糖 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 无水葡萄糖 宜兴市第二化学试剂厂 酵母浸膏 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 蛋白胨 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 磷酸二氢铵 上海化学试剂总厂 氯化钠 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 硫酸镁中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 硫酸锌 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司 0 江南大学硕士学位论文 盐酸国药集团化学试剂有限公司 对甲苯磺酰氯上海松江茶花胶粘剂厂 吡啶 上海化学试剂公司 丙酮国药集团化学试剂有限公司 牛白蛋白b r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 3 。5 一二硝基水杨酸国药集团化学试剂有限公司 丙三醇中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 碳酸钠宜兴市化学试剂厂出品 硫酸铜上海虹光化工厂 酒石酸钾钠国药集团化学试剂有限公司 冰醋酸中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 无水乙酸钠中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 4 a 型分子筛国药集团化学试剂有限公司 吡啶与丙酮在使用前用4 a 分子筛处理( 称为干毗啶、干丙酮) 。 2 2 2 主要实验仪器 7 2 2 分光光度计 上海第三分析仪器厂 s h z 一8 8 台是恒温水域振荡器上海太仓实验设备厂 恒温培养箱上海实验仪器厂 s w c ji f d 超净工作台苏净集团安泰空气技术有限制造公司 h y g i 【回转式恒温调速摇瓶柜上海新星自动化设备有限公司 t 2 5 高度分散仪i k a l a b o r t e c h n i c ，德国 d e l t a 3 2 0 精密p h 计梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 电子精密天平p l 2 0 0 2梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 电子天平m p 2 0 0 b上海第一天平仪器厂 磁力恒温搅拌器 上海县曹行无线电元件厂 离心机l x j 一】i 上海医用分析仪器厂 g l 一2 0 b 冷冻离心机上海安亭科学仪器厂 s h b i i i 循环抽真空泵河南豫华仪器有限公司 u v l l o o 紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司 2 2 5 m l 超滤杯上海亚东核级树脂有限公司 截流分子量3 0 0 0 的超滤膜上海亚东核级树脂有限公司 2 2 3 主要实验方法 2 2 3 1 培养基 ( 1 ) 斜面培养基( g l ) ：马铃薯2 0 0 ，葡萄糖1 5 ，琼脂2 0 。 斜面种子培养方法：挑一环菌体于斜面培养基，3 0 培养3d 【4 4 】。 1 0 丝三翌堕里些堑塑竺互堡丝垡笪塑些堂 ( 2 ) 发酵培养基( g 几) ：菊粉2 5 ，酵母浸膏1 0 ，蛋白胨2 5 ，氯化钠5 ，磷酸二氢铵4 ， 硫酸镁o 5 ，硫酸锌o 1 ，p h6 5 。 摇瓶培养方法：2 5 0m l 的三角瓶中装液3 0m l ，1 2 1 灭菌1 5m i n ，每瓶接种量为一 环，3 0 、2 0 0r p m 摇瓶培养3d 。 2 2 32 胞外菊粉酶的制备 发酵液用快速定性滤纸