（环境科学与工程专业论文）化学生物絮凝污水处理工艺微生物种群结构分析.pdf

摘要 鉴定、检测技术，定性分析 ( 如特异性引物p c r - d g g e )和定量分析 ( 如f i s h 或实时p c r)的结合将会是今后获取活性污泥微生物种群分析的更有力的工具。 关键词:聚合酶链式反应、 套式引物p c r 、 变性梯度凝胶电泳、活性污泥、微生 物种群结构 ab s t r a c t abs tract t h e s t u d y i s a p a r t o f t h e p r o j e c t s u p p o r t e d b y t h e n a t i o n a l h i g h t e c h n o l o g y r e s e a r c h a n d d e v e lo p m e n t p r o g r a m o f c h i n a ( 8 6 3 p r o g r a m ) n o . : 2 0 0 2 a a 6 0 1 3 2 0 , o p t i m i z a t i o n r e s e a r c h o n c h e mi c a l a n d b i o l o g i c a l f l o c c u l a t i o n - s u s p e n d e d p a c k e d b e d p r o c e s s . i n t h i s t h e s i s , a i m i n g e m p h a t i c a l l y a t t h e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c h e m i c a l a n d b i o l o g i c a l fl o c c u l a t i o n w a s t e w a t e r t r e a t m e n t p r o c e s s , t h e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e o f t h e p r o c e s s w a s r e s e a r c h e d w i t h m o l e c u l a r b i o l o g i c a l m e t h o d , s u c h a s p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( p c r ) a n d d e n a t u r t i n g g r a d i e n t g e l e l e t r o p h o r e s i s ( d g g e ) . b a s e d o n t h i s , t h e d i f f e r e n c e s o f t h e m i c r o b i a l c o m m u n i ty s t r u c t u r e b e t w e e n t h e c h e m i c a l - b i o l o g i c a l fl o c c u l a t i o n p r o c e s s a n d t h e c h e m i c a l c o a g u l a t i o n p r o c e s s , 隅are t h e t r a d i t i o n a l a c t i v a t e d s l u d g e t r e a t m e n t p r o c e s s , a / o d e n i t r i f i c a t i o n p r o c e s s s t u d i e d p r e l i mi n a r i l y . t h e r e s u l t s s h o w t h a t s o m e m i c r o o r g a n i s m s e x i s t in g i n a c c l i m a t e d s l u d g e e l i m i n a t e d w h e n t h e c o a g u l a n t w a s a d d e d t o t h e r e a c t o r . t h i s i n d i c a t e s t h a t t h o u g h t h e s e m i c r o o r g a n i s m s c a n m e t a b o l i z e t h e o r g a n i c s u b s t a n c e w i th d i s s o l v e d o x y g e n i n t h e w a s t e w a t e r , t h e y c a n t a d a p t t o t h e b i o l o g i c a l a c t i o n i n t h e c h e m i c a l - b i o l o g i c a l fl o c c u l a t i o n s y s t e m. c h a n g e s t a k e p l a c e i n t h e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e w h e n t h e c h e m - b i o fl o c c u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s a r e u n d e r t h r e e d i f f e r e n t o p e r a t i o n p a r a m e t e r . t h e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e i n t h e r e a c t o r w i t h g r e a t s t a b i l i t y a n d a b s o r p t i o n d i s t r i b u t i o n c a n a d a p t i t s e l f t o t h e c h a n g e s o f t h e e n v i r o n m e n tth e i mp a c t b a c t e r i a t h e t h r e e p a s s a g e o f t h e r e a c t o r a r e v e r y e q u a b l e d u r i n g t h e s a m e o p e r a t i n g c o n d i t i o n . t h e r e a r e a b u n d a n t s p e c i e s i n t h e r e a c t o r , b u t t h e q u a n t it y o f t h e m i c r o o r g a n i s m i n t h e c h e m - b i o . fl o c c u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s a r e m u c h m o r e t h a n t h e c h e m i c a l c o a g u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s . t h e r e m o v a l e f f i c i e n c y o f t h e p o l l u t a n t i n t h e c h e m - b i o . fl o c c u l a t i o n r e a c t o r a r e d i s t in c t l y h i g h e r t h a n t h e c h e m i c a l c o a g u l a t i o n r e a c t o r d u e t o t h e b i o l o g i c a l a c t i o n ah s t , a c l a b u n d a n c e o f b a c t e r i a s p e c i e s w it h s t a b l e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e a r e i n t h e s u s p e n d e d p a c k e d b e d p r o c e s s , i n c l u d i n g a l o t o f a m m o n i a o x i d i z i n g b a c t e r i a p l a y i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e m o v a l o f a m m o n i a n i t r o g e n . t h e a m m o n i a o x i d i z i n g b a c t e r i a c a n s u s t a i n a s t a b l e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e w h i c h m a k e s t h e s u s p e n d e d p a c k e d b e d c a n r e s i s t t h e s h o c k i n g l o a d a n d r e m o v e t h e a m m o n i a n it r o g e n w it h h i g h e f f i c i e n c y c o m p a r i n g w i t h s e v e r a l t r a d i t i o n a l w a s t e w a t e r t r e a t me n t p r o c e s s , t h e t h e m - b i o . fl o c c u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s h a s d i f f e r e n t m i c r o b i a l c o m m u i t y s t r u c t u r e a n d t h e m o s t a b u n d a n t s p e c i e s , t h e b i o l o g i c a l a c t i o n m e c h a n i s m m a y h a s g r e a t d i s t i n c t i o n . t h i s s t u d y c l e a r l y s h o w s t h a t i t i s p o s s i b l e t o o b t a i n a v i e w o n a c t i v a t e d s l u d g e b a c t e r i a l c o mmu n i t i e s i n t h e t h e m- b i o . fl o c c u l a t i o n r e a c t o r wi t h t h e mo l e c u l a r b io lo g i c a l m e t h o d s s u c h a s p c r , g r o u p - s p e c i f i c p c r a n d d g g e . i n t h i s s t u d y , i t i s t o o s m i p l e t o a n a l y s e o n l y f o u r b a c t e r i a s p e c i e s o n l y a c c o r d i n g t o t h e t y p e o f t h e i n fl u e n . i n t h e f u t u r e , w h e n s p e c i f i c p r i m e r s w i l l b e d e s i g n e d f o r a n i n c r e a s i n g n u m b e r o f g r o u p s , a m o r e c o m p l e t e p i c t u r e o f b a c t e r i a l c o m m u n i t i e s w i l l b e o b t a i n e d . c o m b i n a t i o n o f t r a d i t io n a l m i c r o o r g a n i s m m o n i t o r t e c h n i q u e s a n d q u a l i t a t i v e ( s u c h a s d g g e w i t h g r o u p - s p e c i f i c p r i m e r s ) a n d q u a n t i t a t i v e t e c h n i q u e s ( s u c h a s f i s h o r r e a l t i m e p c r ) w o u ld b e a n e x t s t e p i n a c q u i r i n g a g o o d d e s c r i p t i v e t o o l f o r m i c r o b i a l c o m m u n i t y a n a l y s i s o f a c t i v a t e d s l u d g e s . k e y wo r d s : p c r ; n e s t e d p c r ; d g g e ; a c t i v a t e d s l u d g e ; m i c r o b i a l c o m m u n it y s t r u c t u r e 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、 保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印 刷本和电 子版，并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以及提供 木学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版; 在不以赢利为目 的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 之 巧 2 0 0 5年 3 月 1 6 日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中己经注明引用的内容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 己公开发表或者没有 公 开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均己在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签 各边 奸 2 0 0 5 年 3月 1 6 f i 第帝 综述 第一章 综述 1 . 1课题研究的背景、意义 化学生物絮凝工艺是近年来发展起来的一种新型污水处理工艺， 它根据化学 混凝处理工艺和生物絮凝处理工艺的各自 特点， 将两者有机结合起来， 达到在很 短的时间内实现去除主要有机污染物和总磷的目的， 且污泥产量少、 运行成本和 投资费 用均较低i = 1由于 污水在整个系统中的水力 停留 时间 较短 所以 化学生 物絮凝工艺对于氨氮的去除效果较差， 而悬浮填料床工艺对氨氮却有很好的去除 效果， 将两种工艺结合起来， 就能形成一个高度集成的、 高效的物化一生化组合 工艺， 达到高效去除废水中有机污染物和氮、 磷的目的， 是一 种适合我国大部分 地区的城市污水处理的一种新工艺。 在这样一个化学生物絮凝一悬浮填料床组合工艺中， 研究在不同工况条件下 微生物群落结构和污染物去除的关系， 考察化学生物絮凝污水处理工艺的微生物 种群结构与传统活性污泥法处理工艺的区别， 能够使人们更深入地了 解化学生物 絮凝污水处理工艺的微生物作用，从而更有目的地进行工艺的优化研究。 传统的显微镜观察和培养分离技术可分离取得单一菌株进行鉴定分析， 但是 这种方法受到微生物可培养性的限制， 实际分离出的菌株往往只占样品中微生物 种类很小的一部分。同时对于环境样品的培养分离周期一般较长，工作量大。 应 用p c r - d g g e 方法对坏境微生物进行研究， 就可以不经过培养， 直接从样品里 提 取细菌的d n a 或r n a ，进行p c r - d g g e ，并且可以 对一些条带进行测序比对出 其种群， 通过这种方法能够直接了解样品中细菌分布结构， 并能大致比较相同条 件下单一菌群的生物量。目 前， 将分子生物学技术应用 于 环境领域的研究己成为 国内外研究的热点。 1 .2国内外的研究现状与发展动态 1 . 2 . 1用于环境微生物的分子生物学技术 1 . 2 . 1 . 1概述 污水处理厂中的活性污泥是由数量庞大，种类丰富的微生物构成的絮ik结 构， 是污水处理过程的主要载体。 其中的某些微生物种群也是引起污泥膨胀、固 液分离效果差、 气泡等问题的罪魁祸首。因而， 研究活性污泥微生物种群，了解 第帝 综述 第一章 综述 1 . 1课题研究的背景、意义 化学生物絮凝工艺是近年来发展起来的一种新型污水处理工艺， 它根据化学 混凝处理工艺和生物絮凝处理工艺的各自 特点， 将两者有机结合起来， 达到在很 短的时间内实现去除主要有机污染物和总磷的目的， 且污泥产量少、 运行成本和 投资费 用均较低i = 1由于 污水在整个系统中的水力 停留 时间 较短 所以 化学生 物絮凝工艺对于氨氮的去除效果较差， 而悬浮填料床工艺对氨氮却有很好的去除 效果， 将两种工艺结合起来， 就能形成一个高度集成的、 高效的物化一生化组合 工艺， 达到高效去除废水中有机污染物和氮、 磷的目的， 是一 种适合我国大部分 地区的城市污水处理的一种新工艺。 在这样一个化学生物絮凝一悬浮填料床组合工艺中， 研究在不同工况条件下 微生物群落结构和污染物去除的关系， 考察化学生物絮凝污水处理工艺的微生物 种群结构与传统活性污泥法处理工艺的区别， 能够使人们更深入地了 解化学生物 絮凝污水处理工艺的微生物作用，从而更有目的地进行工艺的优化研究。 传统的显微镜观察和培养分离技术可分离取得单一菌株进行鉴定分析， 但是 这种方法受到微生物可培养性的限制， 实际分离出的菌株往往只占样品中微生物 种类很小的一部分。同时对于环境样品的培养分离周期一般较长，工作量大。 应 用p c r - d g g e 方法对坏境微生物进行研究， 就可以不经过培养， 直接从样品里 提 取细菌的d n a 或r n a ，进行p c r - d g g e ，并且可以 对一些条带进行测序比对出 其种群， 通过这种方法能够直接了解样品中细菌分布结构， 并能大致比较相同条 件下单一菌群的生物量。目 前， 将分子生物学技术应用 于 环境领域的研究己成为 国内外研究的热点。 1 .2国内外的研究现状与发展动态 1 . 2 . 1用于环境微生物的分子生物学技术 1 . 2 . 1 . 1概述 污水处理厂中的活性污泥是由数量庞大，种类丰富的微生物构成的絮ik结 构， 是污水处理过程的主要载体。 其中的某些微生物种群也是引起污泥膨胀、固 液分离效果差、 气泡等问题的罪魁祸首。因而， 研究活性污泥微生物种群，了解 第 一 章 绍述 其细菌种类和数量， 认识细菌群落的稳定性和研究一些功能菌在降解有毒有害物 质过程中的作用，对提高活性污泥处理污水的效果具有重要意义。 然而， 由于研究方法的限制各种污染物处理工艺中微生物种群的研究仍然 停留在传统的纯菌培养阶段， 这种利用特定培养基对特定微生物的培养方法可能 会导致相当大的误差而无法将微生物种群真实的定性出来。 再加上如选择性培养 基计数等定量方法的不准确性， 使得现今对于处理工艺中微生物对 一 处理效果关系 性的研究仍处于 “ 黑盒子”阶段。 近年发展起来的分子生物学技术很好地解决了这一问题， 该技术利用微生物 遗传演变时遗传讯息1 6 s r d n a 的保守性和差异性来进行微生物细菌种类的鉴定 和定量分析。如此一来， 各种处理程序中微生物种类、 数量与处理效率间的模式 关系便可加以建立。 整个分析流程大体为:采集到的活性污泥样品进行预处理后，进行d n a 提 取分离和纯化，进行p c r 扩增以得到大量1 6 s r d n a 分子，扩增的d n a 片段进t 1 群落指纹分析 ( d g g e 等) ， 建立1 6 s r d n a 资料库， d n a 测序及微生物分类鉴定， 之后还可进行核酸探针的设训及微生物的定量分析。 目前， 国外该技术在活性污泥、 生物膜种群和数量分析上的研究和应用已有 大量报道，国内较少。 t i m o t h y 等人用p c r - d g g e 方法， 研究了 在处理制药废水的七段生物好氧反 应器中的细菌群落稳定性， 发现在功能稳定的废水处理生物反应器中， 在l i : i运 行条件下有着稳定的微生物群落结构， 并且在进水水质发生改变的情况 ， 微生 物群落能够随之发生变化，以 维持良 好的出水水质13 1 k a z u y a w a t a n a b e 等人研究了 降解苯酚的 活性污泥中的细菌群落情况。从降 解苯酚的活性污泥中提取d n a， 进行p c r 扩增， 通过温度梯度凝胶电泳分析扩增 片段后，得到两条主要1 6 s r d n a 条带，其中含有两条主要的大片段多组分苯酚 轻化酶条带， 并测定这些条带的核酸序列; 同时采用直接平板培养方法、 分批培 养富集后平板培养的方法和恒化培养富集后平板培养的方法进行菌种分离， 通过 动 力 学 等 的 分 析 得 到 活 性 污 泥中 降 解 苯 酚 的 主 要 菌 种v a l iv o r a x p a r a d o x u s 1 1. s u s a n n e l o g e m 。 等人用p c r - d g g e - f i s h( 荧光原 位杂交) 技术 研究 无污 泥停留的硝化反应器中的微生物群落情况，结果表明反应器中主要优势菌群为 染章 综述 n . e u tr o p h a , 通过1 6 s r r n a 文 库检索到次优势菌群娜 一 。 t e o b a c t e r i a ， 第只优势 菌 群 为 c y t o p h a g a l f l e x i b a c te ; 门 ic i 李志岗等人用p c r - 限制性片段长度多态性及其统计分析的力 一 法，研究p y 水 处理池中环境微生物遗传多样性， 结果表明直接排放池污水坏境中细菌种群优势 种单一，水质较好的间接排放池细菌种群比 较丰富i i 谢冰等人采用基于1 6 s r d n a 序列分析方法，分析了未受重金属驯化和受重 金属驯化的两类活性污泥在重金属作用 优势菌种和多样性的变化， 结果显小木 驯化的活性污泥系统多样性减少但优势种的变化微小， 而驯化系统优势菌种有较 大的变化， 但多样性基本不变。 这一结果证实驯化有助于提高微生物对重金属的 抗 性 !了 。 1 .2 . 1 .2 d n a 提取和纯化 1 ) 样品的预处理 用于分析的土壤样品，在采集后可以直接进行d n a 提取，但是活性污泥样 品通常是泥水混合物的形式， 为了 达到高度的细胞裂解率， 必须对样品进t 1 - 顶处 理。可以采用的预处理包括以下 几种: ( 1 ) 高 速离 心， 通常 离 心 速 度 在 2 5 0 0 - - 8 0 0 0 g 左 右， 离 心时间 5 - 1 0 m in iu ) ， 弃 上清液，将沉淀部分溶于无菌水。 ( 2 )玻璃珠击打， 经过离心后的污泥中加入数粒灭菌玻璃珠 ( 直 径根据需要 选择在0 . i - - 2 m m 之间) ， 在漩涡混合器上或人为摇动几分钟， 这能够打开活性污泥 的絮凝，便于后面的细胞破碎和裂解 n , i o ( 3 )有机物去除， 在进行总d n a 提取之前， 向污泥样品中 加入非离子活性剂、 丙 酮、石油醚等物质并且低速搅拌、离心，使污泥当中的有机物的以去除，以免 影响后续的d n a 提取和p c r 扩增过程i h l 2 ) d n a 的提取 d n a 通常与蛋白质及部分r n a 结合成染色体存在，因此分离核酸首先要破 碎细胞，然后采用各种方法将d n a 中的蛋白质、糖类、脂类和欲类等物质去除 以 纯化d n a 。 在提取过程中， 要保证d n a 不被内 源或外界污染的d n a s e 降解以保 持d n a 的完整性，并要排除其他分子的污染。 常用的细胞破碎 ( 在缓冲液中)有以下几种方法。 第 一 帝 综述 ( 1 )机械法: 包括用组织捣碎机、玻璃匀浆器、 研钵研磨， 但是由于 机械法 在操作过程中不够温和， 容易使d n a 被机械破碎， 所以这种方法多用于小质粒分 离，而在研究活性污泥过程中使用较少。 ( 2 )物理法: 反复冻融法 ( - 1 5 0c - 2 0 0c ，主要用于动物细胞) t il l 、 冷热交替 法 9 0 一 冰冻，主 要用于 细菌病毒) ” 、 超声波处理法 ( 多用于微生物) ” 。 ( 3 )化学及生化法:自 溶法 ( 在一定的条件下加防腐剂，自身酶系破坏细胞， 因时间长不易控制，一般少用) 、溶菌酶 ( 破坏细菌细胞壁) 、纤维素酶 用于植 物 细 胞 ) 表 面 活 性 剂( s d s 和 t r it o n x - 1 0 0 等 ) u .is :ca 各种方法的提取效率因细胞壁结构、细胞大小、 d n a 分子量等而不同 般来la, 温和的提取方法如超声波、 溶菌酶易造成细胞裂解不完个 损失微生物 种类的问题;而较剧烈的提取方法如强烈的玻璃珠击打，又易造成d n a 片段的 破碎1 5 。因此， 根据所分析活 性污泥的 特点， 反复 进行提取方法的检验和修正 是极为必要的。 3 ) d n a 的纯化 无论采取哪种方法提取d n a ，都有不同程度的蛋白质、多糖以及 一il l 豁类 污染，因此进一步纯化d n a 是非常必要的，常用的方法有有机溶剂抽提、沉淀、 梯 度 离 心 法 、 用 酶 温 和 消 化 杂 质 等 1 13 引 。 1 . 2 . 1 . 3 p c r 反应 1 ) p c r 的原理 经上述步骤提取到的d n a 分子浓度相当低，以至于无法直接进行后续分析， 若要得到足够量的d n a 浓度则需要提取相当大量的样品才可，这在实际应用i 相当 耗时且不经济。然而， 这个缺点可藉由 聚合 酶链式反应 ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n , p c r )的实验过程解决。p c r 是一种将原样品d n a 一直复制的步骤， 藉由 加入适当的两段寡核普酸作为反应的引 物 p r i m e r ) 、四种脱氧核昔三 磷酸 d n t p , d n a 聚合酶等反应物，利用机器反复的升温降温，将上面提取到的d n a ( 称为模板d n a)片段精确扩增。 p c r 反应分变性、退火、延伸三步。反应时，首先在引物d n t p 参与下对模 板d n a 进行加热变性。随后，将反应混合液冷却至某一温度，在这一温度下引 物与它的靶序列发生退火。此后退火引物在d n a 聚合酶作用下得以延伸。如此 第一令 f 5 述 反复进行变性、 退火和延伸的这种循环。 由于这种扩增产物是以指数形式积累的， 经2 5 - 3 0 个循环后， 扩增倍数可达l o b o 2 ) p c r 引物的设计选择 进行p c r 反应时， 可随着目的的不同而设计出 针对不同特异性的引物， 也就 是说，藉山不同的引物，可针对不同微生物分类层级进行p c r 反应， 其p c r 产物 可为具有某科、 某属或某种微生物特性的d n a 。以硝化细菌为例活性污泥中 可进行硝化反应的微生物很多，通称为硝化细菌或氨氧化细菌 ( a m m o n i a o x i d iz in g b a c t e r i a ) ， 在引 物的设计上 便可针对这些硝化细菌其1 6 s r d n a 所共同 保 留的d n a 序列设计，使得进行p c r 反应时可仅针对硝化细菌进行双股d n a 1 1 链 变性) 一引物结合 ( 退火) 一延伸的重复反应， 其p c r 产物中所有的d n a 便皆 为具有硝化细菌特性的菌种d n a 。因此，在整个p c r 反应中引物的设计决定了 p c r 反应的特异性和成败与否。 引物是与扩增d n a 片段两端互补的寡核昔酸，为单链d n a 片段。引物是 p c r成功的关键， 引物与模板退火的温度和所需的时间取决于引物的碱基组成、 长度和溶液中引物的浓度。一般引物含有1 5 - 3 0个碱基，碱基组成为g + c %占 5 06 0 %，主要根据研究目的的不同而设计。p c r扩增时，是从引物的3 端开始 按照5 - - 3 的方向延伸，因此引物3 端的碱基必须严格与模板碱基h _ 补，而对5 端要求则不如3 端严格，有时候还可在5 端加上特殊的序列使扩增后产物作为探 针用于核酸检测。 一般而一言， 作p c r 引物用的寡核若酸至少应含1 6 个碱基，引物长度愈长，其 p c r 的特异性愈佳，1 8 - 2 4 个碱基是最具特异性的。根据生物基因组大小，最短 长度在几个碱基范围内变动， 最好在特异性允许的范围内寻找安全性。 每增加 个碱基，引物特异性提高4 倍。为了防止两对引物内的同源性，应特别注意引物 不能互补，尤其是3 末端，引物间的互补将导致不想要的引物二聚体的出现， 这 样获得的p c r 产物其实是引物自身的扩增。 这将会在引物二聚体产物和天然模板 之间 产生 竟争 p c r 状态， 从而影响 扩增成 功 1a 1 4 1 a i l 种在环境分析领 域常用的引 物见下表1 - 1 0 第一章 综述 表1 - 1环境分析领域常用的p c r 引物 k 细 la放线菌酸杆菌氨氧化细9。 变形月 变形卵囊仄氧细 菌纲菌纲a l 引物 p 6 3 f r1 3 7 8 r p 3 3 8 f p 51 8 r f 2 4 3 r1 3 7 8 r 3 1 f r1 3 7 8 r ct 01 8 9 f ab ct o 1 8 9 f c ct 06 5 3 r f 2 0 3 a k 1 37 8 p 3 3 8 f b e t4 2 a mb9 a rl 3 7 8 r 参考 文献 1 1 6 1 1 7 1 1 1 7 , 1 8 1 1 9 1 1 7 , 2 0 1 2 1 11 2 3 1 呼z2 3 ) d n a 聚合酶 d n a 的体外扩增是由 耐热的 d n a 聚合酶完成的， 通常是t a q d n a 聚合酶， t a q 酶是从生存在热泉水中的耐热的 水生嗜热菌内分离得到的， 可在高 温 ( 7 2 -c ) 下催化d n a 合成，并且加热至9 5 不会变性，使p c r 反应得以自 动化。 其 他常 用的高 温 d n a 聚 合 酶 有 v e n t , d e e p v e n t , t l i , p w o , m1, u i t m a 等， 这些酶不仅有高的热稳定性，还能扩增大于1 2 k b 的模板d n a ,史上要的是具有 校正 功能，因此比 t a g d n a 聚合酶具有更高的保真度， 尤其是p f u d n a 聚合酶其 有 超 强 的 纠 错 功 能 1 1 11 目前，这些d n a 聚合酶已经被商品化。 4 ) 缓冲液 用于 p c r 的 标准缓冲液 含: 1 0 - - 1 5 m m o l / 1 t r i s -h c ) ( p h 8 .3 ， 室 温) ， 5 0 m m o l / i k c i , 1 .5 - -2 m m o l/ l m 9 c i z ， 提 供 d n a 合 成 反 应所 需 p h , 离 子 强 度 等 环 境。 m g z l 的存在极为重要， 它能影响引物退火的程度、 模板及p c r 产物的解链温度、 产物 的特异性、酶的活性及精确性，因此反应体系中小可含有高浓i的鳌合剂如 e d t a ，不可含有高浓度的带负电荷的离子基团如磷酸根等。 5 ) 脱氧核f - 三磷酸 ( d n t p ) d n t p 液包括d a t p , d g 丁 p , d c 丁 p , d 丁 丁 p ，在饱和浓度下使用，参与p c r 反 应。但d n t p 是反应中磷酸根的主要来源，其浓度的任何变化都将影响到磷酸根 的浓度，所以在设计反应体系中应予以注意。 6 ) 模板d n a 模板对p c r的影响主要有两个方面: ( 1 ) 模板d n a的量: 模板d n a的量太 多， 易于两条模板d n a单 链重新结合， 会使扩增反应失败: ( 2 ) 模板的纯度: 一 b 第一章 综述 般来说，p c r 对模板纯度的要求不高，但在模板d n a溶液中，小能有蛋白质、 核酸酶、尿素、十二烷基磺酸钠、e d t a等影响扩增反应的物质存在。对一j 几 个 别成分复杂的环境样品，提取的总d n a 需用专门的纯化试剂盒纯化后即可用于 p c r 扩增，或将模板稀释1 0 - 1 0 0 倍后使用。 1 . 2 . 1 .4变性梯度凝胶电泳技术 群落指纹( c o m m u n i t y f i n g e r p r i n t ) 是指一个混合菌种经电泳后所呈 现的分 布 情形。所谓电泳，是指在凝胶 ( g e l )中 通入电 场，由 于d n a 分子带负电，因 此会往电 场中正极的方向 移动，而g e ! 是一 种具有网 状结构的 物质， 不同 大小的 d n a 分子在g e l 中移动的速度也会因 此而不同，分子 量小的移动比较快，分子 量 大的移动比较慢，因此便可区分出不同分子量的d n a 。不同的样品在经过相同 的处理 ( 如d g g e ) 之后， 经电泳后所呈现的相对位置可能不同，反之， 相同样 品经电泳后的相对位置则相同， 因此， 便可据此区分两未知样品之间菌种差异的 程度。变性梯度凝胶电 泳法 ( d e n a t u r in g g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s e s ) 是一 种常 用的群落指纹分析方法。 d n a 为一双股结构，其两单股间是由互补的碱基所形成的氢键所结合而成， a 与t 之间有二个氢键， g 与c 之间则有二个氢键。 如果加入尿素等可使d n a 氢键 打断 ( 即变性)的物质，则由于a 7 与g c 二种互补d n a 的结合力不同，将会造成 不同的变性效果，由于两种菌种其序列a t 键与g c 键的位置不同、数量不同，其 变性程度也不同，即双股d n a 遭到开链的程度及形状也不相同，因此电泳时两 条序列穿过网状结构的难易度便因而不同，而这种难易度是依d n a 序列遭变性 的程度不同来区分的。 如果在电泳过程中加上变性程度的梯度， 则更能使这种差异性加大， 进而降 低不同样品但有相同变性程度的机率。 在d g g e 电泳法中不同位置所呈现的亮带 表示不同的1 6 s r d n a 序列，这是一段经p c r 反应后的完整序列，因此，不同位 置的亮带便对应为一单 一 菌种。 然而，由于分辨率的关系， 此亮带需切 下 再重复 做p c r , d g g e 试验方能加以纯化。如此，将经纯化的d g g e 亮带进行测序便能 得知其种群的组成。 1 .2 . 1 . 5 d n a 测序、1 6 s r d n a 文库的建立及微生物分类鉴定 将纯化的d g g e 亮带置入水中以后，其d n a会再度溶解出来，之后，再纤 第章 综述 由p c r 反应将溶解于水中的d n a 进行扩增反应，以获得高浓度的1 6 s r d n a 接 着便可进行以1 6 s r d n a 为序列的微生物测序及1 6 s r d n a 文库的建立。 为了使回收的d n a 序列具有代表性， 通常需要选取至少1 0 0 个左右的单菌落 进行序列回收。回收的序列最好全部进行测序，以便进行后续微生物分类分析。 但有时限于测序费用， 不能将回收的全部序列测序， 则需要先进行筛选， 剔除重 复序列，仅将代表性的、丰度较大的序列测序。序列筛选一般采用前面提到的 d n a 指纹技术 ( 如d g g e )或蓝白斑筛选等。 1 .2 .2微生物分类学研究进展 生物进化或生命的系统发育学一直是人们所关注的热点， 也是生命科学的中 心。 1 9 7 7 年w o e s e 的 r r n a 生命树研究， 使得细菌进化研究出 现了 包括了古菌 这个 “ 第三生命”的新的曙光。wo e s e 在1 9 8 7 年将细菌域中可培养的细菌分为1 1 个类 群 12 4 1 ， 包 括: 栖 热 袍菌目 ( t h e r m o to g a: 绿 色 非 硫细菌 ( g r e e n n o n - s u 晌r b a c te r i a ) ; 奇异球菌 ( d e i n o c o c c i ) ;螺旋体群 ( s p i r o c h e t e s ) :绿色硫细菌 ( g r e e n s u l / u r b a c t e r i a ) ; 拟杆细菌/ 黄质菌属 ( b a c t e r o i d e s / f l a v o b a c t e r i a ) ; 浮霉状菌 ( p l a n c t o - m y c e s ) ; 衣原 体菌 ( c h la m y d i a e ) ; 革兰氏 阳 性细菌群 ( g r a m p o s i t i v e b a c t e r i a ) ; 蓝 细菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) ;紫细菌 ( p u r p l e b a c t e r i a ) ( 见图1 - 1 ) 0 图 1 - 1 基于 1 6 s r r n a 序列比 较 而构成的真 细菌系统发育 树 g a l 1 9 9 8 年n , r . p a c e 等根据环境中的1 6 s r r n a 序列的多样性，认为细菌域可能 由 3 6 或 4 0 多 个大 纲组成12 1见图1 - 2 ) ， 其中 可 培养的 细菌群又 增加了 热 脱硫杆菌 第章 综述 由p c r 反应将溶解于水中的d n a 进行扩增反应，以获得高浓度的1 6 s r d n a 接 着便可进行以1 6 s r d n a 为序列的微生物测序及1 6 s r d n a 文库的建立。 为了使回收的d n a 序列具有代表性， 通常需要选取至少1 0 0 个左右的单菌落 进行序列回收。回收的序列最好全部进行测序，以便进行后续微生物分类分析。 但有时限于测序费用， 不能将回收的全部序列测序， 则需要先进行筛选， 剔除重 复序列，仅将代表性的、丰度较大的序列测序。序列筛选一般采用前面提到的 d n a 指纹技术 ( 如d g g e )或蓝白斑筛选等。 1 .2 .2微生物分类学研究进展 生物进化或生命的系统发育学一直是人们所关注的热点， 也是生命科学的中 心。 1 9 7 7 年w o e s e 的 r r n a 生命树研究， 使得细菌进化研究出 现了 包括了古菌 这个 “ 第三生命”的新的曙光。wo e s e 在1 9 8 7 年将细菌域中可培养的细菌分为1 1 个类 群 12 4 1 ， 包 括: 栖 热 袍菌目 ( t h e r m o to g a: 绿 色 非 硫细菌 ( g r e e n n o n - s u 晌r b a c te r i a ) ; 奇异球菌 ( d e i n o c o c c i ) ;螺旋体群 ( s p i r o c h e t e s ) :绿色硫细菌 ( g r e e n s u l / u r b a c t e r i a ) ; 拟杆细菌/ 黄质菌属 ( b a c t e r o i d e s / f l a v o b a c t e r i a ) ; 浮霉状菌 ( p l a n c t o - m y c e s ) ; 衣原 体菌 ( c h la m y d i a e ) ; 革兰氏 阳 性细菌群 ( g r a m p o s i t i v e b a c t e r i a ) ; 蓝 细菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) ;紫细菌 ( p u r p l e b a c t e r i a ) ( 见图1 - 1 ) 0 图 1 - 1 基于 1 6 s r r n a 序列比 较 而构成的真 细菌系统发育 树 g a l 1 9 9 8 年n , r . p a c e 等根据环境中的1 6 s r r n a 序列的多样性，认为细菌域可能 由 3 6 或 4 0 多 个大 纲组成12 1见图1 - 2 ) ， 其中 可 培养的 细菌群又 增加了 热 脱硫杆菌 第 一 章 综述 属(