（作物遗传育种专业论文）大豆脂氧酶缺失突变基因的遗传分析与定位.pdf

摘要 大豆脂肪氧化酶( 1 i p o x y g e n a s e ，e c l 1 3 1 1 1 2 ；简称脂氧酶，l o x s ) 主要存在 于大豆种子中，包括l o x l ，l o x 2 ，l o x 3 三种同工酶，分别受基因l x l ，l x ? ，l x s 控 制，其催化氧化反应产生豆腥味和苦涩味，是影响大豆食用品质、储藏品质和加工 品质的重要抗营养因子之一。突变基因h ，詹2 ，奶则会使豆腥昧降低甚至完全消 失。因此，用分子标记对三个基因进行定位，对辅助前景选择( f o r e g r o u n ds e l e c t i o n ) ， 从两加速l o x s 全缺失优良大豆品科的培育进程具有重要的理论和实践意义。 本研究以河北省油料作物研究所配置的5 个杂交组合的f 2 群体为材料，应用改 进的1 e f p a g e ( i s o e l e c t i cf o c u s i n gp o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，等电聚焦凝 胶电泳) 技术逐粒检测，鉴别其缺失类型。分析3 个基因的遗传连锁关系。通过b s a 法( b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ，分离体分组混合法) 进一步筛选及，腑，l x e l x e 两 对基因附近的s s r 标记，进行精细定位。同时对h 协进行初步定位。主要结果如 下： 组合0 1 2 4 ，0 t 3 9 ，0 1 5 5 和0 1 3 4 的l o x l 与l o x 3 一样，也有a ，b 两个亚基。 l o x l 缺失时仅1 a 缺失，1 b 保留且不变淡。组合0 1 2 9 比较特殊，只有个亚基， 缺失时，整条带全部消失。l o x 3 缺失时的表现与l o x l 恰好相反，3 b 缺失，3 a 无变 化。 缺失l o x 2 时，l o x 2 并不完全消失，只是酶带变淡，l o x l 在不同组合中有不同 的表现：组合0 1 3 9 ，0 1 5 5 ，0 1 3 4 的1 a ，1 b 相距较近，l o x 2 缺失时，1 b 不变，1 a 向上迁移一段距离；组合0 1 2 4 的1 a ，l b 相距较远，l o x 2 缺失时，1 8 ，l b 均无变化； 组合0 1 2 9 l o x l 的整条酶带全部迁移。 l x l ( l x 3 ) 和l x l ( 幻) 为显隐性等位基因；l x 2 1 l x 2 是对共显性等位基因；厶f 和l x j tl x 2 和l x 3 的分离符合9 ：3 ：3 ：l 的自由组合规律，厶，和l x 3 ，l x ? 和厶j 分别 处于不同连锁群上，基因间无互作关系。 编码l o x 蛋白的基因并不位于大豆种子蛋白q t l s 集中聚集的e 和1 连锁群上 定位到连锁群i 上的e s t 标记p b l t 0 0 2 的确只是和l x 3 相似而已。 初步获得与l x 2 基因紧密连锁的s s r 标记s a t 一4 1 7 。 关键词：大且- - j 】日t ：a 肪氧化酶：遗传分析：基因定位：i e f p a g e ；共显性；s s r g e n e t i ca n a l y s i sa n dm a p p i n go fs o y b e a n l i p o x y g e n a s e - n u l l m u t a t i o ng e n e a u t h o r ：y a hc a i x i a m a j o r ：c r o pg e n e t i c s a n db r e e d i n g a d v i s o r ：r e s e a r c h e rz h a n gm e n g c h e n p r o f e s s o rm a z h i y i n g a g r i c u l t u r eu n i v e r s i t yo f h e b e ib a o d i n g 0 7 l o o t a b s t r a e t t h e s o y b e a nl i p o x y g e n a s e ( e c l 1 3 1 l ，1 2 ；l o x s ) m a i n l ye x i s t si nt h es o y b e a n s e e da n d i n c l u d e sl o xl ，l o x 2 ，a n dl o x 3t h a ti ss e p a r a t e l yc o n t r o l l e db yl x l ，l x 2a n dl x s i t s c a t a l y s i sp r o d u c eb e a n yf l a v o ra n d s a l i n ef l a v o rt h a tm a k ei t s e l fa i m p o r t a n ta n t i n u t r i t i o n f a c t o rw h i c ha f f e c t ss o y b e a ne d i b l eq u a i l t y , p r e s e r v eq u a l i t ya n dp r o c e s sq u a l i t y m u t a n t g e n e 肛，肤2 ，a n dz 玎c a nm a k eb e a n yf l a v o r r e d u c eo rv a n i s h t h e r e f o r e ，t h em a p p i n g t ot h r e eg e n e sw i t ht h em o l e c u l a rm a r kc a na s s i s tf o r e g r o u n ds e l e c t i o n ，f u r t h e r , a c c e l e r a t e t h ec u h i v a t i o no f t h ef u l ll o x s - n u l la n de x c e l l e n ts o y b e a nl i n e s f i v ec r o s s e sa r ec u l t i v a t e db yh e b e io i lc r o p si n s t i t u t e f 2s e e d sw e r ed e t e c t e ds e e d b y s e e d b y t h e i m p r o v e di e f p a g e ( i s o e l e c t i cf o c u s i n gp o l y a c r y l a m i d e g e l e j e c t r o p h o r e s i s ) f o ri d e n t i l y i n gt h e i rp h e n o t y p e s ，a i mo f t h es t u d yi sd e t e r m i n i n gt h e i n h e r i t a n c em o d eo ft h r e ep a i r sa l l e l e ，s c r e e n i n gn e a r e rs s rm a r k e r so fl x t l x ，a n d l x l x ：f u r t h e r , f i n e l ym a p p i n gt h e m ，a n df i n i s h i n gp r e l i m i n a r ym a p p i n g o fl x f l x 3 1 1 1 e m a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： a sl o x 3 ，l o x lh a v ea ，bs u b u n i ti nc r o s s0 1 2 4 ，0 1 3 9 ，0 1 5 5 ，a n d0 1 3 4 w h e nl o x li s l o s s ，l ai sl o s s ，b u tl br e s e r v ea n dh a sn oc h a n g e c r o s s0 1 2 9h a v eo n l yo n eu n i t w h e n l o x 2i sl o s s ，l o x l t o m p l e t e l yd i s a p p e a r a sl o x 3i sl o s s ，3 bv a n i s h e sa n d3 ad o e s n t c h a n g e t h a ti sc o n t r a r yw i t hl o x1 w h e nl o x 2i sl o s s ，l o x 2d o e s n tc o m p l e t e l yd i s a p p e a r , a n dl o x lb e h a v e sd i f f e r e n t l y i nd i f f e r e n tc r o s s e s ：1 ai sn e a rf r o m1 bi nc r o s s0 1 3 9 ，0 15 5 ，a n d0 1 3 4 a sl o x 2i sa b s e n t ， i bi si n v a r i a b l ea n dl au p w a r d l ym o v ef o rad i s t a n c e ；l ai sf a rf r o m l bi nc r o s s0 1 2 4 a s l o x 2i sa b s e n t b o t h1 aa n dl ba r ei n v a r i a b l e l o x le n t i r e l ym o v ei nc r o s s0 1 2 9 l x lu 蔗舟i sd o m i n a n tt ot x i t x s ) ；x 2f i x 2 i so n ep a i rc o d o m i n a n ta l l e l e s t h e s e p a r a t i o n o f l x la n d l x j ，k 2 a n d h 3 c o n f o i t n s t 0 9 ：3 ：3 ：1 ，l x la n d l x 3 ，h 2 a n d l x s a r e i n d i f f e r e n tl i n k a g e g r o u p l xd o e s n tl o c a t ei nl i n k a g eg r o u p sea n d1w h e r eq t l so ft h es o y b c a l ls e e dp r o t e i n m a i n l yc o n c e n t r a t e ；e s tp b l t 0 0 2 i nl i n k a g e g r o u p ij u s tr e s e m b l el x s m a r k e rs a t _ 4 17w h i c hi sc l o s et ol x ：i sp r e l i m i n a r i l yg a i n e d k e yw o r d ：s o y b e a nl i p o x y g e n a s e ；g e n e t i ca n a l y s i s ；g e n em a p p i n g ；i e f p a g e ； c o - d o m i n a n c e ；s s r 缩略词 a c r a f l p a p b i s b s a c m d n t p d n a e d l a e s t i e f p a g e l g l o x n i l s p c r o t l r a p d s d s s s r t a q t b e t e m e d t r i s u 本文所用缩略词及中英文对照 英文全称 a c r l a m i d e a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m m o n i u m p e r s u l f a t e b i s a c r y l a m i d e b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s c e t i - m o r g a n d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d e o x y i b o s en u c l e i ca c i d e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d e x p r e s s e ds e q u e n c et a g l s o e l e c l i ef o c u s i n gp o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e i s l i n k a g eg r o u p s l i p o x y g e n a s e n e a r i s o g e n el i n e s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n q u a n t i t a t i v et r a i ti o c i r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a s o d i u md o d e c y ls u l f o n a t e s i m p l es e q u e n c er e p e a t s t h e r m u s a q u a t i c u sd n ap o l y m e r a s e t r i s b o r a t ea e i d ，e d l l ab u 彘r n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s - h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e u n i t 中文全称 丙烯酰胺 扩增片段长度多态性 过硫酸铵 甲叉双丙烯酰胺 分离体分组混含分析法 厘摩 脱氧核糖三磷酸 脱氧核糖核酸 乙二胺四己酸 表达序列标签 等电聚焦凝胶电泳 连锁群 脂肪氧化酶 近等基因系 聚合酶链式反应 数量性状位点 随机扩增多态性d n a 十二烷基磺酸钠 简单重复序列 栖热水生菌d n a 聚合酶 t r i “硼酸e d t a 缓冲液 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 单位 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得趣j e 壅些太堂或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： l - 球；7 截 签字日期：7 年占月沈日 ， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解迥韭壅些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。本人授权逦j e 壅些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一虢i ；m 稷一名：酗豫 签字同期：西- 年f 月蝴 签字日期：。哎晦6 月半日 人盈脂氧酶缺失突变基因的遗传分析与定位 1 引言 大豆脂肪氧化酶( 1 i p o x y g e n a s e ，e c l 1 3 i i 1 2 ：简称脂氧酶，l o x s ) 是影响大 豆食用品质、储藏品质和加工品质的重要抗营养因子之一。可催化分子氧加到亚麻 酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的双顺式一1 ，4 一戊二烯任一术端( 区域专一性) ，形成过氧 化氢衍生物等挥发性物质l ，直接与食品中的蛋白质和氨基酸结合，产生豆腥味和 苦涩味，降低食品的风味和营养价值，而且破坏了上述几种人体必需脂肪酸，限制 了豆奶、豆粉等豆制品的广泛应用1 2 。 另一方面，l o x 对不饱和脂肪酸的氧化催化作用在其它食品原料、种子的储藏 与加工中又有很大的意义。如由小麦磨制的新鲜面粉，因含类胡萝h 素而成淡黄色， 制作面包时掺入适量豆粉以取代化学漂白剂，即是利用l o x 耦联氧化类胡萝卜素而 进行生物漂白，保证了面粉的质量。同时l o x 还可以增强小麦中麦谷蛋白的交联和 氧化作用，提高麦类食品的口感和风味。l o x 还广泛应用于茶叶加工中，在红茶和 乌龙茶的制造发酵工艺过程中，能促进茶叶原料的脂质过氧化作用，生成茶叶的香 味。另外，在自然界中使大多数蔬菜、水果成熟时具有特殊风味的也是l o x 的系统 代谢产物。 以上分析表明，改善大豆食品的风味，提高l o x 在商业生产中的利用价值是大 豆品质改良的一个重要方面。通过分子标 已，对k 基因进行精细定位，一方面可作 为前景选择( f o r e g r o u n ds e l e c t i o n ) 的手段，加速l o x s 全缺失优良大豆品系的培育 进程，并可在纯度鉴定中加以利用。另一方面可进。一步克隆改造该基因片段，从而 批量生产l o x s 结晶，投入到生产中，刨造巨大的商业价值。 根据收集的文献分析，对于l o x 的研究是交织发展和不断深入的。1 9 8 0 年以前， l o x 的酶学特性已经基本清楚，到9 0 年代初期确定l o x 的空间结构，测出了三种大 豆种子l o x 的基因序列。之后的研究多集中在l o x 的生理作用、缺失机理和应用方 面。 l o x 是一种含非血红素铁、不含硫的过氧化物酶，球形，无色，可溶f 翔，在动 植物界中广泛存在，且在动植物的不同发育阶段、不同部位存在着不同的类型【”。 大豆种子中包含三种不同性质的同工酶，分别命名为l o x i ，l o x 2 ，l o x 3 5 - 7 ，约占 种子蛋白质含量的1 2 ，其中l o x 3 又分为3 a 和3 b 两种，可由p l 的不同而分 开，但二者的生化性质和反应方式非常相似，故仍被认为是一种同工酶甜。这三种 l o x 在酶活最适p h 、p 1 、热稳定性、底物专一性等许多生化性质上都不同，p l 依次 为5 7 0 ，5 8 5 ，5 9 5 ，6 2 0 ，酶活最适p h 则为9 ，6 8 ，7 ，7 。等电聚焦聚丙烯酰胺 凝胶电泳( i s o e l e c t i ef o c u s i n gp o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，i e f p a g e ) 即是根 据p i 和酶活最适p h 之不同将这三种酶分开以达到鉴别和筛选的目的。 大豆种子中三种l o x 同工酶的c d n a 序列己基本清楚。s h i b a t a 等1 9 澳1 1 定了l o x l 的c d n a 序列，全长2 8 k b ，共8 3 8 个氨基酸，分子量9 4 ，0 3 6 d 。接着【1 0 1 又报道了 l o x 2 的c d n a 全序列，并推导出8 6 5 个氨基酸，分予量为9 7 ，0 3 6 。l o x 3 基因组d n a 河北农业大学硕士学位论文 及c d n a 全序列，是由9 个外显子和8 个内含予组成，其蛋白质包含8 5 9 个氨基酸， 分子量为9 6 、6 6 3 d 。比较其序列组成，发现三者间同源性较高，l o x l 和l o x 2 之间 存在8 1 同源性，l o x l 和l o x 3 之间存在7 4 的同源性，l o x 2 和l o x 3 之间存在7 0 的同源性j 。同源序列中n 末端均有个15 0 个氨基酸组成的6 一桶状结构，为c a ” 结合、酶活性激活及l o x 与其异构物进行核膜置换所必需，可能与全部蛋白稳定性 的维持有关l 】2 1 。c 末端均有一段4 0 个氨基酸组成的保守区域，其中包括6 个组氨 酸和2 个酪氨酸，作为酶蛋白的活性中心与f e ”结合，从而调节酶的活性。其中的 l o x t 用胰蛋白酶消化会产生一个称之为“m i n i l o x ”的6 0 k d a 片段，与l o x l 相比， 稳定性下降，但催化作用和膜结合能力均有所提高| 1 “。 研究表明，l o x l ，l o x 2 ，l o x 3 分别受三个显性基因厶，l x 2 ，l x 3 控制，缺失 由隐性突变基因x ，x 2 ，奶控制【1 3 叫”，其中x j 和勋紧密连锁，h j 独立遗传f 1 6 1 。 y e n o f s k y ( 1 9 8 8 ) 1 17 j 发现l o x 3 缺失不积累其相应的m r n a ，这一研究为揭开l o x 的基因表达及缺失机理奠定了基础。w a n g 等【l 舻1 9 j 先后对l o x l ，l o x 2 和l o x 3 缺失 突变的分子机理进行了研究，发现h ? 在结构基因的1 5 9 6 b p 处发生了t a 的错义 突变，使得g i n 替换了h i s 5 3 2 ，但并未打破l o x 2 的蛋白合成，只是导致l o x 2 酶 活性丧失，稳定性降低，表明h i s 一5 3 2 的存在对蛋白质三维结构的维持极为重要。 l o x 3 缺失则是转录水平受阻，即x 3 的57 上游起始区有三个碱基替换突变：- - 6 3 6 b p 处的c t ，一5 8 5 b p 处的t a 一3 8 7 处的c a ，g u s 基因转录检测证明，前两 个突变是导致l o x 3 缺失的主要原因。l o x l 缺失也是转录水平受阻，但分子机理有 待于进一步研究。l o x 酶基因序列的获得及突变机理的明确为开发其分子检测奠定 了基础。 l o x s 活性和植物的发育、成熟和衰老的不同过程有关1 2 d 】。它能启动幼苗生长， 提高抗逆生理和防卫反应1 2 ”j 。催化产生的j a 和愈刨酸可协助细胞信号转导，促 进植物组织伤口愈合。l o x s 还可作为营养储藏蛋白【2 4 1 ，参与脂类迁移1 2 5 1 ，调节“源” 与“库”分配1 2 “，引导细胞程序性死亡例。 许多人对l o x s 缺失大豆和正常大豆的农艺性状、豆制品口感、营养品质等作了 比较，发现：与正常大豆相比，l o x s 缺失大豆在产量、熟期、百粒重和蛋白、脂肪 含量没有差别，缺失对株高、抗病性、结实率和种子劣变等也无不良影响f 2 8 q 2 1 。生 产出的豆奶及其相关产品口感好，豆腥昧降低甚至完全消失，v e 含量高( 1 4 倍 2 8 倍) 【3 3 i ，蛋自、氨基酸等营养成分不丢失【3 “。鉴于此，国内外学者对l o x 缺失 种质进行了筛选，多为l o x 3 ，l o x 2 和l o x 2 ，3 缺失体，l o x l 缺失体较少。同时发现， 我国大豆资源中存在大量的l o x 缺失体且变异类型丰富，这可能与我国是大豆起源 地、生态环境多样化有关 3 5 3 9 。 培育l o x 全缺失的大豆新品种，将为开发新的豆类产品，进而提高大豆的经济 利用价值开创更为广阔的前景。8 0 年代初美国相继培育出大豆品种c e n t u r y 近等基 圆系t x | l x l ，i x2 1 x 2 。l x 3 i x 3 ，k l xj t x 3 l x 3 ，l x f l x e l x d x 3 。k i t a r n u r a 冬社q 逸有了x l i x i 1 x 2 l x 2 ， i x f i x 3 ，投i k l k ，l x 3 ，h ? 弛岛，幻s u z u y u l a k a 系列材料，h a j i k a 等【4 ”用杂交和辐照相结 合的方法获得了x x ，x 2 幻h j h j 三缺材料，形成套完整的近等基因系。我国已相 2 大豆腊氧酶缺炙突变基因的遮传分析与定位 继培育出“中黄2 8 号”、“五星一号”、“绥无腥豆1 号”等无腥大豆品种，开辟了大 豆品质育种的新领域。 以上分析表明，对大豆l o x 同工酶的生化和分子生物学特性、生理作用、缺失 机理的研究已不断深入，在育种匕的应用也已经起步，分子标记的不断开发将为l o x 的深入研究注入新的活力。c r e g a n 等【4 2 利用5 个不同的亲本组合，定位了1 8 4 9 个 标记，其中s s r 标记为1 0 1 5 个，和1 9 9 9 年绘制的遗传图谱相比，又有9 0 个新标 记填充在3 1 个 ；，2 0 c m 的间隙中。遗传连锁图谱已趋于饱和，这为利用图谱信息对 三x 基因进行精细定位、克隆并有效地对基因实现目的性改造奠定了基础。 关于厶基因的定位中外学者相继开展了研究。孙君明等”卸以c e n t u r y 近等基因 系为材料，采用r a p d 标记技术，证明标记$ 3 5 2 与基因，x ，紧密连锁。x u 等f 4 4 1 利 用初级三体将l x ，定位在1 3 号染色体上，c r e g a n 等【4 将初级三体和s s r 标记相结 合，证明k ，和标记s a t0 9 0 ( f 连锁群上) 连锁，从而将f 连锁群和1 3 号染色体对 应起来。m o o n y o u n g k i m 等f 4 6 j 利用血2 基因序列设计引物，并根据s n p 位点和s s r 标记的连锁分析，将上x ，定位在f 连锁群的s a t t 5 2 2 ，s a t0 7 4 之间，三者紧密连锁。 m a t t h e w 等1 4 7 j 将e s t 标记p b l t 0 0 2 ( 和厶，和三趵基因序列相似) 定位到连锁群i 上，显示l x 极可能在连锁群i 上。 目前，l x f l l x l ，l x ? t x i 两对基因的定位业已完成，都位于f 连锁群的最下端， 并紧密连锁，其中l x f l l x 2 的定位较精确，l x f l t x ，则相对粗略，而l x ；l x 3 的定位研究 目前尚未见报道。本研究以河北省油料作物研究所配置的5 个杂交组合f 2 代为材料， 应用改进的i e f p a g e 电泳技术对其逐粒检测，鉴别l o x 缺失类型，分析3 个基因 的遗传连锁关系，进一步筛选三x ，i l x ，l x f l l x ? 两对基因附近的s s r 标记并精细定位。 同时对三x j 进行初步定位，为分子标记辅助育种提供可靠的理论依据，从而缩短 育种进程，实现大豆品质改良。 3 河北农业大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 材料与方法 本实验选用了河北省油料作物研究所培育的5 个l o x 缺失品种品系和引进的2 个正常品种，于2 0 0 1 年夏配置了5 个杂交组合( 见表1 ) ，获得f o 杂种，2 0 0 2 年种 植f l 代，单株收获f 2 种子，冷库保存。 表1 五个不同的杂交组台 t a b l eif i v ed i f f e r e n tc r o s s e s 注a 一3 l ：l o x l ，l o x 2 l o x 3 均缺失一2 ：l o x 2 缺失。2 。3 ：l , o x 2 ，l o x 3 缺失：n ：l o x l l o x 2 ，l a x 3 均不缺麦 2 2l o x 缺失类型鉴定 2 2 1 样品制备 将每一粒f 2 种子分成三部分，从远离胚轴端开始，l 4 粒磨豆粉( 大约5 r a g ) 做蛋白检测，1 4 粒削成碎屑提取d n a ，剩余的l 2 粒留下田间种植，调查农艺性 状。将豆粉装入1 5 m l 离心管中，加入5 0 1 0 0 m l 提取液，置于49 c t2 4 h ，期间 用旋涡震荡器震荡3 5 次，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n ，取上清夜备用。 2 2 2 试剂配制 l 样品提取液：0 0 5 m 确s ，0 0 5 m c a c l 2 ( 1 2 1 1 4 9t r i s + 0 0 5 8 9c a c l 2 2 h 2 0 或0 4 4 4 9 无水c a c l 2 ) ，用浓盐酸调p h 至8 0 ，定容至2 0 0 m 1 ) 21 5 r e p e l - s i l a n e ，0 1 5 b i n d - s i l a n e 氯仿溶液。 3 制胶溶液配制 a 2 9 1 ( w 厂v ) 丙烯酰胺( a c r ) + 0 9 ( w v ) n ，n 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 贮液：配制后，溶液霞过滤，置于棕色瓶中，冰箱内保存。 b 2 过硫酸铵( a p ) ：2 0 r a g a p m lh 2 0 ( 使用当天配制) 。 4 大豆脂氧酶缺失突变基因的遗传分析与定位 4i e f p a g e 凝胶配方 表2i e f p a g e 凝胶配方 t a b l e2p r o p o r t i o no fi e f - p a g eg e 5o ，5 m o l l n a o h 溶液：2 ，2 5 9 n a o h 1 0 0 m l 无c 0 2 水( 蒸馏水加热沸腾，去除c 0 2 ) 。 o 5 m o l lh 3 p 0 4 溶液：2 9 0 m lh 3 p 0 4 5 0 m lh 2 0 。 6 n a 2 h p 0 4 n a h 2 p 0 4 缓冲液( 0 】m ，p h 7 4 7 8 ) ：分别配制0 1 m n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ( 3 5 8 0 9 l ) 及0 1 mn a h 2 p 0 4 2 h 2 0 ( 15 6 0 9 l ) 溶液，按所需p h 配比混合。 表3n a z h p 0 4 - n a i l z p 0 4 缓冲液配方 t a b l e3p r o p o r t i o no f n a 2 h p 0 4 - n a h 2 p 0 4b u f f e r 7 酶染液和反应底物的配制：使用前配制，混合前分别溶解。 a ，酶染液：邻联茴香胺3 4 3 8 m g ，再加无水乙醇1 5 m l 。 b 反应底物：亚油酸2 0 0 u l ，加无水乙醇o 8 m l ，再加吐温1 2 m l 。 使用时，a ，b 混合，再用磷酸缓冲液( p h 7 4 7 8 ) 定容至1 7 0 m l 。 8 考马斯亮蓝染液的配制。 a 考马斯亮蓝染色母液：称取3 5 9 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，加入3 0 0 m l 脱色液，边 搅拌边水浴加热( 5 0 6 0 ) ，使其充分溶解，过滤后冰箱中保存。 b ，稀释染色液配比为l ：7 。 考马斯亮蓝染色母液2 5 m l ，加脱色液1 7 5 m l ，定容至2 0 0 m l 9 脱色液：甲醇：冰醋酸：水= 3 ：l ：6 。 5 河北农业大学硕士学位论文 2 2 3 等电聚焦凝胶电泳检测 l 提取( 见样品制各) 2 涂板 在两边分别贴有隔条( 宽9 r n m ，厚0 5 m m ) 的下板上倒少许疏水硅烷 ( 1 ，5 r e p e l ) ，上板上倒少许亲水硅烷( 0 1 5 b i n d ) ，用软纸或棉花在玻璃板上涂 布均匀。 3 制胶 将分别经过硅化和反硅化处理的上板和下板进行组装，将1 3 6 聚丙烯酰胺凝 胶混合均匀，倒在上下板间的空隙中，凝胶规格为2 5 c m 6 c m 0 5 c r n ，大约l h 启 胶。 4 电泳 使用a m e r s h a mb i o s c i e n c e sm u l t i p h o r1 1 型电泳仪，电泳前预先打开水循环仪， 设置4 c 冷却温度，将制好的聚丙烯酰胺凝胶铺在冷却板上，其问涂以液体石蜡或 煤油，防止气泡进入，以保证胶板和冷却板之间的良好接触。分别用o 5 mh 3 p 0 4 溶液( 正极) 和o ，2 mn a o h 溶液( 负极) 涧湿滤纸电极条，预电泳3 0 r a i n ( 2 0 0 0 v ， 5 0 m a ，4 w ) 。按冷却板上的格子和预先设计的实验计划将样品提取液5 6 u l 点在 凝胶上，每板可点4 5 5 0 个样品，同样条件下电泳2 h 。 5 染色 电泳结束，取板，去掉电极条，将凝胶置于0 1 m o l l 磷酸缓冲液( p h 7 6 7 8 ) 中洗5 m i n ，再将凝胶浸入酶染液中，置于摇床上，2 7 。c 下摇荡4 0 r a i n 6 0 m i n ，至 酶带出现，用磷酸缓冲液洗5 m i n ，再用洗脱液洗5 r a i n ，接着用1 倍考马斯亮蓝染 液染色1 5 r a i n 左右，最后用洗脱液洗玻璃板背景脱色，至酶带清晰，室温晾干。 2 3s d s 法提取d n a 1 o 0 0 5 9 磨碎的材料中加s d s 提取液6 0 0 u ( 1 0 0 m m o l l t r i s h c i ，p h 8 0 ，2 0 m m o l l e d t a ，5 0 0 m m d l n a c l ，l ，5 s d s ，冬天需预热) 。6 0 水浴4 0 m i n 6 0 m i n ，每 隔1 0 m i n 颠倒混匀1 次。 2 加等体积的酚氯仿( 1 ：1 ) ，轻轻摇匀1 0 m i n ，配平，静置1 0 m i n 。1 5 c 下，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清。 3 重复“2 ”步骤1 2 次，取上清。 4 加等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻摇匀l o m i n ，配平，静置1 0 m i n ，1 5 下， 1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清。 5 重复“4 ”步骤1 次，取上清( 可省略) 。 6 加2 倍体积的无水冰乙醇，配平，沉淀，离心5 m i n ， 洗d n a 2 3 次，最后，再用无水乙醇洗涤1 次。 7 把提取的d n a 放到通风橱干燥，待酒精挥发干净后， 6 倒掉上清液，用7 5 的酒精 加2 0 0 u 无菌水溶解，- - 2 0 人豆腊氧酶缺失突变基因的遗传分析与定位 保存。 2 4 浓度检测 取少量d n a 样品在o 8 琼脂糖胶上检测，在紫外分光光度计u l t r o s p e e i l l ( p h a r m a c i a ) 上测定质量和浓度，根据检测和测定结果稀释至2 0 n g ，u l 备用。 2 5s s r 分析 s s r 引物序列来自大豆数据库( s o y b a s e ) ，由上海生工生物工程有限公司合 成。 2 5 1p c r 扩增体系 p c r 扩增体系为2 0 u l ，包括2 0 n g u l 基因组d n a 4 u l ，2 ，0 u m o l l 引物( 5 7 端和 37 端) 1 5 u l ，2 m m o l l d n t p l 5 u l ，1 2 5 m m o l l m g c l 2 1 5 u l ，1 0 p c r b u f f e r2 u l ，5 u t a q d n a 聚合酶o 4 u l ，超纯水1 o 6 u l 。 2 , 5 2 扩增反应程序 反应程序为9 5 。c 预变性5 m i n ，接着进行3 5 个循环：9 4 。c 变性3 0 s e c ，4 7 。c 退火 3 0 s e e ，7 2 延伸3 0 s e c 。最后7 2 延伸5 m i n ，4 v 保存1 h ，p c r 反应在p e 公司9 6 0 0 型扩增仪上进行。 2 5 3 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶系统检测 1 ) 样品变性：在每个离心管中加入5 7 u l 变性指示缓冲液( 9 8 甲酰胺；1 0 m m e d t a ，0 0 2 5 二甲苯青，p h 8 o ) ，9 5 变性3 m i n ，立即置于冰浴中。 2 ) 玻璃板的组装：将玻璃板洗干净后，用酒精檫一遍，平板玻璃涂o 5 b i n d s i l a n e 氯仿溶液，凹板涂2 r e p e l s i l a n e 氯仿溶液，待其干燥后进行玻璃板组装。 3 ) 制胶：将6 聚丙烯酰胺( 8 m o l l 尿素，1 x t b e 5 0 m l ，1 0 a p 2 0 0 u l ，t e m e d 4 0 u 1 ) 混合均匀，沿灌胶口灌进至胶流动到底部，防止气泡产生，在灌胶口插入梳子， 待其聚合后进行电泳。 4 ) 预电泳：将梳子拔出，上板，电泳缓冲液上槽液为1 3 倍t b e ，下槽液为l 倍 t b e ，电泳参数为恒定功率1 0 0 w ，预电泳约2 0 m i n 。 5 ) 电泳：点5 6 u l 样，电泳约l h ，根据s s r 产物分予量大小适当调整电泳时间。 7 河北农业大学硕士学位论文 2 5 4 扩增产物的银染显色 1 ) 固定：电泳结束后将有凝胶的平玻璃板放入固定液( 1 0 冰醋酸) 中，置于摇床 上轻摇3 0 m i n 至指示剂无色。 2 ) 水洗：用蒸馏水漂洗2 次，每次5 m i n 。 3 ) 银染：将玻璃板放入染色液( i lh 2 0 中加入1 9a g n 0 3 和1 5 m l3 7 甲醛) ，置 于摇床上轻摇2 0 r a i n 。 4 ) 漂洗：将玻璃板从染色液中取出水洗5 s 。 5 ) 显影：将玻璃板迅速取出放入显影液( 1 lh 2 0 中加入3 0 9 无水碳酸钠、1 5 m l 甲醛和2 0 0 u l1 0 m m l n a 2 s 2 0 3 ) 中，轻轻晃动，至条带清晰显出。 6 ) 定影：将玻璃板取出立即置于固定液中终止反应5 r a i n ，水洗，室温干燥后统计 带型。 2 , 6 统计分析 2 6 1 卡方测验 参照盖钧镒的试验统计方法 2 6 2s s r 带型统计与遗传连锁分析 将和正常亲本( 显性纯合) 一致的带型记为a ，和缺失亲本( 隐性纯合) 一致 的记为b ，两种带型都有的记为h ，其它的摒弃。对分离群体进行卡方测验，检验 显著性。应用m a p m a k e r v e r s i o n e x p 3 0 ( 置信值为3 o ) 软件，在m a c i n t o s h i i 计算 机工作站进行计算。应用g r o u p 命令进行连锁分析( l o d = - 3 0 ，r = 0 4 ) ，错误检测 水平设为1 。采用k o s a m b i 函数，将重组率转换成图距单位( e m ) 8 大豆脂氧酶缺失突变基因的遗传分析与定位 3 结果与分析 3 1 大豆脂氧酶缺失突变基因的遗传分析 采用i e f p a g e 技术对5 个杂交组合f 2 代材料的l o x 缺失类型进行检测，每板 均设有l o x 不同缺失类型和l o x 缺失、正常亲本作对照。缺失l o x 3 和缺失l o x l 时，酶带完全消失，易于辨认。缺失l o x 2 时，表现为酶带着色浅，仍有带痕，需 与缺失l o x 2 的对照作比较来确定。 在具体的实验操作中，要保证样品量尽可能一致，和提取液的比例约为1 ：1 0 。 此时酶带清晰，易脱色，且不同样品清晰程度相同，排除了电泳、酶染过程中可能 造成的酶带差异，使不同板间的结果具有可比性。检测出的缺失样品进行重复验证， 确保结果的可靠性。 将鉴定结果进行了归类整理，数据统计如下( 见表2 ) 。组合0 1 2 9 和0 1 2 4 为一 类，f 2 代有4 种表现型：i o x 2 ，l o x l l o x 2 ，l o x 2 1 0 x 3 ，l o x l l o x 2 1 0 x 3 。0 1 3 9 和0 1 5 5 为 一类，f 2 代有6 种表现型：l o x 2 ，l o x 3 ，l o x 2 1 0 x 3 ，n ( 正常) ，x ，x ，3 。叭3 4 单独 为一类，f 2 代只有三种表现型：l o x 2 ，l o x 2 ，x 。 表4 五个组合i o x 缺失类型的鉴定结果 t a b l e4t h el o x - n u l lp h e n o t y p e so ff 2s e e d so ff i v ec r o s s e s 注bi o x 2 ：脂氟酶2 缺失；i o x i i o x 2 ：腊氧酶i 2 蚨失ii o x 2 1 0 x 3 ：脂氧酶2 。3 缺失；l o x l i o x 2 1 0 x 3 ：脂氧酶i ，2 ，3 缺失；n ( 正 常) ：脂氧酶不缺失；x ：脂氧酶2 为杂台型：x 3 ；脂氧酶2 杂舍且脂氧酶3 缺失；l o x 2 ：脂氧酶2 不缺失 3 1 1 组合0 1 2 9 和0 1 2 4 的酶谱特点与遗传分析 1 二者都缺l