溶菌酶的提取纯化及纯度测定.docx

溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪 绿药1501班 201530360127 同组者：连学帆 韩家鑫 实验地点：东配302 实验日期：2017年5月26日-5月27日 报告完成日期：2017年5月28日 指导老师：易 喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶、 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它能水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用下胀裂开,引起细菌裂解。溶菌酶主要溶解革兰氏阳性菌的细胞壁。溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶菌酶属于冷杀菌,在杀菌防腐过程中不需加热,因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用,尤其对热敏感的物质更具有重要意义。还可以添加到乳粉中,使牛乳人乳化,以抑制肠道中腐败微生物的生存,同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外,还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。在生物工程研究上，随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶。在医疗中，溶菌酶对G+ 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普通变球菌等G- 也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。溶菌酶在畜禽饲料中，由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质,无毒性,是一种安全性高的饲料酶,它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用。为了从鸡蛋清中提取并提纯得到的溶菌酶，我们分别采用了等电点沉淀法得到了溶菌酶粗品，然后通过离子交换层析提纯得到的样品，最后测定了所制的溶菌酶活性及蛋白质含量。【实验部分】1.1 试剂与仪器1.1.1 试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS(pH7.0、 pH8.0、), lmLEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,离心管，样品 S1、 S2、 S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的 PBS, 0.6mo1/LNaC1, 烧杯(50mL, 250mL)、桔草芽胞杆菌过夜培养物(37,18h,160r/min,100/250mL)、 0.02mo1/L pH8.0的 PBS(测活缓冲液,含50mmo1/LNaC1), 0.2mo1/LpH8.0的 PBS。1.1.2 仪器 分光光度计、揺床、高速离心机，分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,高速离心机(可用50mL离心管),冰箱, 可见光分光光度计、揺床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸等。1.2 实验方法1.2.1 实验原理溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定, 干燥条件下在室温可长期保存而活性不丧失。在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清中含量较高,鸡蛋中占蛋白总量的3.5%,所以我们选择使用鸡蛋清来提取溶菌酶。鸡蛋清中溶菌酶由18种129个気基酸残基组成的单肽链蛋白质, 分子中含有4个二硫键, 等电点为10.8,对温度和酸不敏感,在弱碱性条件下稳定。鸡蛋清中含13%15%的蛋自质,除溶菌酶以外,还有其他的的蛋白质, 其主要特点分别如下:由此可见，其中大部分的杂蛋白与溶菌酶的等电点都具有很大的不同，所以我们使用等电点沉淀法来对溶菌酶进行粗提取。等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。在等电点时, 蛋白质分子以两性离子形式存在, 其分子净电荷为零(即正负电荷相等), 此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥, 分子相互之间的作用力减弱, 其颗粒极易碰撞、 凝聚而产生沉淀, 所以蛋白质在等电点时, 其溶解度最小, 最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、 膨胀性、 渗透压等都变小, 从而有利于悬浮液的过滤。为了提纯得到的溶菌酶粗品，我们选择了离子交换层析，离子交換层析 (简称为 IEc)是依据各种离子或离子化合物与高子交換剂的结合力不同而进行分离纯化的。目前广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的, 可以分为三部分: 高分子聚合物基质、 电荷基团和平衡离子。 电荷基团与高分子聚合物共价结合, 形成一个带电的可进行高子交换的基团 。 平衡高子是结合于电荷基团上的相反离子, 它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应 。 平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用, 称为阳离子交换剂; 平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。离子交换过程如下反应方程: 其中 R代表离子交换剂的高分子聚合物基质, X-和 M+分别代表阳离子交换剂和阴高子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团, Y+ 和 N- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子, A+和 B-分别代表溶液中的离子基团。从上面的反应式中可以看出,如果A离子与离子交换剂的结合力强于 Y离子,或者提高 A离子的浓度, 或者通过改变其它一些条件,可以使A离子将 Y离子从离子交换剂上置換出来。也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交換层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置換反应, 就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。比如说，阳离子交换剂的电荷基团带负电, 装柱平衡后, 与缓冲溶液中的带正电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,正电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而负电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。 随着洗脱液离子强度的增加, 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种正电基团进行交換, 而将各种正电基团置换出来, 随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的正电基团先被置换出来, 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种正电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来,从面达到分离目的。在本试验中我们通过离子交换剂将杂质蛋白洗脱出来从而提纯所得的溶菌酶样品。并且通过考马斯亮蓝法来鉴别蛋白质的含量，考马斯亮蓝 G_250比色法是常用的一种蛋白质含量的测定方法。 1976年由 Bradford建立,用于测定蛋白质浓度。考马斯亮蓝 G-250是一种染料,在酸性溶液中为棕红色,最大光吸收波长为465nm。 它能与蛋白质通过疏水作用结合, 形成蛋白质一染料的复合物, 颜色由红色转变为蓝色, 在595nm波长下有最大吸收值,并且在低浓度范围内(0.01-1.0mg/m1),与蛋白质浓度的关系服从比尔定律 。该法操作简単,反应迅速, 2min左右即达到平衡,而且灵敏度很高,可测微克级的蛋白质含量,所生成的染料一蛋白质颜色稳定,实验重复性好,抗干扰性也强,现已广泛应用于蛋白质含量的测定 。被测蛋白质与标准蛋白质氨基酸组成差异较大时, 有一定误差, 因为与染料结合量不同。之后通过测定枯草芽孢杆菌的吸光度降低来得到样品的酶活，对所得样品的纯度和收率进行了客观的分析。1.2.2 数据处理注意事项根据酶的动力学特性可知, 在特定的时间段,酶促反应的速度是相等的, 即产物浓度随时间成线性变化。根据此特性,将所得数据在坐标纸上作图,以时间为横轴, 0D（595）值为纵轴,将数据定位后,根据拟合直线的斜率,即为单位时间内 0D值的下降值,然后再除以0.001,即可得到所取测量酶液的活力单位。除以酶液体积,即可得到酶浓度(u/mL)。溶菌酶活力单位(u)=0D/0.001其中0D为一分钟内 0D值的下降值。1.3 操作步骤1.3.1 溶菌酶的粗提取拿一只鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中,记录其体积V1 (实验中取15ml)，加入1.0倍体积的 pH7.0PBS缓冲液,搅拌均匀,取1.0mL蛋清于1mLEp管,制备2管,4备用(样品S1) 用冰酷酸调 pH4.7左右, 充分搅拌 4000rpm,离心10min 弃沉淀, 转移上清至烧杯中 加入1.0倍体积的 0.02M, pH8.0PBS缓冲液,搅拌均匀,并用5mo1/LNaOH调 pH8.0 滤纸过滤,取清液,测量并记录体积 v2 取1.0mL清液于1mLEp管,制备2管, 4备用(样品S2) 余下的清液放在100mL烧杯中4保存备用. (样品s2)1.3.2 溶菌酶的分离纯化1、装柱取20mL CM-纤维素离子交換介质, 1.0x40cm层析柱, 以 0.02M PBS,pH8.0为缓冲液装柱。 注意不能使介质露出水面, 因为介质露于空气中, 当加入溶液时, 介质间隙中会产生气泡,而使交換不完全。对子重复使用的填料,需要先冲3倍柱床体积蒸馏水,将保存用的乙醇洗脱出来。2、平衡用泵将3倍于柱床体积的 0.02M PBS pH8.0过柱。这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一, 以利后续目的蛋白的结合。3、上样用泵将 S-2样品泵入层析柱,经过一段时间之后,蛋白将通过离子交換的方式, 与介质相互作用而挂柱。注意观察并记录280nm下吸收值的变化。4、淋洗用34cv 0.02mo1/LpH8.0的 PBS洗涤离子交换柱至无穿透峰为止,收集穿透峰 S3, 流速约1.5mL/min。取约1mL于 Ep管4C保存备用.。5、洗脱分别用34cv含 0.2mo1/LNaC1的 PBS(0.02mo1/L、 pH8.0)缓冲液和34cv含 0.6mo1/L NaC1的PBS (0.02mo1/LpH8.0)进行阶段税度洗脱。收集洗脱峰 S4,记录洗脱时间和洗脱峰体积V4。取1.0mL清液于1mLEp管中,制备2管, 4备用(留样S4)。（洗脱时得到两个峰，所以最后还得到了S5）6、再生用泵将2倍柱体积的2mo1/LNaC1过柱, 然后水洗4倍柱体积。洗脱完成后, 需要进行高子交换填料的再生处理。离子交换基团为一些盐所覆盖,影响下次的重复使用。因此,先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来, 然后再恢复其离子交換功能。 对于 CM-纤维素而言, 只需要用水过柱即可以使其离子交換功能得到恢复 。7、保存用泵将2倍柱体积的20%乙醇过柱 。介质回收用于蛋白质分离纯化的介质多保存于液体中。保存时需加入一些抑菌剂,如叠氮化钠等。对于本介质,只需采用20%乙醇保存即可。对于洗脱下来的样品,我们无法确证是否含有溶菌酶。因此需要进行监测。一般采取活性监测的方式。本实验中利用溶菌酶水解枯草芽孢杆菌细胞壁,使得枯草芽孢杆菌裂解,以595 nm下光吸收值的变化来确定溶菌酶所在的吸收峰 。1.3.3 溶菌酶活性测定取6mL 枯草芽孢杆菌的过夜培养物, 3500rpm常温离心5分钟,弃上清,沉淀用6mL 0.02mo1/L PBS缓冲液悬浮,利用可见光分光光度计测其 0D5g5并记录(吸光度在 0.51.0 范围,如果读数过高可适当稀释)。比色皿编号见下表,其中1只加入PBS作为仪器调零空白, 2作为对照, 3、4用于平行测定然后取平均值), 30s测定一次吸光度值,约3min内至吸光度达到稳定 。比色皿1234PBS缓冲液/mL3/细胞 PBS悬液/mL/32.92.9分别用酶液 S1 S4/mL/0.10.1 在室温,以1号管为对照,每隔30s分别测定2、3、4在595nm的吸光度。时间(s)03060901201501802号3号4号1.3.4 溶菌酶蛋白质含量测定1.3.4.1 利用考马斯亮蓝制备蛋白质标准曲线 在6支试管中,分别精确吸取牛血清蛋白原液 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 m1,用蒸馏水全部稀释至1.0m1,然后分别加入5.00m1考马斯亮蓝溶液,混合均匀,于(25士1 )的恒温水浴中保温10min,冷水浴中冷却后,立即于595nm波长处比色测定。以1.00m1 蒸馏水代替样品液,加入5.00m1考马斯亮蓝溶液,其余操作同上,做空白对照。以试管中标准蛋白的总量(ug)为横坐标,相应的吸光度值为纵坐标作标准群曲线图,并作线性回归, 求线性方程。1.3.4.2 未知样品蛋白质含量测定将S1，S2,S3，S4，S5作适当稀释(使其测定值在标准曲线的直线范围内),取1.00m1稀释液于试管中, 按上述相同方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。根据所测定的OD值,由标准曲线线性方程,计算出未知样品的蛋白质质量浓度(mg/m1)。【结果与讨论】1. 离子交换层析谱图 图1.离子交换层析图谱第一个峰为S3.第二个峰为S4，第三个峰为S5.（由于出现了断电的意外情况，谱图受到了些许影响，万幸时间较短，没有对谱图走向形成大的影响）2. 蛋白质标准曲线的制作 表1.蛋白质含量与吸光度关系表 蛋白质含量/g20406080100吸光度0.1380.2400.3360.4260.526 图2.蛋白质标准曲线3. 未知样品蛋白质测定 表2.未知样品吸光度与蛋白质含量记录表样品名稀释倍数吸光度蛋白质含量 /g/mLS12000.84633391.7S22000.38414141.7S3200.7582972.5S410.52399.6S520.461173.54. 通过酶促反应的速度得到酶液活力单位及酶浓度 表3. S1溶菌酶活性测定表时间/s3060901201501802号6306276266256266253号6266276266246216194号630624614602593585 表4. S2溶菌酶活性测定表时间/s3060901201501802号5475465475485485493号5885705565425335224号566553538525515504 表5. S3溶菌酶活性测定表时间/s3060901201501802号0.6260.6270.6260.6260.6260.6263号0.6040.6030.6040.6040.6040.6044号0.6000.5590.6000.6000.6010.600 表6. S4溶菌酶活性测定表时间/s3060901201501802号0.6140.6150.6140.6140.6140.6153号0.6010.6020.6020.6020.6020.6024号0.6190.6180.6180.6180.6180.618 表7. S5溶菌酶活性测定表时间/s3060901201501802号0.6120.6110.6100.6110.6100.6113号0.5950.5830.5730.5630.5530.5444号0.5840.5730.5630.5510.5400.529显而易见，S3,S4没有酶活性，因此不做下一部分处理。 图3.S1样品的酶活性曲线 图4.S2样品的酶活性曲线 图5.S5样品的酶活性曲线统计数据可得到表： 表8.样品与参数分析表样品及参数体积/ml蛋白含量/mg/ml酶活/U/ml比活/u/mg鸡蛋蛋清V1=25mL33391.710.9980.0033S11mL沉淀上清V2=14141.725.4880.0180S21mL淋洗液V3=2972.500S31mL洗脱液V4=S4ml99.600S5ml173.521.1471.2188纯化倍数369.3纯化收率随着实验过程的进行，蛋白质含量不断降低，酶活性则是在提高，