（动物学专业论文）hmgd过量表达对果蝇化蛹及血细胞发育影响机制的研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 摘要 果蝇是重要的模式生物，其在遗传学、分子生物学、发育生物学等领域中有着 突出的贡献。此外，在对果蝇和人类基因组的比较中发现，三分之二引发人类疾病 的基因( 包括与癌症有关的基因) 在果蝇中都存在类似的基因。h m g d 蛋白最早由 b a s s u l 【等从果蝇胚胎细胞的核中分离得到，是果蝇中最主要的h m g 蛋白，由肋，徊 基因编码，卿基因位于果蝇第二染色体右臂5 7 f 1 0 位点。h m g d 蛋白含有典型 的h m g 框结构模式( h m g - b o xm o t i f ) ，是哺乳动物中h m g b 蛋白的同系物。h m g d 蛋白分子量小、分布丰度较大，具有染色质构建因子的功能，参与染色质的组装。 h m g d 蛋白通过结合d n a 并使之发生弯曲，为组装核蛋白复合物提供方便。此外， h m g d 是一种母型蛋白，在卵巢和胚胎发育的中囊胚过渡之前丰度最大，对于最初 的胚胎发育非常重要。有研究表明，在果蝇发育的中囊胚过渡之前，h m g d 可以取 代h 1 参与染色质的组装，但h m g d 参与形成的染色质结构较为疏松，这有利于胚 胎发育早期的快速卵裂。但另有实验表明，h m g d 和h l 没有相同的结合d n a 的 特征，而且h m g d 不仅在雌性成体和早期胚胎中表达，在胚胎发育的后期以至整 个发育时期都有表达。因此，h m g d 可能不仅仅在果蝇早期胚胎发育过程中具有参 与染色质构建的功能，很可能在果蝇整个发育过程中具有其它重要的尚未可知的 功能。 本研究采用u a s g a l 4 系统，通过功能获得性突变的方法研究了在广泛表达的 g a l 4 驱动子( a c t g a l 4 ) 的控制下过量表达肋躲d 对果蝇化蛹及血细胞发育影响的分 子机制。结果表明，卿广泛过量表达突变体幼虫在一龄和二龄期发育正常，而在 三龄幼虫化蛹时发育异常，发育停滞在三龄幼虫末期至预蛹的阶段，即卿过量 表达的幼虫不能正常化蛹。采用喂食蜕皮激素的方法，也不能挽救突变表型，说明 过量表达删没有影响果蝇体内蜕皮激素的合成和释放，而可能是过量表达 胁醐r d 影响了蜕皮激素信号途径相关基因的表达。分别提取三龄幼虫中期、后期至 预蛹前的各时期幼虫r n a ，用i m p c r 的方法检测了蜕皮激素受体基因的表达情况。 结果显示，与野生型相比，过量表达聊突变体中三龄幼虫蜕皮激素受体基因 艮r 卅、e 壤一c 的转录没有发生显著变化，而异构体& r b 却没有表达。表明过量 表达聊可能抑制了蜕皮激素受体基因脚一召，从而导致幼虫化蛹失败。础坷 缺失突变体的发育缺陷也和本研究系统中的突变幼虫表型一致，进而说明h m g d 过量表达，通过抑制了蜕皮激素受体基因础坍的表达，导致蜕皮激素受体途径下 游基因如e 乃表达紊乱，从而引起化蛹失败。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 本研究组前期工作发现，过量表达聊引起果蝇幼虫体内血细胞增生，并出 现黑色素瘤，为探讨劢，姻过量表达导致了血细胞增生即形成黑色素瘤的分子机 制，本研究分别提取三龄中期、后期和相对于野生型化蛹前时刻的幼虫的r n a ，首 先检测了编码酚氧化酶( p 0 ) 级联反应途径中的两个关键基因尸尉e 印以劢在突 变体中的转录发生变化，结果发现，印以列在三龄中期的表达量低于野生型，而 纠m e 的表达高于野生型，表明过量表达聊影响了酚氧化酶级联反应途径，低 水平的s p n 2 7 a 不足以抑制p p a e 的活性，活化的p p a e 催化了p p o 的活性，使其 转变成有活性的p o ，从而促进黑色素的生成，使果蝇体内产生黑色素瘤。因此我 们推测，h m g d 可能参与果蝇的免疫反应，这和脊椎动物炎症细胞中检测到高浓度 的h m g b l 蛋白一致。之后我们又发现，过量表达聊引起编码核小体重组因子 n u i 催化亚单位尽聊基因高表达，编码细胞周期蛋白a 、e 的基因缈，刎、缈砌e 高表达。可能这些途径相互作用，导致了突变体幼虫血细胞的增生。由此也可以表 明，卿可能在发育的多个途径中都有关键性的作用。 关键词：果蝇；删；过量表达；化蛹；血细胞增生；黑色素瘤 a b s t r a c t a sa 1 1 妇p o i r t a n tm o d e lo r g ；痂s m ，d ，切s 印，z 妇h a sm a d ec o n t r i b u t i o nt ot h er e s e a r c h o ng e n e t i c s ，m o l e c u l e sb i o l o g ) ra n dd e v e l o p m e n t a lb i o l o 够i na d d i t i o n ，a b o u t2 3g e n e s o fh 啪a nb e i n gw m c hc a u s ed i s e a s ei i l c l u d i n gg e n e sr e l a t i v et oc a l l c e r ，c a nb ef o u l l di n d r o s o p h i l a a l ss i m i l a rg e n e s 7 r i l eh i g hm o b i l i t ) rg m u pp r o t e i n sg e n e ( 月h 乇g d ) ，s “e do nt h e r i g h t 鳓o ft h e2c h r o m o s o m e5 7 f 1o ，e n c o d e st 1 1 ed r d j 印办妇h o m o l o g u eo fh i 曲 m o b i l i 够g r o u pp r o t e i n s h m g d ，m em o s ta b 蚰d a n th m gp r o t e i ni nd 珊印，z 妇，w a s i s o l a t e d ：f i r s t l yb yb a s s u ki n l9 8 2 i ti sc l o s e s tt ot h eh m g bs u b f 锄i l yo fm a m m a l s 鳓m c t u r a l l ya n df m l c t i o n a l l y ，b o t hh a v i n gm eh m g - b o xm o t i fa n dm o u g h tt ob e a r c h i t e c t u r a lf a c t o r si i la s s e m b l i n gc i 0 m a t i l l h m g dc a nb e n dd n aa n df a c i l i t a t e f o 肌i n gm ec h r o m a t i n - p r o t e i nc o m p l e x e s i na d d i t i o n ，月砌g di s m a t e m a l e f l e c tg e n e ， 锄d 吐i e 锄o u n to fh m g di st l i 曲e s ti no v a r i e sa n de 矾ye m b r ) ，o s ，e s p e c i a l l yb e f o r et 1 1 e m a t e m a l z y g o t i ct 啪s i t i o n ( m z t ) aw e a l t ho fs c i e n t i ce v i d e n c es u g g e s t e dt h a th 1c a i l b es u b s i t i t u c e db yh m g di n v o l v e di na s s 锄b l i n gc h r o m a t i no r d e r l y ，w h i c hr e d u c e st h e c o m p a c t n e s so fc l l r o m a t i np a c l 【i n gd u r i n gt h ev e 巧e a d yd e v e l o p m e n to fd 坶哪f 肠 h o w e v e r ，t h ec o m p a r i s o no ft h ed n a - b i n d i l l gc 印a c i 够a n ds p e c i f i c i 够i nr e c o g n i t i o no f d n ac l e a r l ys h o w e dm a th m g dd o e sn o ts h a r em eb i n d i n gp r o p e r t i e sw i t l lm s t o n eh 1 m o r e o v e r h m g di se x p r e s s e dn o to i l l yi i la d u l tf e m a l e sa i l de a r l ye m b 巧o sb u ta l s o d u d n gl a t e re m b r y o 面cd e v e l o p m e n t ，s u g g e s t i n g t h a th m g dm a ye x e r to t h e rf 吼c t i o n s t h a i lm a to fas p e c i f i ce 砌ye m b r y o i l i cs u b s t i t l l t co fh 1 t h e s er e s u l t si m p l i c a t em a t h m g dm a yh a v eo t h e rl m k n o w n 劬c t i o l l st l l a i lo i l l yp l a yag e n e r a jm i t o s i s - r e l a t e dr o l e d u r i n ge a r l ye m b i y o g e n e s i s t ba n a l y s et l l em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fo v e r e x p r e s s i o no f 月砌g | do nt h ep u p a t i o n a n dh e m o c y t e sd e v e l o p m e mi nd 坶9 p 办f 概、v el l a v eg e n e r a t e dp 删印月b t g dt 啪s g e l l i c n i e sa n do v e r e x p r e s st l l i sg e n eu n d e rt h ec o n t r o lo fau b i q u i t o u sg a l 4p m t e i n sa c t g a l 4 o u rs t u d yd i s p l a y e dt 1 1 a t 日j 鹳2 ) o v e r e x p r e s s i o nm u t a n td i e da sl a t et h i r di n s t a rl a i v a ea n d m a l f o h n e dp u p a em i r i n gt h el a n ，a e p r e p u p at r a n s i t i o i l ，s u g g e s t s 廿l a to v e r e x p r e s s i o no f 砌碰) h a se 髓c t sr a t h e ro nt h et h j r di n s t a rl a n r a u es t a g em a no nt h ef i r s ta i l ds e c o n di n s t a r 1 a r v a e 丘。o mm em l l t a n tc o u l dn o tp u p a t e e c d y s o n ef e e d i n ge x p e r i m e n t sc o u l dn o tr e s c u e m e s em u t a n tl a n r a e w ei 1 1 f i e 玎e dt 1 1 a to v e r e x p r e s s i o no f 日砌g dd i dn o ta f f e c tm ed e c r e a s e i l lt l l ee c d y s o n et i t e r ，b u ta f r e c t e dt h e 仃a n s c r i p t i o no fs o m eg e n e so nn l ee c d y s o n e s i g n a l i n gp a t h w a yt bd e t e c t e dt l l et e m p o r a lp a 戗e m so fe x p r e s s i o nf o r l ee c d y s o n e r e c e p t o rg e r l e 上弛r ，e x 协a c t e dr n a 丘o m1 a r v a es 锄p l e so fm i d m i r di i l s t a r ，l a t c - t 1 1 i r d i n s t a ra 1 1 dp d o rt op u p a t i o n ，w a sa n a l y s e d b yr t - p c r o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tc o m p a r e t ow i l dt y p e ，t h et e m p o r a le x p r e s s i o np a ：t t e m so f & r 彳，e e 尺一cw a sn o ta f f e c t e d ，w h i l e t h ee x p r e s s i o no fe c r 坷w a sn o td e t e c t e di i lt l l em u t a i 】tl a n ，a e t 1 1 i sr e s u l ti 时e r r e dt h a t n l 硕士学位论文 m a s t r st h e s i s m eo v e r e x p r e s s i o no fh m g dc o u l d p r o b a b l yb l o c kt l l et r a l l s 嘶p t i o no f e e r 。b g e n e ，w h i c hl e a d i n gt l l ef a i l u r eo fp u p a t i o n n ep h e n o 咖eo f 砌l g do v e r e x p r e s s i o n m u t a n ti 1 1o u r 咖d yw a u st h es a m ea u sm ee c r 召d e f e c t i o nm u t a n t ，w h i c hc o 蚯衄e do u r p r e d i c t m a tu b i q u i t o u so v e r e x p r e s s i o no fh m g dr e s u l t si nt t l ef i a i l u r eo fp u p a t i o nb y r e p r e s s i n gt h e 觚l s c r i p t i o no fe c 尺一ba i l dt l l e ni n d u c e dt h ee x p r e s s i o no fs o m e d o w n s 骶锄g e n e sl i k ee 乃o nt 1 1 ee c d y s o n es i g i l a i i n gp a t h w a yd i s o r d e r l y o u rp r e v i o u ss t u d i e sh a v es h o w n l a tu b i q u i t o u so v e r e x p r e s s i o no f 砌1 2 ：) c a u s e d h e m o c y t e sp r o l i f e r a t i o na n dt h ef o m a t i o no fm e l a n o t i ct u i t l o r si nt h ez ) ，d f d p 7 i 妇l 钺v a e t oc 1 撕矽t h em e c h a l l i s mo fm e l a i l o t i ct u m o r s 印p e a r a n c e ，w ea l s og 锄e r a t e dr t p c r a u l a l y s i st ot e s tt h et m s c r i p t i o n a lc h a n g e so f 删ea n d 印以硝，坩l i c he n c o d et h ek e y f a c t o r si i lt h ep h e n 0 1 0 x i d a s e ( p 0 ) c a s c a d ep a t h 、硼y 疗o m1 a r v a es a j n p l e so fm i d 。t h j r d i n s t a r ，l a t e - t l l i r di n s t a ra i l dp d o rt op u p a t i o nr e l a t i v et ow i l dt y p en i e s o u rr e s u l ts h o w e d t h a t 洫t h e 崩啊归o v e r e x p r e s s i o nm i d - m i r di n s t a u rl a r 、，a e ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f 勋n 2 搿 w a sl o w e rt h a n 嘶1 dt y p e ，o m e 刑i s em ee x p r e s s i o nl e v e lo f 删ew a s m g h e rt h a n 晰l d t ) ，p e ns u g g e s t st h a to v e r e x p r e s s i o no f 月砌g da f r e c t sm ep oc a u s c a d ep a t h w a y o u r e x p l a i n a t i o ni s 嬲f o l l o w ：a c t i v 时o fp p a ec o u l dn o tb ei 1 1 l l i b i t e dc o m p l 酏e l yb ya s m a l lq u a n t i 够o fs p n 2 7 a ，w h j c hc a t a 】y z et h ei n a c t i v ef o n np p ot ot h ea c t i v ef o n i l p 0 ，c a l u s e dt h em e l a n o t i ct l l m o ra p p e a r a l l c e w bc o n c l u d e dt 1 1 a th m g d p e r h 印si n v o l v ei nt h ei i l i l a t ei 舢枞l i l i 母o fd 阳印础妇， w 1 1 i c hi sc o n s i s t a l l t 耐mm er e s u l t 丘- o mv e r t e b r a t et h a t t 王l eh i g l lc o n c e n t 】眦i o i l si nm e i n n a l 衄a t o r yc e l l w 色a l s of o u n d 吐l a t 压睨w l l i c he n c o d e s 廿l en u c l e o s o m er e m o d e l i n g f a c t o 删r f ) c a t a j y z es u b u i l i t ，a i l dt l l eg e n e 垆，玩4 ，缈砌ew e r eo v e r e x p r e s s i o ni i lt h e 月打q 豇) o v e r e x p r e s s i o nm m 觚tl a n ，a c t h e s er e s u l t ss u g g e s tt l l a to v e r e x p r e s s i o no f ，抛。z ) c a u s e sh 锄o c y t e sp r o l i f e m t i o nb ym u l t i s i g l l a l sp a 吐1 w a y 锄da l s od e m o i l s t m _ 把st h a t 砌g dm a yp l a yak e yr o l eo nn l ed e v e l o p m e n to fd ，d s 印，z 池 k e yw o r d s ：d ，d s 印而池；胁廷p ；o v e r e x p r c s s i o n ；p u p a r i u m ；h e m o c y t e sp r o l i f e r a t i o n ； m e l a n o t i ct i l m o r 1 v 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 诊岛日期：汕睥6 月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名： 4 乡= 廖 导师签名： 日期：a 舯学年多月弓日日期：纷6 月弓日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圃重途塞握交后进卮! 旦圭生；旦二生；旦三生筮鱼! 作者签名： j 种恕 日期：汕睁6 月多日 2 翱签名：扔魂 日期：7 哆年莎月多日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 前言 黑腹果蝇( 三帕s d p 办妇心肠船昭硼研) ，简称果蝇，属于节肢动物门 ( a n b r o p o d a ) 、昆虫纲( 1 1 1 s e c t a ) 、双翅目( d i p t e m ) 、果蝇科( d r o s o p l l i l i d a e ) 、果 蝇属( 腑印j 1 2 妇凡胞，2 ) 。自然界中果蝇一般以腐烂的果实为食。果蝇的生活周期包 括卵、幼虫、蛹和成虫四个完全变态的发育阶段，其中幼虫又分为一龄、二龄及三 龄三个时期，初生卵发育至新羽化的成虫为一个完整的发育周期，在2 5 ，6 0 相 对湿度条件下，大约为1 0 天。果蝇有4 对染色体，雌蝇3 对常染色体和1 对) ( ) 【染 色体，雄蝇3 对常染色体和l 对x y 染色体。果蝇具有易饲养、繁殖快、生命周期 短、染色体数目少且有粗大的多线染色体而便于进行基因的定位研究等优势，长期 以来一直是经典遗传学和发育生物学理想的研究材料，在近一个世纪以来的生物学 舞台上占有举足轻重的地位( 桂建芳等，2 0 0 2 ) 。近年来，在对果蝇与人类基因的 比较中发现，三分之二引发人类疾病的基因在果蝇中都存在类似的基因( 刘立， 2 0 0 0 ：j i i l 等，2 0 0 3 ) 。同时，随着果蝇基因组测序的完成，分子生物学及其技术应 用的快速发展，以及果蝇和人类存在较多同源基因等优势，使得果蝇成为近代分子 遗传学、分子发育生物学、神经生物学等各科学研究领域中理想的模式生物。 真核生物基因表达调控的特点，就是在特定的时间和特定的细胞内激活特定的 基因，从而实现预定的、有序的、不可逆的分化发育过程，使特定的组织器官行使 不同的功能，这就决定了真核基因表达调控必然是一个多级的复杂过程，其包含了 蛋白质一蛋白质、蛋白质一d n a 问广泛的相互作用，大量调节蛋白质的参与以及复 杂的大分子复合物的形成。其中作为基因表达的第一个环节染色质d n a 水平以及 转录起始水平的调控最为重要和复杂，而在该过程中高流动性蛋白( 1 l i 曲m o b i l i 锣 g r o u pp r o t e i n ，h m g ) 起着极为重要的作用( 徐佳等，2 0 0 5 ) 。 1 1h m g s ( 高流动性蛋白) 简介 h m g 蛋白，即高流动性组分蛋白( h i 曲m o b i l i 锣g r o u pc l o m o s o m a lp r o t e m s ) ， 为非组蛋白中一类重要的蛋白家族，最早由英国科学家g o o d 谢n 在牛胰腺细胞中首 次发现，并因其能在聚丙烯酰胺凝胶电泳中高速泳动而得名。广义的h m g 蛋白包括 两类：瑚订俨基序蛋白和经典的h m g 蛋白。 h m g 一基序蛋白含有两部分结构域，除含有与一个或数个h m g 的d n a 结合结 构域，还含有特异的非h m g 功能结构域。该类蛋白在细胞中含量相对较少，且分布 硕士学位论文 m a s t r s1 h e s i s 具有细胞特异性，与d n a 选择性结合于所调控基因的启动子和增强子区域 ( g r o s s c h e d l 等，1 9 9 4 ) 。 经典的蹦g 蛋白分子量小、在细胞中含量丰富，可以与d n a 结合、序列特异 性低、在自然界生物中广泛存在且高度保守。从低等生物到高等的人类，都含有这 种和d n a 结合的高度保守蛋白。经典的删g 蛋白具有帮助染色质核小体组装功能， 在执行和调控核功能方面发挥极为重要的作用，广泛参与多种重要的核内生物调控 过程，其对基因表达转录的调控最为明显。经典的h m g 蛋白可以与转录因子以及组 蛋自形成复合体，通过扭转、弯曲、修饰d n a 的结构来调节d n a 复制、转录、重组 等功能( n o m a l s 等，2 0 0 1 ) 。h m g 蛋白根据其与d n a 结合的功能结构模式不同，可以 分为三类：h m g a ( 原h m g i 厂y c ) ，以a t h o o k 为特征结构域( 见图1 a ) ；h m g b ( 原 h 】g l 2 ) ，其特征性结构域是h m g b o x ( 见图1 b ) ：h m g n ( 原h m g 1 4 1 7 ) ( h o c k 等，2 0 0 6 ) ，含有独特的核小体结合结构域( n u c l e o s o m a lb i n d i n gd o m 斑，n b d )( 见 图1 c ) 。在一个细胞中，h m g b 的含量最多，约占组蛋白的l 1 0 ( b u s t i l l 等，1 9 9 9 ) 。 i m g b 蛋白，是一类低分子量非组蛋白，含有高度保守的h m g b o x ( a 和b ) 结构 域( w e i r 等，1 9 9 3 ) ，且具有富含天冬氨酸和谷氨酸的c 末端结构域，该酸性末端结构 域调控h m g b 蛋白对不同d n a 显示不同的亲和力。此类蛋白结合d n a 时没有序列特 异性( s e q u e n c e i n d e p e n d e n t m a i l i l e r ) ( b u s t i n 等，1 9 9 9 ) 。h m g b 蛋白协助转录因子和其 它核蛋白复合体结合到相应的d n a 区域，以完成各种生物学功能( a 1 e s s a n d r a 等，2 0 0 3 ) 。在哺乳动物中，h m g b 蛋白又可以分为三类：h m g b l 、h m g b 2 、阳g b 3 ， 三种蛋白都从胚胎开始表达，h m g b 2 、h m g b 3 随着胚胎的发育表达下调( v a c c 撕 等，1 9 9 8 ；r o i 妇l i 等，2 0 0 l ；n e m e t l l 等，2 0 0 3 ) ，而h m g b l 的表达一直存在于胚胎和 成体中( m u l l e r 等，2 0 0 4 ) 。h m g b l 蛋白由巨噬细胞分泌，具有细胞因子功能，能激 活先天免疫过程，它还与细胞迁移、肿瘤入侵等有关( l o 切e 等，2 0 0 5 ) 。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s h m g a l a ，b ，h m g a 2 hm g a1c a 飞a 弋a 弋 a h m g a 蚀m l i y h m g b l ，h 隧g 8 2 ，h m g 8 3 b o x lb o x 2 。 h m g b f a m i l y b h m g nj j i ，纠m g n 2 h m g n 3 a ，b ，h m g n 碡 n s b p l nb d 4 5 nbdc huo h m g n a m i l y c 。 图1 ：l 玎垤g s 蛋白结构域佃施k ，2 6 ) 1 t h e 啪i ns t n l c 钿髓i 蛔t l i 懈o f t h e 删【低陬i 2 0 0 6 ) ( a ) h m g a 蛋白：包含三个a t - h o o k 结构域和个酸眭c 末端； ( b ) h m g b 蛋白：三个 i m g b 家族都包含两个h m g b o x 结构域和一个延长的c 末端； ( c ) h m g n 蛋白：包含一们u l e 0 s 0 m mb 砌i r 曙d o m a i n ( n b d ) 结构域和叫、c h 删1 1 a 士i n 岫内1 d i n gd o m a j n ( c h u d ) 结构域。 ( a ) h m g a 舯嘶i n a l lh m g a s c 伽t 豳t h i 贺a t h 0 0 k s 锄d 锄a c i d i c c 乇咖砌p a n ) h m g bp 眦i n e a c h0 f t l l et h i m e m b e 巧o f t h e 玎g b 胁i l yc o n 诅i 1 1 st 、v oh m g b o x e s锄d 锄 e 1 渤d 酣a c i d i cc _ t e 唧i n u s ( c ) h m g np m t e i n 1 1 1 eh m g n 阳舵i n sc o n 切j na n u c l e o ! 煳1 a lb 砌堍d o m a i n ( n b d ) d o m a i n 锄da a t i n f b l d 吨d 0 呱l i n ( c h u d ) 1 2h m g d 简介 研究表明，在果蝇中与哺乳动物h m g b 蛋白同源的蛋白包括h m g d 、h m g z 、 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s d o r s a ks w i t c hp r o t e i n l ( d s p l ) ( w a 趴e r 等，1 9 9 2 ) 以及两个功能尚不清晰的基因c g 7 0 4 5 和c g 7 0 4 6 ( i 己a g a b 等，2 0 0 6 ) 。 h m g d 是果蝇中丰度最大的h m g 蛋白，与哺乳动物中h m g b 蛋白功能最为接 近，最早由b a l s s u k 等从果蝇胚胎细胞的核中分离得到( b a s s u k 等，1 9 8 2 ) ，其分子量小 但丰度较大。在结构上，h m g d 含有一个h m g 框结构模式( h m g - b o xm o t i f ) ；在染 色体上，励橼p 基因位于果蝇第二染色体右臂5 7 f 1 0 位点( w a 盟e r 等，1 9 9 2 ) 。h m g d 与组蛋白h 1 类似，与d n a 结合时没有序列特异性，并能结合染色质d n a 使其发生 弯曲。h m g d 会引起染色质的浓缩，但其浓缩程度较之h 1 引起的染色质浓缩要疏松 一些，在胚胎发育最开始的6 个核分裂周期没有组蛋白h 1 存在的情况下，h m g d 引 起染色质的疏松能够方便染色质的浓缩和去浓缩，这与早期胚胎发育快速卵裂有 关。实验表明，h m g d 不仅在雌体和早期胚胎中表达，在胚胎发育的后期以及整个 发育时期都有表达。因此，h m g d 可能不仅仅在果蝇早期胚胎发育过程中具有参与 染色质构建的功能，很可能在整个发育过程中具有其它重要的尚未可知的功能。 1 3p 因子俾e i e m e n t ) 以及u a s g a l 4 系统简介： 1 3 1p 因子( pe l e m e n t ) 简介 转座子是一类可以在基因组中移动的d n a 片段，p 因子是果蝇中一种重要的 转座子，果蝇的p 因子有两种类型，一类是全长p 因子，长2 9 0 7b p ，两端有3 3 b p 的反向重复序列( i r ) ，有4 个外显子，编码转座酶。另一类是不能编码转座酶，长 度从0 5k b 到1 4k b 不等。果蝇p 品系的基因组有3 0 5 0 份p 因子拷贝，其中约 三分之一是全长p 因子。全长p 因子的4 个外显子编码转座酶，但只在生殖系细胞 中实现完整的r n a 剪接，生成有活性的转座酶，相对分子质量为8 7 1 0 3 。在体细 胞中，i 矾a 剪接不完整，最后一个内含子未除去，因而只有前面3 个外显子编码产 生只有6 6 1 0 3 的转座酶，是没有生物学活性的。这就是p 因子在体细胞中转座的 抑制元件。 p 因子具有转座频率高、可操作性强等特点，且其转座具有组织特异性，仅发生在生殖细 胞中，因此经过改造的p 因子是理想的分子生物学工具。其中p 因子应用最为广泛的一个方面 是，作为转基冈的载体，将目的基因转入果蝇，即通过p 因子及酵母中半乳糖操纵子构建的 u a s - g a l 4 系统可以使u a s 下游的基因在果蝇特异的组织中特异地表达( 刘旭等，2 0 0 0 ) 。 1 3 2 功能获得性突变( g a i n o f f u n c t i o nm u t a t i o n ) 功能获得性突变( g a i n o f ：缸1 c t i o nm u t a t i o n ) ，是指某一功能蛋白的基因发生突 变后，导致该功能蛋白的功能增强，或者获得新的功能。反之，因基因突变导致蛋 4 硕士学位论文 m a s t e r s r h e s l s 白功能的丢失称之为功能缺失性突变( 1 0 s s o f 二 m c t i o nm u t a t i o n ) 。在传统的遗传检 测中，往往通过化学或电离辐射的方法来构建突变系统，产生很多的随机突变体。 转座子元件随机插入的方法也能获得大量的随机突变体。一般来说，通过这种方法 获得的突变体是减少或消除基因的功能。但据估计，在果蝇、秀丽隐杆线虫 ( c 台e ，z d 砌口6 访出e 锄睥瑚) 和酵母全部的基因中，约有2 3 的基因用功能缺失性突变 的方法突变后，并不能产生显性性状( m i k l o s 等，1 9 9 6 ) ，这可能是由于多基因之间 的功能重叠或互补( 觚c t i o n a lr e d u n d a n c y ) 造成的，因而研究这些基因时，功能缺 失性突变的方法就显得不得力。 然而少数的功能获得性突变可为基因功能的研究提供更为有用的信息，尤其是 在研究一些生命过程的负调节因子方面。由于功能获得性突变体为显性突变体，可 使目的基因在突变体内行使的功能得到相对放大，表型更易于观察，因此更利于研 究。而且运用功能获得性突变方法，并结合r n a i 的原理，亦可诱导出功能缺失性 突变体( r o 劬，1 9 9 6 ) 。另外，功能获得性突变表型既可以是靶基因( 魄e tg e n e ) 在异位表达，也可以是靶基因的过量表达。本文研究的基因胁纷g d ，是一种在体内 广泛表达的基因，在基因突变的研究过程中，没有发现对其活力有明显影响，只是 翅膀表型有一定改变( r a g a b 等，2 0 0 6 ) 。因此本研究采用功能获得性突变方法研究 该基因在果蝇发育过程中的作用。 1 3 3u a s g a l 4 系统简介 u a s g a l 4 系统是利用组织特异性启动子表达酵母的g a l 4 ( g a l a c t o s e r e g u l a t e d u p s 饥a mp r o m o t e re l e m e n t ，g a l ) 蛋白，而g a l 4 蛋白能够刺激带有上游激活序列 ( u p s 恤锄a c t i v a t i o ns e q u e n c e ，u a s ) 的靶基因，使其在生物体的特定组织特定时期 过量表达。g a l 4 即半乳糖调节上游启动子元件，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵 子的一个转录激活子。g a l 4 蛋白含有8 8 1 个氨基酸，是酵母中基因的调节子。在 酵母中，该蛋白通过结合到由1 7 个碱基组成的上游激活序列，调控g 么j d 和g 么j j 基因的表达( r o n h ，1 9 9 6 ) 。上游激活序列u a s 是酵母中另一种类似高等真核生物 增强子的序列。f i s c h e r 等( 1 9 8 8 ) 首次报道在果蝇中g a l 4 蛋白的表达可以激发 u a s 下游报告基因的表达，而且在果蝇中表达酵母的g a l 4 蛋白，并没有对果蝇表 现出明显的毒害效应。1 9 9 3 年，b m d 等发表了关于u a s g a l 4 系统在果蝇中应用 的里程碑式的文章( b r a l l d 等，1 9 9 3 ) ，奠定了u a s g a l 4 系统在果蝇基因功能研究 中的理论基础。后来，r o n h 等( 1 9 9 8 ) 又改进了u a s 的载体，用u a s p 代替了 u a s t ，使得靶基因不仅可以在体细胞中定点表达，而且可以在母体生殖细胞中高 效表达。这个新的系统还有一个优点，由于靶基因在卵母细胞中表达，因此就可以 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 使靶基因在早期胚胎中大量表达，这样该系统的运用范围又大大地扩展了。事实上， 目前该系统不仅应用于果蝇的研究领域，而且已经广泛应用到包括家蚕、爪蟾、斑 马鱼、水稻等多种生物的研究中( i i l l 锄嗽等，2 0 0 3 ；h a r t l e y 等，2 0 0 2 ；s c h e e r 等，2 0 0 2 ； j o h n s o n ，2 0 0 5 ) 。 u a s g a l 4 系统自建立以来，已经被广泛地用于功能获得性突变的研究，探讨 一些负调控因子的作用机理。该系统最主要的特点是，g 口f 4 基因和u a s 一靶基因 分别存在于两个不同的转基因品系中。在g 口以转基因品系中，存在激活蛋白g a l 4 ， 但没有靶基因可供激活；而在u a s 品系中，由于激活蛋白g a l 4 的缺乏，靶基因 处于沉默状态( p h e l p s 等，1 9 9 8 ) 。只有当带有g 口睁基因的母体与带有u a s 和靶基 因的雄体交配后产下的子代中，g a l 4 蛋白才有机会结合到u a s 上，使其下游的靶 基因过量表达( r o r 吐l 等，1 9 9 8 ) 。这样，即使异位或过量表达的基因是致死性的， 也可以保存u a s 转基因果蝇品系。而且g a l 4 蛋白活性温度范围是1 6 2 9 之间， 可为u a s g a l 4 系统功效的发挥提供一个弹性空间，即降低果蝇生存的温度，可以 减少靶基因表达的量，从而减小了u a s g a l 4 系统所发挥的效应。而2 9 可以达到 一个平衡点，既能够使g a l 4 达到最大的活性，又不会对果蝇的存活和繁殖产生影 响( d u 厨，2 0 0 2 ) 。 u a s g a l 4 系统由于可以控制靶基因在一定的时空条件下过量表达，因而提供 了一个理想的研究基因功能的工具( 图2 ) 。但u a s g a l 4 系统也有自身的局限性， 如过量表达的基因产物对生物产生毒害效应，则不能建立稳定的转基因品系，而且 不同的启动子所导致的g a l 4 蛋白过量表达的量不同，靶基因表达的量也不相同， 所以过量表达的蛋白绝对量无法实际定量，只能通过表达不同拷贝数的靶基因来相 对估计( p h e l p s 等，1 9 9 8 ) 。 6 硕士学位