二代测序流程.doc

Illumina测序的化学原理目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升一些常用的基本概念介绍：flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lanelane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条readsbp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bpjunction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junctionadapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能primer：PCR中的引物测序反应基本流程介绍：1、 建库A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的）B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端C、完成补平以后，在3端使用酶加上一个特异的碱基AD、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求建库示意图如下：2、 桥式PCRA、将上述的DNA样品调整到合适的浓度后加入到flowcell中，从而序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过互补配对结合，如下图：图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater，分别对应序列之前加入的两种adpaterB、连接以后就可以正式开始桥式PCR了。首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱C、加入缓冲液，使其反应环境变成中性，这时序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配D、进行下一轮PCR，在PCR的过程中，序列弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍E、如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫做cluster3、 测序测序的过程反而简单了不少。就是来一个primer，然后加入特殊处理过的A，T，C，G四种碱基。特殊的地方有两点，一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证每次只能够在序列上添加1个碱基；另一方面是，碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的N2改变成OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。如此往复，就可以测出序列的内容Illumina测序会有长度限制的原因：1、测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。通俗一点讲就是，比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，5