（化学工艺专业论文）纤维素酶在几种咪唑类离子液体中活性研究.pdf

中文摘要 近年来，以纤维素为原料得到乙醇、氢气等替代能源的工艺路线受到了人们 的广泛关注。这条工艺路线主要包括纤维素的预处理、酶水解、还原糖的发酵三 部分。目前的水解工艺需要将预处理后的纤维素分离出来进行，效率不高。用离 子液体这种新型溶剂溶解纤维素，其可行性已经在2 0 0 2 年被证实，由此为纤维 素的处理开辟了新的思路。如果可以在离子液体中同时完成纤维素的溶解、酶水 解，那么必然可以提高反应效率，更重要的是可以为清洁能源的生产提供更“绿 色”的生产工艺。 本实验研究了一系列离子液体中( 【c 4 m i m c l ，【c 6 m i m c l ，【c 8 m i m c l ， 【c 2 m i m b f 4 ，【c 4 m i m b f 4 ， c 6 m i m b f 4 ，【c s m i m b f 4 ， c 4 m i m p f 6 ，【c 6 m i m p f 6 ， 【c 8 m i m p f 6 ) 纤维素酶的活性和稳定性，以及体系中添加微量水后对纤维素酶稳 定性的影响，并且初步试验了离子液体纤维素酶回收重复利用的可能性。 对纤维素酶在离子液体中的活性的研究表明：在疏水性的离子液体中 ( 【c 4 m i m p f 6 、【c 6 m i m b f 4 、【c s m i m b f 4 ) 纤维素酶能保持很高的初始活性 ( 8 5 缓冲液初始酶活) 。其中在 c 4 m i m p f 6 中的初始酶活为纤维素酶本身活 性的9 4 。而在亲水性离子液体中则有不同程度的失活现象。从溶液极性的角度 看，纤维素酶在极性较高的离子液体中保持良好的活性。最佳的e n t 范围在o 6 7 0 6 8 之间。当离子液体的t 低于o 6 5 ，纤维素酶在其中失活严重，而过高的极 性也会对酶造成不利的影响。综合溶液的亲疏水性与极性这两个因素考虑，前者 的影响大于后者。纤维素酶在与水不互溶、极性强的离子液体中能保持良好的活 性。三种阴离子对酶活的影响不尽相同：c l 。会造成酶的严重失活，b f 4 离子液体 中纤维素酶较稳定，而p f 6 。离子不够稳定，容易分解，造成酶的失活。 对纤维素酶在离子液体中稳定性的研究表明：七天的培养中，纤维素酶在离 子液体中表现出了良好的稳定性。相比在缓冲液中2 0 的失活，离子液体中纤维 素酶的剩余酶活波动不大。说明离子液体环境能够起到保护纤维素酶的作用。 对体系中微量水分的影响的研究表明：向干燥后的离子液体中添加2 v v 的微量水分，并没有提高其中纤维素酶的活性，反而造成剩余酶活的损失，酶的 稳定性变差。说明2 v v 的添加量已经超过了酶的必需水量，造成了活性结构的 失去。这种现象在含p f ：的离子液体中更加明显。 【c 4 m i m p f d 纤维素酶的回用效果不佳，可以接受的使用次数是两次，但是 对于在离子液体对酶的固定化作用的研究，值得做进步的努力。 本实验通过一系列离子液体中纤维素酶活性和稳定性的研究，发现和揭示纤 维素酶在离子液体中的活性和稳定性规律，为寻找、设计既可以溶解纤维素，又 可以让酶在其中保持良好活性的新型离子液体，探索“一釜”反应器中离子液 体处理纤维素的工艺路线奠定了实验基础。 关键词：纤维素酶离子液体初始酶活性酶稳定性微量水分 a bs t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，p r o d u c i n ga l c o h o la n dh y d r o g e nf r o mc e l l u l o s ei sap r o m i s i n g i s s u et h a ti sa t t r a c t i n gp e o p l e se y e s t h i st e c h n o l o g yi n v o l v e st h r e em a i ns t a g e s ， w h i c ha r ep r e t r e a t m e n t ，h y d r o l y s i sa n df e r m e n t a t i o n t h ew i d e l yu s e dp r e t r e a t m e n t s o fc e l l u l o s ei n c l u d ed i l u t ea c i d ，d i l u t ea l k a l i n ea n ds t e a me x p l o s i o n h o w e v e r , t h e s e m e t h o d sa r eo fe n v i r o n m e n t a lh a z a r d o u sa n dl o we f f i c i e n c y t oh y d r o l y z et h e p r e t r e a t e dc e l l u l o s e ，t h ec o m m o np r o c e d u r ei ss e p a r a t i n gt h ec e l l u l o s ef r o mt h e p r e t r e a t m e n ts y s t e m ，a n da d d i n gc e l l u l a s ei n t ot h ep r o p e rh y d r a t i o nm i x t u r e s o b v i o u s l y , t h i sp r o c e s si n v o l v e sa n o t h e rs e p a r a t i n gs t e p ，a n dt h eh y d r o l y t i cr e a c t i o ni s h e t e r o g e n e o u s t h u s ，t h ee f f i c i e n c yo ft h i se n z y m a t i ch y d r o l y s ep r o c e s si sa tal o w l e v e l i tw a sf o u n dt h a tt h ei o n i cl i q u i d s ( i l s ) c o u l dd i s s o l v ec e l l u l o s ei n2 0 0 2 ，w h i c h h a so p e n e du pan e ww a yt o p r e t r e a tc e l l u l o s e i tw i l lb eg r e a tp r o c e s si ft h e d i s s o l v i n ga n dh y d r a t i o no fc e l l u l o s ec o u l db ea c c o m p l i s h e di ni l ss i m u l t a n e o u s l y , f o ri n t h i sw a y , t h ee f f i c i e n c yw o u l ds u r e l yb e c o m eh i g h e r f u r t h e r m o r e ，t h i s t e c h n o l o g yc o u l dp r o v i d ea “g r e e n e r a p p r o a c ht og e tt h e “c l e a n ”e n e r g y i n t h i st h e s i s ，c e l l u l a s eh a sb e e ni n v e s t i g a t e di nt e nk i n d so fi m i d a z o l i u mi l s ( c 4 m i m c l ，【c 6 m i m c l ，【c s m i m c l ，【c 2 m i m b f 4 ，【c 4 m i m b f 4 ，【c 6 m i m b f 4 ， c s m i m b f 4 ， c 4 m i m p f 6 ，【c 6 m i m p f 6 ，【c 8 m i m p f 6 ) t h ee f f e c to fa d d i n gs m a l l a m o u n to fw a t e rt ot h es y s t e mw a se v a l u a t e dt o o a tl a s t ，t h ep o s s i b i l i t yo fr e c y c l i n g t h ei l c e l l u l a s ew a sp r i m a r i l yt e s t e d t h er e s u l t so b t a i n e da b o u tt h ec e l l u l a s ea c t i v i t i e ss h o w e dt h a t ：c e l l u l a s e m a i n t a i n e dh i 。g hi n i t i a la c t i v i t i e s ( 8 5 o fi t sn a t i v ea c t i v i t y ) i nw a t e ri m m i s c i b l ei l s ( c 4 m i m p f 6 ， c 6 m i m b f 4 ，【c s m i m b f 4 ) t h eb e s tr e s u l tw a sg o ti n 【c 4 m i m p f 6 ，i n w h i c ht h ei n i t i a la c t i v i t yw a s9 4 o ft h en a t i v ea c t i v i t y d e c r e a s e si ni n i t i a la c t i v i t i e s w e r eo b s e r v e di nw a t e rm i s c i b l ei l sm o r eo rl e s s t h eb e s ta c t i v i t i e sw e r eg o ti nt h e i l sw i t he n t r a n g i n gf r o mo 6 7t oo 6 8 c e l l u l s ed e a c t i v a t e dt oal a r g ee x t e n di ni l s w i t he n tl o w e rt h a n0 6 5 p a s s i v ei m p a c t so c c u r r e dw h e ne n tv a l u ew a sm u c ht o o h i g h c o m p a r i n gt h ea s p e c t so fh y d r o p h i l i c i t ya n dp o l a r i t y , t h ei n f l u e n c eo ff o r m e r o n ei sg r e a t e rt h a nt h el a t t e ro n e t h a ti s ，t h eh y d r o p h i l i cs o l v e n t sw o u l dd oh a r mt o e n z y m e se v e ni ft h e ya r eh i g hp o l a ro n e s t h ee f f e c t so ft h r e ek i n d so fa n i o n sw e r e d i f f e r ：c e u u l a s ed e n a t u r e ds e v e r e l yi ni l sc o n t a i n i n gc i 。w h i l ei tw a sm o l es t a b l ei n 【c n m i m b f 4 p f 6 w a su n s t a b l ea n dp r o n et od e c o m p o s e ，w h i c hl e dt ot h ee n z y m e s d e n a t u r a t i o n n er e s u l t so b t a i n e da b o u tt h ec e l l u l a s es t a b i l i t ys h o w e dt h a t ：t h ec e l l u l a s e s t a b i l i t ym a i n t a i n e dw e l li ns e v e nd a y sc u l t i v a t i o ni ni l s t h er e s i d u a la c t i v i t i e si ni l s w e r eo fl i t t l ef l u c t u a t i o nw h i l et h o s ei nb u 讯rw i t n e s s e da2 0 l o s s t h i s p h e n o m e n o ni n d i c a t e dt h a tt h ei l sc o u l dp r o t e c te n z y m e s t os o m ee x t e n t t h er e s u l t so b t a i n e da b o u tt h ee f f e c to fs m a l la m o u n to fw a t e rs h o w e dt h a t ： a d d i n g2 v vw a t e rt ot h ed r i e di l sd i dn o te n h a n c et h ea c t i v i t i e sb u tc a u s e dd a m a g e s i nr e s i d u a la c t i v i t i e sa n da g g r a v a t e dt h es t a b i l i t i e s t h u s ，t h e2 v vw a sb e y o n dt h e e s s e n t i a lw a t e rr e q u i r e m e n t sa n dt h ee x c e s s i v ea m o u n to fw a t e rb r o u g h tt h ep r o t e i n c o n f o r m a t i o naf l e x i b i l i t ys u f f i c i e n tt oa l l o wd e n a t u r a t i o n 1 1 1 er e u s eo f c 4 m i m p f 6 c e l l u l a s ed i dn o tg e ta ne x c i t i n go u t c o m e f r o mt h e p r i m a r i l ys t u d y , 【c 4 m i m p f 6 c e l l u l a s e c o u l do n l yb ee m p l o y e dt w i c e b u tt h e i m m o b l i l i z a t i o ne f f e c to fi l sd e s e r v e sf u r t h e rs t u d y 1 1 1 i se x p e r i m e n tw a sap r e p a r a t i o nt of i n da n dd e s i g ni l st h a tc a nd i s s o l v e c e l l u l o s ea n dp r o v i d eg o o de n v i r o n m e n tt oc e l l u l a s eh y d r a t i o n ，a n dt oo b t a i ni l so f t h e s ep r o p e r t i e si sc r u c i a lt o “o n ep o t ”t e c h n o l o g yt ou t i l i z ec e l l u l o s e k e y w o r d s ：c e l l u l a s e ，i o n i cl i q u i d s ，i n i t i a la c t i v i t y , e n z y m es t a b i l i t y , w a t e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和l 致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丕鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：取1 9 i 船脚 签字同期： j 叨7 年月f 同 学位论文版权使用授权书 奉学何论延作名每算潮i 叁盗盘鲎：甭善筠罐k 堪用学位论文的规氪 特授权苤盗苤鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，月：采刖影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位沦文作者签名：孓r 占i i 叶 导师签名：衣数氏 签字= l 期：泗7 年 月i 同签字同期：孙7 年亏月弓j 7 同 天津大学硕士学位论文离子液体中纤维素酶活性的研究 第一章文献综述 1 1 非水溶剂中的生物催化反应 生物催化反应的天然溶剂为水溶液或缓冲液。通常人们认为在这样的水环境 中，生物催化剂如酶、酵母及全细胞等可以保持良好的生物催化活性。而有机溶 剂则通常被视为变性剂，生物细胞、蛋白质等活性物质在其中会失去其完整性或 造成结构的改变，从而失去活性。这一传统观念限制了酶的广泛使用。 早在2 0 世纪3 0 年代，人们就已经发现酶在几乎无水的有机溶剂中仍有活性， 但直到2 0 世纪7 0 年代末期才证实了酶在有机溶剂中确有活性。1 9 7 7 年，俄罗 斯莫斯科l o m o n o s o v 大学的k l i b a n o v 教授报道了在接近无水的介质中的酯化反 应。在非水溶剂中展开生物催化的研究于2 0 世纪8 0 年代初有了突破性的进展。 19 8 5 年k l i b a n o v 教授i l j 发表在p r o c e e d i n g so f t h en m i o n a la c a d e m yo fs c i e n c e s 上 的报道综述了酶在有机介质中的催化条件和特点。这篇文章报道了他们在含微量 水的有机介质中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等有机化合物，并证实了酶在 1 0 0 的高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且显示出很高的催化活性。 k l i b a n o v 教授明确指出：只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化 天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶可以在与水互溶或不相容的有机溶 剂体系中，甚至在仅含微量水或近乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。这一发 现为非水酶学研究的里程碑，此后二十多年来非水酶学更是有了突飞猛进的进 展。除了传统的有机溶剂，新的非水介质和反应体系也大量涌现。如超临界溶剂 【2 ，3 1 ，氟溶剂1 4 , 5 】，微乳液1 6 ，液晶r 刀，高密度共熔悬浮液【8 1 ，反相胶束体烈9 1 等。 1 1 1 非水溶剂中生物催化的优点 与传统水溶液体系相比，在非水溶剂中的生物催化反应有其自身的优点f l o 】。 表现在： 1 增强反应物的溶解度。在有机溶剂中开展生物催化反应，一个显著的优 势就是可以利用许多不溶于水的反应物。2 0 0 0 年d a i 1 1 】报道了苯硫基甲烷在接近 无水( 9 9 7 ) 的异丙醇和甲醇中用辣根过氧化物酶催化不对称硫氧化反应，在 相同条件下测得该反应比在水中快几十倍到几百倍不等。其它酶催化反应中也有 第一章文献综述 类似的结果。尽管辣根过氧化物酶本身内在的活性在有机溶剂中比在水中的低几 百倍，但是由于底物的溶解性远远高于在水中的溶解性，使得酶表现出很高的反 应活性； 2 在有机介质中改变反应平衡。如果一个反应的反应物溶于有机溶剂，产 物溶于水，或相反，那么可以利用水有机溶剂体系推动反应进行； 3 易于分离。水的蒸发焓很高( 5 7 3 6 k j t o o l d ) ，相比之下，有机溶剂的蒸 发焓要低的多，比水更容易分离； 4 增强酶的稳定性。酶的稳定性在含极少量水的有机介质中表现的很高， 胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中2 0 放置6 个月后酶活力没有降低，而同样温度下 酶在水溶液中的半衰期只有几天； 5 改变酶的选择性。溶剂对反应影响最深远的是改变酶的选择性，包括底 物专一性、对映选择性、前手性选择性、位置选择性和化学选择性【1 2 , 1 3 。 1 1 2 非水溶剂中酶的结构与性质 1 1 2 1 非水溶剂中酶的结构【1 4 】 酶在有机溶剂中的形态主要为两大类：第一类为固态酶，包括冻干的酶粉或 固定化酶，它们以固体形式存在于有机溶剂中；第二类为可溶解酶，主要包括水 溶性大分子共价修饰酶和非共价修饰的高分子酶复合物、表面活性剂酶复合物 及微乳液中的酶等。 酶不溶于疏水性有机溶剂，它在含微量水的有机溶剂中以悬浮状态起催化作 用。研究表明酶在许多有机溶剂中并不变性，而且还能表现出催化活性。学者们 对酶在水相中与有机相中的结构进行了比较，他们的实验证实了在有机相中酶能 够保持其整体结构的完整性。有机溶剂中酶的结构，至少是酶活性部位的结构与 水溶液中的结构是相同的。利用x 射线晶体衍射技术研究蛋白质在有机溶剂中 的结构，可以得到蛋白质结构的直接信息。对c a r l s b e r g 枯草杆菌蛋白酶在乙腈 中的研究、胰凝乳蛋白酶晶体在正己烷中的研究都支持酶在有机溶剂中蛋白质分 子骨架的构象与水中相比没有明显的变化。 显然并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象、保持酶活 性。碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈和丙酮中，酶发 生了不同程度的不可逆失活。 溶剂中的水分子对于酶的结构有重要影响。酶作为蛋白质，它在水溶液中以 一定构象的三级结构状态存在。这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的一种 紧密( c o m p a c t ) 而又有柔性( f l e x i b i l i t y ) 的状态。紧密状态主要取决于蛋白质 分子内氢键，溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键使蛋白质分子内氢键 天津大学硕士学位论文离子液体中纤维素酶活性的研究 受到一定程度的破坏，蛋白质结构变得松散，呈一种开启( u n l o c k i n g ) 状态。这 时，酶分子的紧密和开启两种状态处于一种动态平衡之中，表现出一定的柔性。 酶悬浮在含微量水的有机溶剂中，与蛋白质分子形成氢键的水分子很少，蛋白质 分子的内氢键起主导作用，蛋白质分子刚性( r i g i d i t y ) 增加，柔性减少，限制了 蛋白质构象向热力学稳定状态转化，同时增加了其稳定性。 1 1 2 2 非水介质中的酶学性质 1 稳定性 有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。k l i b a n o v 的报道 中，猪胰脂肪酶( p p l ) 在有机溶剂中1 0 0 时的半衰期可达数十小时，而在水 中1 0 0 。c 几乎马上失活l l 引。k 1 i b a n o v 认为有机溶剂中酶的热稳定性比水溶液中高 的原因是由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，因此由水而引起的酶分子中 天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用，天冬氨酸肽键的水解、二硫键的破坏、半胱 氨酸的氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活的全过程难以进行。 2 特异性1 1 6 】 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。酶与底物 的结合能取决于酶与底物复合物的结合能和酶、底物及溶剂相互作用能的差。因 此，酶与底物的结合受到溶剂的影响。酶在水溶液中，酶与底物的结合主要是疏 水作用，而在有机溶剂中，底物与酶之间的疏水作用已不再重要。酶能够利用它 与底物结合的自由能来加速反应，总的结合能的变化是酶与底物之间的结合能与 水分子之间的结合能的差值。 有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由介质的亲( 疏) 水性的变化而发生变 化。许多实验表明，疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差，因此某些蛋白水 解酶在有机溶剂中可以合成d 一氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择l 一氨基酸。 某些学者认为有机溶剂中酶的立体选择性降低的原因是由于底物的两种对映体 把水分子从酶分子的疏水结合位点置换出来的能力不同。反应介质的疏水性增大 时，l 型底物置换水的过程在热力学上变的不利，使其反应性降低很多；而d 型 异构体以不同的方式与酶活性中心结合，这种结合方式只置换出少量的水分子， 当介质的疏水性增加时，其反应活性降低的不多。因此总的结果是酶的立体选择 性随介质疏水性增加而降低。 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，即酶能够选择性地催化底物中某个 区域的基团发生反应。选择合适的酶，能够实现糖类、二元醇和类固醇的选择性 酰化，制备具有特殊生理活性的糖脂和类固醇酯。 第一章文献综述 1 1 3 影响非水介质中酶催化活性的因素 1 1 3 1 水对有机相酶反应的重要性 1 水分子在酶表面和有机相主体之间的交换 早在发现了酶在有机溶剂中有活性后，人们就注意到了酶在强疏水性的溶 剂，如烷烃中，比在亲水性的溶剂，如乙醇中的活性高。随即人们就得出了一个 假设，认为水分子分配在酶表面上和有机溶剂主体中，干的有机溶剂能“夺取” 酶表面上的水分子，而亲水溶剂夺取水的能力比疏水性溶剂强。这种观点解释了 问什么亲水性溶剂比疏水性溶剂更容易使酶失活。氘失踪法证明了这个假设的正 确性【切。 在有机溶剂中胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的每个蛋白分子只需要有几 百个水分子就可以用于催化反应，远低于在酶表面形成单层水膜需要的水量。胰 凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶在各种干溶剂中的催化活力差别很大，一部分原因 是有机溶剂从酶上夺取必需水的能力不同，另一部分原因是有机溶剂直接影响了 酶促反应过程。 2 水活度 当水加入到非水酶催化的反应体系中时，反应系统的含水量分布在酶、溶剂、 固定化载体及杂质中【l 引。为了排除溶剂对最适含水量的影响，h a i l i n g 建议用反 应系统的热力学水活度( t h e r m o d y n a m i ca c t i v i t yo f w a t e r , a w ) 描述有机介质中酶 催化活力与水的关系i l9 j 。水活度( a w ) 定义为系统中水的逸度与纯水逸度之比。 水的逸度在理想条件下用水的蒸气压代替，因此可以用体系中的水的蒸气压 与同样条件下纯水蒸气压之比表示。h a i l i n g 2 0 】提出水活度是确定酶结合水的多少 的一个参数。在较低的情况下，有机溶剂中键合到酶上的水量与在空气中键 合到酶上的水量非常相似。表明有机溶剂没有直接影响水与酶紧密的键合。 较高时，极性溶剂( 如乙醇) 使酶结合的水量有所减少，非极性溶剂也有同样的 效果。这可能由于溶剂与键合位点的水直接竞争的结果，也证明了蛋白质溶剂 界面水与溶剂存在直接作用。h a i l i n g 同时建议在不同溶剂中研究酶动力学时为 避免水的影响，最好保持一个恒定的水活度，以便确保有一个相似的水合水平。 h a i l i n g 的研究还表明，在极性溶剂中，通常难以得到水活度与酶活性的关系。 可能是由于溶剂对水的影响大于酶对水的结合作用。 3 水的“润滑”作用 g u p t a 2 1 认为，在无水条件下酶分子的带电基团和极性基团之间相互作用形 成一种非活性封闭结构，水的加入可削弱这种相互作用。由水的高介电屏蔽离子 化基团之间的静电作用，并且中和了折叠多肽链中的肽单元和极性侧链基团之间 天津大学硕士学位论文离子液体中纤维素酶活性的研究 的偶极偶极相互作用使非活性封闭结构“疏松”，即水充当酶结构的“润滑剂”， 使酶分子的柔性增大，并通过非共价作用力来维持酶的催化活性构象。从结构的 角度来看，水作为润滑剂也可以解释为由于它具有与蛋白质分子功能团之间形成 氢键的能力。 4 最佳水含量 并不是体系中水含量越多越好，过多的水分会使蛋白构象更松散，降低酶的 活性【矧。另外也有人认为太多的水会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶的 活性部位，引起传质阻力【2 们。其次，过量的水可以在酶分子周围形成水簇，或使 粉末状酶形成胶状物，导致酶活力的下刚2 3 】。水分对不同形式酶的影响也不同， 对于一些固定化酶来说，过多水分子在载体上的吸附有可能导致底物的传质限制 【驯；对于交联晶体酶来说，水活度增加后活性增加很多，这可能由于酶分子间不 容易形成“水桥”而不会产生传质阻力。同时在有水生成的可逆反应，如酯化、 酯交换中，水分的存在也对反应的热力学平衡不利。还值得注意的是由于水和大 部分酶的失活作用有关，尤其是酶的“热失活”。温度升高时酶分子发生可逆折 叠，然后进行以下的一种或几种反应：形成不规则的结构、通过消除反应使二硫 键破坏、天冬氨酸和谷氨酰胺残基的脱酰胺以及天冬氨酸残基的肽键水解【2 5 1 。 1 1 3 2 有机溶剂的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响是非水酶学研究的重要内容。有机溶剂作为酶 的反应介质，不但直接与酶发生作用，还通过底物、体系中的水分和产物共同影 响酶的活性【2 6 1 。溶剂不但对酶的活性有直接或间接的影响，同时对于酶的特异性， 如前文提到的底物特异性、立体选择性、前手性选择性等也有重要影响 2 7 - 2 9 】。 1 有机溶剂影响生物催化活性的途径 通常有机溶剂影响酶催化的途径主要有：( 1 ) 有机溶剂与酶分子直接发生作 用，通过干扰酶分子的氢键和疏水键等来改变酶的构象，从而导致酶的活性受抑 制或酶失活：( 2 ) 有机溶剂还可直接和酶分子周围的水相互作用，通过影响水在 有机溶剂和催化剂中分配，如有机溶剂会夺去酶分子表面的必需水分，导致酶活 性下降来影响酶的催化活力【3 0 】；( 3 ) 有机溶剂还和能扩散的底物或产物，对酶催 化反应的动力学参数产生影响 3 1 - 3 3 ；( 4 ) 有机溶剂与反应体系其他成分之间形成 的相界面也会对酶的催化活力产生影响【蚓：( 5 ) 由于酶一般不溶于有机溶剂，而 造成底物传质困难。( 6 ) 有机溶剂改变底物的去溶剂化能或影响过渡态中间物的 稳定性i 巧j 。 2 1 9 尸的概念 l gp 是溶剂疏水性能的参数，定义为水辛醇相的分配系数的对数。l a a n e 等 在早期就研究了需养和厌氧整细胞生物催化剂的催化活性与溶剂性质的关系。 第章文献综述 1 9 8 5 年他们发现整细胞生物催化剂的催化活性与l g 尸有密切的关系【3 6 】。1 9 8 7 年， 他们提出酶活力与l g 尸相之间存在以下相关性：在l g 尸 4 的疏水溶剂中，酶有较高的活性【3 7 | 。 1 1 3 3 酸碱度( p h 记忆和p h 忘记) k i i b a n o v 教授等人发现i l 引，酶对它所曾存在的最后个水溶液环境的酸碱 度有记忆能力( 称为p h 记忆) 。也就是酶在非水相中催化作用的最适p h 值， 取决于它最后一次所处水环境的p h 值。而b l a c k w o o d l 3 8 】在研究有机溶剂中酶 的解离状态时发现，在微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们相应的盐所组成的 混合物，可以作为有机相缓冲液，使酶完全忘记干燥前它所处水溶液的p h 值， 即干燥前的缓冲液的p h 值对微水相有机溶剂中的酶活力不再产生影响( 称为 p h 忘记) 。充分利用酶在有机溶剂的这两个酸碱度特性，可以控制反应的p h 值 环境，使反应向有利的方向进行。 1 2 离子液体在生物催化反应中的应用 有机溶剂中的酶学研究在过去的二十年中有了长足的进步，但传统有机溶剂 的挥发性、易燃易爆、毒性、操作性差等缺点也是其在研究和应用中的制约因素。 作为一种新型反应介质，离子液体被誉为2 1 世纪清洁绿色工业中最理想的反应 介质之一。其可忽略的蒸气压，良好的热稳定性，可设计性等优势正可以弥补传 统溶剂的不足。近年来，离子液体以其独特的优势成为生物催化反应研究的热点， 尤其是作为生物催化反应的溶剂和共溶剂更是备受关注。2 0 0 0 年，c u l l 纠3 9 】第 一次报道了在离子液体中的酶催化反应。他们研究了在1 丁基3 甲基咪唑六氟 磷酸盐中的两相1 ，3 二氰基苯的水解反应，使用了r h o d o c o c c u s3 1 2 作为催化剂。 近十年的研究表明，酶在适当的离子液体体系中，有更高的催化活性【4 0 1 、立体选 择性【4 1 】和位置选择性。 1 2 1 离子液体的组成与性质 1 2 1 1 离子液体的组成 简单来说，离子液体( i o n i cl i q u i d s ) 是指室温或接近室温下呈液体状态的盐 类，又称为室温离子液体( r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ) 、室温熔融盐( r o o m t e m p e r a t u r em o l t e ns a l t s ) 、有机离子液体。早在1 9 1 4 年就发现了第一个离子液体 硝基乙胺，但其后此领域的研究进展缓慢，直到1 9 9 2 年，w i k e s 领导的研 究小组合成了低熔点、抗水解、稳定性强的卜乙基3 甲基咪唑四氟硼酸盐离子 天津大学硕士学位论文离子液体中纤维素酶活性的研究 液体( c 2 m i m b f 4 ) 后，离子液体的研究才得以迅速发展，随后开发出了一系列的 离子液体体系。 离子液体的种类繁多，改变阳离子和阴离子的不同组合，可以设计得到众多 不同的离子液体。如果以阳离子的不同对离子液体进行分类，最为常见的一般有 以下四种类型【4 2 】：季胺盐类( t - r 恨x m 。】) 、季磷盐类( p r x m x 】) 、咪唑盐类 ( 【r 1 r 2 i m 】) 和吡啶盐类( 【r p y 】) 。以阴离子的不同对离子液体进行分类，大致 可以分为以下两种类型1 4 3 j ：一类是“阳离子卤化盐+ a l c l 3 ”型的离子液体，如 【c 4 m i m a i c l 4 ，该体系的酸碱性随着摩尔分数的不同而改变。此类离子液体具有 离子液体的许多优点，但对水和空气都相当敏感；另一类可称为“新型”离子液 体，体系中与阳离子匹配的阴离子有多种选择，如：b f 4 。、p f 6 。、s b f 6 、a s f 6 、 t f o 。( c f 3 s o ：) 、t f 2 n ( ( c f 3 s 0 2 ) 2 n ) 。、c h 3 c o o 。、c i 。、b r 、i 。、n 0 3 。等，这类离 子液体与a i c l 3 类不同，具有固定的组成，对水和空气是相对稳定的。 1 2 1 1 离子液体的性质 作为一种新型的有机溶剂，离子液体有其独特的性质： 1 液态温度范围 熔点是作为离子液体的关键判据性质之一。离子液体要求熔点低，在接近室 温的范围内为液体。一般熔点随着阳离子对称性程度的提高而相应增大，随着阴 离子尺寸的增加而相应下降。一般来说，低熔点离子液体的阳离子具备下述特征： 低对称性、弱的分子间作用力和阳离子电荷的均匀分布j 。 由于离子液体的蒸气压极低，所以离子液体的液态上限温度主要取决于其分 解温度，而通常隋况下离子液体具有很高的热稳定性，大多分解温度都超过3 0 0 ，所以室温离子液体呈液态的温度区间大都在3 0 0 以上。特别是含 c 4 m i m 】 阳离子的室温离子液体女l ：l c 4 m i m b f 4 ，其液态温度区间超过4 4 0 。c 4 5 1 。这么宽的 液态温度范围为离子液体在工业领域的广泛应用提供了方便，是常规有机溶剂所 无法比拟的。 2 溶解性 室温离子液体能选择性地溶解许多无机物包括气体、有机金属化合物、高分 子材料、蛋白质和酶等，是很多物质的很好的溶剂。而且可以通过选择组成室温 离子液体的阴阳离子的种类和改变阳离子上官能团的类型，进而改变离子液体同 其它溶剂的互溶能力以及对特定物质的选择溶解能力。阳离子对离子液体溶解性 的影响可由正辛烯在含相同甲苯磺酸根阴离子季铵盐离子液体中的溶解性看出， 随着离子液体的季铵阳离子侧链变大，即非极性特征增加，正辛烯的溶解性随之 变大。大多数离子液体的介电常数超过一特征极限值时，其与有机溶剂是完全混 溶的i 训。 第一章文献综述 3 热稳定性 多数室温离子液体具有很好的热稳定性和化学稳定性。离子液体的热稳定性 分别受杂原子碳原子之间作用力和杂原子氢键之间作用力的限制，因此与组成 的阳离子和阴离子的结构和性质密切相关。例如在氧化铝上测定的多种咪唑盐离 子液体的起始热分解温度大多在4 0 0 c 左右，同时也与阴阳离子的组成有很大关 系。当阴离子相同时，咪唑盐阳离子2 位上被烷基取代时，离子液体的起始热分 解温度明显提高；而3 位氮上的取代基为线型烷基时较稳定。相应的阴离子部分 稳定性顺序为：p f 6 b e t i i m b f 4 m e a s f 6 r 、b r 、c i 。m 。同时，离子液体 的水含量也对其热稳定性略有影响。 4 密度 离子液体的密度与阴阳离子的组成相关。随着有机阳离子变大，离子液体的 密度变小。阴离子对密度的影响更明显，通常是阴离子越大，离子液体的密度也 越大。因此设计不同密度的离子液体首先选择相应的阴离子来确定大致范围， 然后选择阳离子对密度进行微调。 5 酸碱性 离子液体的酸碱性实际上由阴离子的本质决定。将l e w i s 酸如a i c l 3 加入到 离子液体 c 4 m i m c l 中，当a i c l 3 的摩尔分数x 0 5 时，随着a i c l 3 的增加会有a 1 2 c 1 7 。 和a 1 3 c l l o - 等阴离子存在，离子液体表现为强酸性。 6 粘度 室温离子液体的粘度比一般有机溶剂的高1 2 个数量级，在常温下是水的 几十倍甚至几百倍，可用作高效液相色谱的固定相。离子液体的粘度由其中的氢 键和范德华力的相互作用决定。阳离子含有较长烷基链时，化合物具有更大的粘 滞性1 4 圳。 7 导电性，电位窗 离子液体的离子导电性是其电化学应用的基础。离子液体的室温离子电导率 一般在1 0 。3 s - c m 。左右，可用作许多物质的电解液，实现室温条件下的电解。影 响室温离子液体化合物导电性的因素主要有粘度、密度、离子大小、离解度掣4 引。 电化学稳定电位窗口就是离子液体开始发生氧化反应的电位和开始发生还 原反应的电位的差值。大部分离子液体的电化学稳定电位窗为4 v 左右，这与一 般有机溶剂相比是比较宽的，故可用作燃料电池、太阳电池、电容器等的电解质。 综上所述，离子液体与常规的分子溶剂相比有很多优点，如宽的液态范围、 可以忽略的蒸汽压、高的粘度、不易燃、宽的电位窗、好的导电性，强极性，低 配位能力以及溶解各种有机无机材料的能力等。更重要的是离子液体的性质具有 天津大学硕士学位论文离子液体中纤维素酶活性的研究 可设计性，可以根据一般规律设计合适的阴、阳离子组成离子液体，得到希望的 性质。这些性质使得室温离子液体在电化学、有机合成，催化反应等领域中有着 广泛的应用潜力。 1 2 2 离子液体的应用领域 1 2 2 1 离子液体在分离中的应用 离子液体有良好的溶解性，并且不挥发，热稳定性高，不易燃易爆，操作条 件好，这样的特点使得人们非常关注其在分离中的应用前景。 英国科学家已找到将核废料溶解于离子液体中的方法，在离子液体中加入氧 化剂，可以使铀由扩十转变为护+ ，使钚由p u 4 + 转变为p u 6 + 而溶解。他们认为用 离子液体取代传统的溶剂如水、煤油和磷酸三丁酯的混合溶剂有可能改善现有的 核燃料加工系统。 r o b i nd r o g e r s 教授领导的研究小组【4 9 】使用了【c n m i r n p f 6 ( c n 指烷基取代 基) 作为离子液体和水形成两相，结果表明绝大多数的金属离子萃取分配系数仅 仅为0 0 5 。如果在溶液中加入10 4 m o lp a n ( i - ( 2 - p y r i d y l a z o ) - 2 - n a p t h 0 1 ) 或 t a n ( i ( 2 - t h i a z o l y l ) 一2 - n a p t h 0 1 ) ，则当p h 值在1 2 以上时，使用p a n 萃取f e 3 + 、 c 0 2 + 、c d 2 + 和n i 2 + 及使用t a n 萃取f e 3 + 、c 0 2 + ，分配系数均可以达到l 以上。 1 2 2 2 离子液体在电化学方面的应用 离子液体的导电性、宽电化学窗口，高热稳定性和化学稳定性使得其在电化 学中的应用十分有前景。 电化学电容器作为高功率和高循环寿命电能储存装置受到广泛的关注。其中 含非水电解液的电化学电容器具有更大的电化学稳定性，能提供更大的能量储 存。将离子液体与有机溶剂碳酸酯共溶优化的电解液导电性高( 2 0 m s c m 。1 ) ， 电化学窗口宽( 3 5 v ) 、盐浓度高( l m o l - c m “) 、双层电容量大( 1 2 0 f g - 1 ，活 性碳电极) ，非常适合做电化学电容器