（食品科学专业论文）植物酯酶的纯化及其快速检测农药残留的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：编霞 导师签名：主l 乒 时间：耐年f 月d 同 时间：力鲫年月肋日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 翁霞时间：印厂年月口r 翩虢i 伶江 啪，：枷月0 n 沈阳农业大学硕士论文 摘要 本论文以辽春9 号小麦面粉为植物酯酶( p l a n t e s t e r 鹊e ，p e ) 的提取原料，利用植物 酯酶活性可被有机磷农药所抑制的毒理机制，提取纯化一种灵敏度及纯度高的植物酯 酶。植物酯酶可水解醋酸蔡酯为萘酚和醋酸。萘酚与固蓝b 盐反应生成紫红色偶氮化合 物，从而完成显色反应。当样品中含有机磷农药时，植物酯酶的活性就被抑制，就不能 完成显色反应。 植物酯酶粗酶液提取方法的具体步骤为：称取l g 小麦面粉，加入5 m l p h 值6 5 的 磷酸缓冲溶液，在3 0 恒温水浴摇床上振荡提取4 0 m i n ，然后用高速冷冻离心机在4 下离心5 m i n ( 1 0 ，0 0 0 r p m ) ，所得上清液即为植物酯酶粗酶液。将所得粗酶液保存在4 冰箱( 或将酶液分装后在真空冷冻干燥机上干成酶干粉冰冻保存) 。通过实验得：粗酶的 晟适反应温度为4 0 ，最适反应p h 为6 5 ，1 0 粗酶最适反应时间为1 0 m i n 。 双水相法萃取植物酯酶的最适条件是：1 0 9 的双水相体系中含有1 3 的硫酸铵，2 7 的聚乙二醇l o o o ，l m l 的植物酯酶粗酶液，l m l p h 值为7 5 的磷酸缓冲溶液和双重蒸 馏水。在此条件下提取的植物酯酶分配系数k 。达到1 0 2 4 6 2 ，总蛋白的分配系数k 。为 2 3 1 6 0 ，酶活回收率q 为9 4 8 ，萃取效果最佳。 粗酶液经过d e a e 纤维素5 2 、s e p h a d e xg 一2 0 0 柱层析，第一组分纯化了4 9 7 7 1 倍， 活力回收2 0 0 9 ；第二组分纯化了1 5 2 7 6 倍，活力回收8 5 5 。通过实验确定了植物 酯酶的纯化条件；以双重蒸馏水平衡d e a e + 纤维素柱2 5 h ，上样后，分别以双重蒸馏 水、o i m o l l 、0 2 m o l l 、o 3 m o l l 、0 4 m o l l 、o 5 m o l 的n a c l 进行梯度洗脱，通过酯 酶的显色反应可知双重蒸馏水及0 2 m o l l n a c l 洗脱得两组分为所需酶液；以o2 m o l l 的n a c l 为平衡液将s e p h a d e xg 2 0 0 柱平衡2 5 h ，将经d e a e 5 2 柱层析所得两组分分 别上样后，以0 2 m o l l 的n a c l 溶液进行洗脱分别得三个组分，其中所得第一组分均为 所需组分。 比较了双水相萃取植物酯酶和柱层析纯化植物酯酶的纯化倍数，其中双水相萃耿法 酶的纯化倍数是7 6 7 7 2 倍左右，柱层析纯化植物酯酶的纯化倍数是4 9 7 7 1 倍左右。 糯酶液、双水相萃取酶液、经d e a e 一5 2 所得两组分及s e p l l a d e xo 2 0 0 所得的i 个 组分经聚丙烯酰铵电泳看其纯度。最终确定所提取植物酯酶的分子量在2 9 k d 左右。 植物酯酶的检测系统的最适条件是：底物乙酸一i 一萘酯o 1 m l ，显色剂阎蕊b 盐 o 9 m l ，酶液1 o m l ，p h 值6 5 的磷酸缓冲溶液1 0 m l ，双重蒸馏水1 0 m l ，反应温度 是4 0 ，反应时间是l o m i n 。 采用丙酮做溶剂分别将五种有机磷农药配制成w = 1 的农药标准溶液，然后采用梯 度稀释法在双重蒸馏水中分别配制1 0 “、1 0 。、1 0 一、1 0 1 、1 0 o 、l o “。( v v ) 的系列 浓度的标准溶液，利用提取出来不同纯化程度的酶液分别进行检测试验，待反应完成后 用1 0 抑制率，分别确定出各种酶液的最低农药浓度，结果如下：粗酶及1 0 粗酶的检 出限均为1 0 1 ( v v ) ，但后者的抑制率要比前者高，其中1 0 的粗酶液检测敌敌畏的灵 敏度最高；利用双水相萃取所得酶液检测敌敌畏的检出限为1 0 1 ( v v ) ：利用硫酸铵沉淀 法再经透析所得酶液检测敌敌畏的检出限为l o 。( v v ) ；利用d e a e 5 2 纤维素分离所得 i 组分酶液检测敌敌畏的检出限为l o 8 ( v v ) 。 关键词：植物酯酶，纯化，快速检测，农药残留 沈阳农业大学硕士论文 _ _ _ _ _ _ - _ _ - - h _ 一一。一 a b s t r a c t l i a o c h u n9w h e a tn o u rw a sc h o s e na sm er e s o u r c eo fp l a n te s t c r a s e i nt h e p a p e l a c o r d i n gt ot h cn l e c h a l l i s mo fp e s t i c i d e si n h i b i t i o no fp l a n te s t e r a s e ，t h eh i 曲s e n s i t i v i t y p l a n te s t e r a s ew a se x t r a c t e da n dp u r m e d p l a r i t e s t e f a s ec a nh y d r o l y z e l n a p 吐y la c e t a t ei n t o n a p h t h o la n da c e t i ca c i d ac o l o rr e a c t i o nc a nt a k ep l a c eb e t w e c nl - n a p h m o la i l df a s tb l u eb a n dm a g e n t aw i l lb es e e n w h e nt h ep l a n t e s t e m s ew a si r i h i b i t e db yp e s t i c i d e s ，t h ec o l o r r e a c t i o nc a n th a p p e n p l a n t - e s t e r a s ec a i lb ee x t r a c t e d 舳mw h e a tf l o 嵋t a k e5 m lp h 6 5p h o s p h a t eb u 腩ri n t o 1 9w h e a tn o u r 觚ds h a k e4 0 m i no n am e c h a m c a ls h a k e ra 1 1 dm e nc e t r i 如g e5 m i na t 1 0 0 0 0 r p m t h eu p p e rl i q u i dl a y e r 、sf i l t r a t e da n dc o n s e r v e di na4 r e 抒i g e r a t o r w h i c hw a s t h en e e d e de r l z y m e t h ee x p e r i m e mr c s u l t ss h o wt h 砒t h es u i t a b l er e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f c m d ee n z y m ei s4 0 ，t h es u i t 曲l er a n g eo f p hi s6 5 ，t h es u i t a b l er e a c t i o nt i m eo fl o c r u d e e s t e r a s ei s1 0 m i n ， a q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o ni san e wb i o s e p a r a t i o nt e c h n i q u ed e v e l o p e di nr e c e m y e a r s ，i tw a su s e dt op u 的rp l a n t e s t e r a s ei nm i sp 印e r - i nt h ep e g ( n h 4 ) 2 s 0 4a q u e o u s t w o p h a s es y s t e m ，m ee f r e c t so ft h ep e g w i t l ld i 彘r e n tm o l e c u l a rm 髂s e s ，c o n c e n t r a t i o n so f p e g c o n c e m m t i o n so f ( n h 4 ) 2 s 0 4o nt 1 1 ed i 嘶b u t i o nf a c t o ro f p l a n t e s t e r a s ei nt 、v op h a s e ，t h e v o l u m er a t i oo ft h e 向pp h a s et ot h eb o t c o mp h a s ea n dt h er c c o v e r yo fp i a l l t - e s t e r a s ew e r e i n b e s t i g a t e d u n d e ft h es e l e c t e ds e p a r a t i o nc o n d i t i o n s ah i g hr e c o v e r yo fp l a n t e s t e r a s ew a s o b t a i n e df r o mt h em i x e df l u i d t h ee x p e r i m e n tr e s u i t ss h o wt h a tt h es u i t a b l ee x t r a c t i o n c o n d i t l o n sa r e2 7 p e g l o o o ，1 3 ( n 王4 ) 2 s 0 4 ，p h 7 5p h o s p h a t eb u f 蚤；r ，a n dt h ed i s t r i b u t i o n c o e 硒c i e n to fk = lo 2 4 6 2 ，a n dm ey i e l do fp l a n t - e s t e r s ec a nr e a c h9 4 8 a tr o o mt e m p e r a t u r e t h ec r u d ep l a n te s t e r a s ei sp u r i f i e db yd e a e 5 2 ，s e p h a d e xg 一2 0 0 ，t w oc o n s t i t u t e sa r e c o j i e c c e d ，f h ep u 打f i c a t j o nt i m e so f t h e 矗r s tj s4 9 7 7 1 ，t h ef c o v e f yi s2 0 0 9 ；h ep h r i 蘸c a t i o n t i m e so ft h es e c o n di sl ，5 2 7 6 ，t h er e c o v e r yi s8 5 5 t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt h e s u i t a b i ep u “f i c a t i o nc o n d i t i o n sa r ew i t hd u a l d i s t i l l e dw a t e rt ob a l a n c ed e a e 一5 2c e l l u l o s e c o l u m n i a t i o n2 5 h ，a f t e r a d d i n g2 m ls 踟p l e t ot h ec o u m nb e d r e s p e c t i v e l y w i t h d u a l d i s t i l l e dw a t e r ，o 1m o l ，l o 5 m o l ，ln l g r a d sw a s h e d ，t h r o u 曲 c o l o r r e a c t i o n ，t w o c o n s t i t u t e sa r et h en e e d e de n z y m ew h i c ha r ew a s h e dw i t hd u a l d - s t i j l e dw a t e ra n d 3 一 垒堕型 一一一 _，-。_-_。_。_。1。1。1。一一 o 2 m o l ，l n a c lr e s p e c t i v e l y w i mo 2 m o l ，l n a c lt ob a l a n c es e p h a d e xg 一2 0 0c 0 1 u m n i a t i o n 2 h ，a d d i n gt h em oc o n c e n t r a t e dc o n s t i t u t e st os e p h a d e xg - 2 0 0c 0 1 m nb e dr e s p e c t i v e l y w i t i l o 2 m o l l n a c lt ow a s hm ec o l u r n n ，g e m n gt h r e ec o n s t i t u t e s ，锄o n go f t _ e e ，t h ef i r s tc o n s t i t u t e i st h en e e d e de n z y m er e s p e c t i v e i y c o m p a r et h ep l a i l te s t e r a s ew h i c hi se x t r a c t e db ya q u e o u st w o p h a s es y s t e mw i t ht h e p l a n te s t e r a s ew h i c hi se x t r a c t e db yd e a e 一5 2 ，t 1 1 ep u r i f i c a t i o nt i m e so ft h ef r o n t e ri sh i g h e r t h a nt h a to f t h el a t t e t h ef o n t e ri s7 6 7 7 2 ，a n dt h ei a t t e ri s4 9 7 7 1 t h r o u g h 队g ee l e c 乜0 p h o r e s i se x p e r i m e n t ，c o m p a r ct h ep u r eo ft h ec r u d ee n z y m e ，t w o c o n s t i t u t e so fd e a e ，也eo n ec o n s t i t u t eo fs 印h a d e xg 2 0 0 ，t h ea v e r a g em o l e c u l a rm a s so fp - e i s2 9 k d t h ep l a l l t e s t e r a s ed e t e c t i n gs y s t e m ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o na r e ：s u b s t r a t e ( 1 一n a p h t h y l a c e t a t e ) 0 1m l ，c o l o rr e n d e r i f 培sd o s e ( f a s tb l u ebs a l t ) o 9 m l ，e n z y m el i q u i d lm l ，p h 6 5 p h o s p h a t eb u 丘打l m l ，d u a l d i s t i l l e dw a t e rl m l ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 ，i r l l l i b i t i n gt i m e 1 0 m i n f o r t i f y d i s t i i l e dw a t e rw i t h a p p r p o p r i a t ea m o u n to fp e s t i c i d e si n t 0 1 0 6 p p b ，1 0 7 p p b ， 1 0 8 p p b ，1 0 9 p p b ，1 0 1 0 p p b ，1 0 1 p p bf o r t i a t i o ns o l u t i o na n dt h er e 铋l tw a st e c o r d e d w i t ht h e c n l d ee f l z y m e ，1 0 c n 】d ee n z y m e ，幽ep l a n te s 锄铀ew h i c hi se x t r a c t e db ya q u e o u st w o - p h a s e s y s t e m ，t h ep l a l l t e s t e r a s ew h i c hi se x 仃钮c t e db yd e a e - 5 2t od e t e c to 唱a n o p h o s p h o n i s p e s t i c i d e s t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h es e l l s i t i v el i m i to fc r u c ee n z y m ea n dl0 c r u d e e n z y m ea r ea l l 1o - 6 ( v ) ，b u tt h el a t t c ro fs e n s i t i v el i m i ti ss e f l s t i v c rt h 虮t h a to ft h ef r o n t e r ， t h ei n h i b i tm t i oo fd e t e c t i o nd i c h l o r v o si sh i g h e r t h es e n s i t i v ei i m i to fd e t e c t i o nd l c h i o r v o s w i t ht h ep l a n te s t e r a s ew h i c hi se x t r a c t e db ya q u e o u st w o p h a s es y s t e mi s l o 一9 ( v v ) ，t h e s e n s i t i v en m i to fd e t e c t i o nd i c h i o r v o sw i t ht h ep l a n te s t e r a s ew h i c hi sd i a l y s e di s1o - 7 ( v ，v ) ， t h es e n s i t i v el i m i to fd e t e c t i o nd i c h l o r v o sw i t ht h ep l a n te s t e m s ew h i c hj se x t m c t e db y d e a e 一5 2i s1o 。8 ( v v ) 。 k e yw o r d s ：p l a n t e s t e r a s e ， p u r i f i c a t i o n ， r a p i dd e t c t i o n ， p e s t i c i d er e s i d u e s 4 沈阳农业夫学硕士论文 _ _ _ - _ _ _ 一 第一章前言 11 酶法快速检测有机磷农药的研究目的和意义 农药残留指农药使用后残存与生物体、农副产品和环境中的痕量农药原体、有毒代 谢物、降解物和杂志的总称：残存的数量称残留量 以每千克样本中有多少毫克( 或微 克、纳克等) 表示。农药残留是施药后的必然现象，但如果超过晟大残留量对人畜产生 不良影响或通过食物链对生态系中的生物造成毒害，则称为农药残留毒性( 简称残毒) 据农业部环境监测总站等单位公布资料，对甲胺磷灵敏度为6 8 5 m g k g ，对硫磷、乐果、 毒死蜱等检测浓度极限在1 0 m g k g 以上，还有不少有机磷、氨基甲酸醅农药无法检出。 现今随着社会发展和人们健康意识的增强，农药残留问题越来越引起人们的重视， 人们非常想了解自己购买的农产品是否农药残留超标，故市场上急需一种灵敏快速简便 的检测方法。目前严重污染食品的农药是有机磷杀虫剂，人长期摄入有机磷农药可表现 肝功能下降、血糖升高、白细胞吞噬功能减退等一系列病理变化，并有致畸、致癌、致 突变作用。中毒后表现为血液中胆碱酯酶活性受到抑制丧失分解乙酰胆碱的能力，从而 引起一系列的中毒症状，严重者可导致中枢神经系统功能异常。由此可见，农药残留对人 体健康危害极大，故农药残留的快速和高效的检测方法，对保证食品安全和加强食品中 农药残茸量监督管理具有重要意义。； 12 酶法- 陕速检测有机磷农药的国内外研究进展 自从1 9 5 1 年发现有机磷农药在体外也能抑制胆碱酯酶咀来，绝大多数研究报告都是 基于动物胆碱酯酶这一原理的。进步的研究发现有机磷水解酶( o 唱a r ip h o s p h o m s h y d r 0 1 y s e s 简称o p h ) 能有效地水解有机磷农药，可以监测水解产物来测定有机磷农药 的含量。但无论足动物酯酶，还是有机磷水解酶都不太适合现场快速检测使用。因为动 物酶原不仅取材小便，而且必须冰冻保存而有机磷水解酶则价格昂贵。近年来，有大 量关于快速检测农药残留方法的报道，其中大部分方法是以酶作为生物识别兀件制成生 物传感器来检测的。聚用的酶主要有3 种：a 胆碱酯酶( c h o i m e s t e r a s e ) ，这是使用最多 的一种酶v i l l a t t ef r a n c o i s 和i v a n o van 等人曾先后使用不同来源的胆碱酯酶作为生物 传感器的识别元件，对多种有机磷农药进行了检测比较，发现酶对农药的敏感性在检测 过程中很重要。b 有机磷水解酶( o r g 肌0 p h o s p h a t e ) ，它能催化多种有机磷农药水觯， 利用酶的专一性，可以对有机磷农药进行检测。c 植物酯酶( p h y t o e s t e r a s e ) ，韩承辉等 利用酶的专性，可以对有机磷农药进行检测。c 植物酯酶( p h y t o e s t e r a s e ) ，韩承辉等 前言 人利用面粉中提取的粗酶液制成酶片对常用的几种有机磷农药进行了检测，发现有机磷 农药检测艰为o 。0 4 1 0 0 m g l ，这与前两种酶的相关报道中的检测限相似，其检测机理 与胆碱酯酶类似。 1 21 胆碱酯酶法的研究进展 1 2 ， ，1 动物胆碱酯酶法国内识究进展 1 9 6 4 年，李发生、朱曜分别报道了胆碱酯酶片检测食品和出口牛肉中的有机磷农药， 灵敏度为0 卜3 o p p m ，也报道了和用酶传感器检测五种有机磷农药，最低检出浓度为 l l o “确。1 9 7 4 年，台湾省农业试验所郑允媾士利用敏感家蝇a c h 建立了酶速测法，用 于测定果蔬中的有机磷和氨基甲酸酯农药残留。但我国大陆尚未有从敏感家蝇头部提取 a c h e 的报道。郭敦成( 1 9 8 7 ) 、余孝颖( 1 9 9 6 ) 、张雪燕( 1 9 9 6 ) 等进一步研究发现，家蝇头 部a e h e ( a c e t y l e h o l i n e s f e r a s e ，a c h e ) 对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感度要优于其他 来源的胆碱酯酶。1 9 9 1 年，李治祥利用含有酶片、显色基质片、化学器皿和试剂的农药 残毒速测箱检测了8 种以上的有机磷和氨基甲酸酯类农药，对水、蔬菜与水果中农药的检 测灵敏度分别为o 卜3 0 m g k g 和2 5 一l o 5 m g k g 范围内，每样需要1 5 2 0 l l i i n ，成本o 。5 元， 适用于田间筛选大量样品。而且所用的酶片和显色基质片在常温、干燥条件下能保存2 年以上。王恒亮、皮国新等( 1 9 9 7 ) 从敏感家蝇头部提取乙酰胆碱酯酶，求出了a c h e 抑 制率与抑制剂浓度的对数关系式，抑制中浓度为2 4 6 9 5 4 鸭k g ，抑制活性l o 的e - 6 0 5 浓度 为i o 1 3 5 l m g k g ，其相关系数o 9 9 8 1 3 。根据此可计算出农药残留的相当量。1 9 9 8 年张莹、 何丽英等用新鲜鲤鱼脑制成固化a c l e 片，并用于水体中有机磷残留的检测。陈胜等 ( 2 0 0 0 ) 报道了胆碱醅酶速测卡检测水中甲胺磷的最低浓度为1 0 m g k g ，敌百虫为 3 ，o 巾g k g ，水胺硫磷为5 o m g k g ，呋哺丹为0 1 m g k g ：检测菜样中的甲胺磷的最低浓度为 1 2 8 18 4 m g k g ，敌百虫为o 2 l m g k g ，水胺硫磷为o 4 8 m g k g ，呋哺月为1 0 8 m g k g 。黄 文风等( 2 0 0 0 ) 报道，用敏感家蝇头部分离纯化制成的粉状酶制剂的效果明显要好于直接 用磷酸缓冲液( p h 8 o ) 提取的酶液的效果。赵建庄( 2 0 0 1 ) 等利用薄层层析酶抑制法( 以 猪肝和敏感家蝇头部为酶原提取乙酰胆碱酯酶) ，检查蔬菜、水果、粮食中农药残留的方 法。此法对乙酰胆碱酯酶的抑制是特异的，它适用于在不具备精密仪器设备的小型实验站 内检测农药残留量，对大多数有机磷和氨基甲酸酯类农药来说，其检测限在05 i o u g m l 范围，它为在现场测定农药残留提供一种廉价和快速的方法，层析一酶抑制法的灵敏度 可达到2 u g 。陆贻通( 2 0 0 1 ) 、钟树明( 2 0 0 2 ) 先后用敏感家蝇头部的a c h e 提取液对蔬 沈阳农业大学硕士论文 菜中的农药残留量进行了测定。2 0 0 2 年山东京蓬生物药业股份有限公司研制出新型快速 农药残留检测剂一乙酰胆碱酯酶检测结果的假阳性率明显低于其他酶系，敏感度达 0 o 卜5 f 【g k g ，准确率达9 0 ，田间使用的试剂盒，敏感度达0 卜5 m g k g ，准确率达8 5 ， 高于国内外采用动物血清作酶源的敏感度只能达卜5 m g k g ，准确率达8 0 。王多加( 2 0 0 3 ) 等，利用胆碱酯酶速测卡检测呈阳性的蔬菜样本，通常农药残留在1 m g k g 以上，超过国 家标准时有机磷和氨基甲酸酯类农药残留规定的上限。侯学文( 2 0 0 3 ) 利用胆碱酯酶水解 碘化硫代丁酰胆碱后形成的硫代胆碱，与二硫双对硝基苯甲酸发生化学反应生成黄色产 物，在4 1 2 n m 比色测定。利用此法测定酶、底物的添加量以及保温温度和保温时间对酶活 力的影响，还研究了不同浓度与保温时间的辛硫磷对胆碱酯酶活力的抑制情况获得了 胆碱酯酶优化的反应条件，结果还表明胆碱酯酶对辛硫磷比较敏感，其抑制中浓度为 i 。3 9 0 4 9 u g 几。李书谦( 2 0 0 4 ) 等，研制出胆碱酯酶速测卡，利用2 ，6 一二氯靛酚为底物， 检测时间为1 3 m i n ，农药残留检出限为o 卜1 0 m g k g ，其中甲胺磷农残含量大于1 o m g k g 的检出率为1 0 0 ，未出现假阳性现象。2 0 0 4 年杨东鹏确定了抑制时间为1 0 m i n 时的最适 抑制温度为4 7 ，p h 值为7 7 ，以及新的检测结果判断标准即酶抑制率为5 8 时，蔬菜中 含有某种有机磷和氨基甲酸酯类农药残留为阳性。 1 2 1 2 动物胆碱酯酶法国外研究进展 近年来，酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段，美国堪萨斯研究所( m i d w e s t r e s e a r c h i n s t i t u t e ，m r j ) 开发出一种称为农药检测器( d e t e c t o r ) 的“酶标签”( e n z y m e t i c h e t ) ，这种酶标签对乙酸胆碱酯酶( a c e t y c h o l i n e s t e r a s e ，a c i e ) 的抑制剂灵敏，可用于 测定水中有机磷和氨基甲酸酯农药，检测限在0 卜1 0 m g l ，其快速、简便，可以在h 1 间或其它没有仪器的地方使用；1 9 5 7 年，k r m n e r 与g a m s o n 发展了一种比色法，采用一种 与靛酚乙酸酯相似的化合物来测定1 1 0 u g 的各种有机磷酸酯化台物。与此同时，z w e i g 等人也测定了西内维因等农药的残留。1 9 6 1 年，e 1 l m a n 等提出了比色法测定胆碱酯酶的 方法。a o a c 早在1 9 6 4 年最早公布了酶抑制法检测有机磷农药，美翻1 9 5 8 年研制出称之为 酶片( e n z y m et i c k e t ) 的商品来检测有机磷农药，灵敏度为0 卜1 0 p p m 。s i g m a 公司也 有类似的检测试剂盒。1 9 6 8 年m e d o z a 等利用薄层一酶抑制技术测定1 0 种有机磷和氨基甲 酸酯农药，检测限为毫微克级。1 9 7 3 年m i c h e l 等曾用胆碱酯酶法测定水中浓度低达p p t 级的异丙氧基氟磷酸酯和m e s p 。1 9 8 5 年美国m r i ( m i d w e s tr e s e a r c hi n s t i t u t e ) 研制出 一种农药检测器( d e t e c t o r ) 的酶片( e n z y m et i c k e t ) ，可在阳问快速检测有机磷和氨基甲酸 前言 酯农药，其灵敏度在0 。卜1 0 m g k 范围，之后陆续报道有速测箱、速测仪、速测卡和速 测试剂等。f e m a d o 等人，用鳗鲡乙酰胆碱酯酶作为生物传感元件对有机磷和氨基甲酸酯 进行了检测，可检测到l o n m 水平的对氧磷( 对硫磷的氧化物) ，而敌敌畏和焦磷酸四乙 酯等农药的检测下限则高( 李颖娇等，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 植物酯酶法的研究进展 有机磷杀虫剂可以抑制植物中的某些酯酶，因而利用这些酯酶催化的显色反应强弱 可以检测农药残留。1 9 8 7 年，中国农业部环保所研制出一种酶片和一种发色基质片，不 需仪器，即可在田闻或菜市场快速( 1 5 2 0 m i n ) 测定蔬菜和水果中的有机磷或氨基甲酸酯 类农药，检测限为o 5 一1 0 m g k g 。用植物酯酶与农药在4 0 水浴中反应l o m i n ，再向反应 液中加入2 ，6 一二氯乙酰靛酚水浴l o m i n ，通过眼观反应前后体系的颜色变化或用分光光 度计测量吸光度值确定抑制率，即可知道样品中农药的含量。以抑制率为l o 作为方法 测定限的标准，9 种农药的测定限分别为：甲胺磷o 0 1 2 m g 妇、敌敌畏0 0 0 4 0 f 1 1 9 k g 、氧 化乐果0 。0 4 8 m g k g 、乐果o 1 7 i f l g k g 、甲基异硫磷o o o l 5 m g k g 、水胺硫磷o 1 5 r a g k g 、 辛硫磷o 1 0 i i l g k g 、敌百虫o 0 0 7 4 m g k g 、呋哺丹o 3 3 m g k g 。比较其实验结果得，该方 法与气相色谱法的测定结果十分接近，可满足于生产中快速测定的需要。李林、黄雁 ( 1 9 9 9 ) 等也报道了一种用于农药速测的酶片和显色基质片，灵敏度达o 卜l o 毫克升。 酶片法对常用农药检出限为o 3 1 0 m g 垤( 陈胜等，2 0 0 0 ) 。( 韩承辉，2 0 0 0 ) 等利用自己 研制的植物酶片和底物片检测有机磷农药残留的灵敏度为0 4 l o m g 几。肖建军等( 2 0 0 1 ) 研制出了一种以植物酯酶为酶源的检测器，利用光电比色法来识别溶液颜色，可以快速 检测出农产品和水中有机磷杀虫剂的残留。董超等( 2 0 0 1 ) 采用从面粉中提取的植物酯酶 对部分常用有机磷农药( 甲胺磷、敌敌畏、对硫磷、辛硫磷等) 进行测定，检出浓度在 l o - 1 0 。( v v ) ，其中植物酯酶对敌敌畏最为灵敏，对对硫磷的显色反应最差。汪世新 ( 2 0 0 1 ) 研制出灵敏度较高的化学检测液一速测灵，检测灵敏度为0 1 8 一l o m g k g ，检测 时间为5 1 0 m i n ，检测成本为o 2 一o 3 元人民币，而且陔技术己获国家发明专利。侯咧迪 ( 2 0 0 2 ) 采用植物酯酶测定有机磷农药d d v p 和甲基对硫磷，并采用酶促反应速率替代原 来的反应平衡时的吸光值来表示酶的活性，通过活化剂溴水溶液使甲基对硫磷对酶活性 的抑制提高5 0 1 0 0 倍，建立了d d v p 和甲基对硫磷的酶抑制方程，其最小检出浓度分别为 o 0 1 1 0 “和o j 6 6 1 0 “。赵建庄( 2 0 0 2 ) 用自制的农药速测仅对果蔬中农药残留毒性 进行快速检测，可以直接显示有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率，确 沈阳农业大学硕士论文 定农药残留毒性水平。黄保宏、黄志勇( 2 0 0 3 ) 通过实验比较了胆碱酯酶和植物酯酶快 速测定蔬菜中有机磷农残残留，通过正交实验优化了两种酶抑制法的测定条件。测定结 果表明：其检测限都在o o 卜o 6 m g k g 范围内，其加标回收率都达到8 5 以上，但植物酯 酶法测量精密度较好( 3 以下) 。刘海霞，韩承辉( 2 0 0 3 ) 在检测有机磷农药的酶分析法 中，通过两种不同显色剂( 2 ，6 一二氯靛酚乙酯和固兰b 盐) 的显色原理及性能对比实验， 证实了采用2 ，6 一二氯靛酚乙酯既兼顾了底物和显色剂的双重作用，又具有底物稳定性 好、灵敏、简便实用的特点，同时也体现出2 ，6 一二氯靛酚乙酯法的优越性。张爱琳( 2 0 0 3 ) 出马血清和辽春1 0 号植物提取纯化的胆碱酯酶制剂均可用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸 酯类农药残留的快速测定，检测限在o 1 一o ，5m g 虹之间。王继军等( 2 0 0 4 ) 用聚苯乙 烯微孔反应板作为植物酯酶的载体，检测了果蔬中的有机磷农药残留，其灵敏度在 o o 卜o 1 m g k g 范围，用此固定化酶检测水中的有机磷农药残留的灵敏度范围在 o o 卜0 1 u g m l 范围。而且国内外使用胆碱酯酶( 包括a c h e 或b u c h e ) 的酶液法，如各种 速测仪器( 中国) ，酶纸片法( 中国，美国) 检测灵敏度一般在0 卜1 0 o u g m l 。二者进行比 较不难看出，植物酯酶固定化的检测灵敏度有显著提高。赵厚明、徐慧( 2 0 0 5 ) 碱水解 法检测灵敏度为o 5 5 o m g k g ，检测时间为5 一1 0 m i n ，检测成本低于o ，l 元人民币。 1 3 本实验研究的方法和内容 1 3 1 本实验研究方法： 1 3 1 1 双水相法萃取纯化植物酯酶 1 3 ，1 1 1 双水相萃取技术分离植物酯酶的原理 双水相萃取技术分离植物酯酶的原理主要是根据被分离组分在双水相体系两个相 中的分配性能的差异，通过组分在两相中的一次或多次分配，实现组分的分离和提纯。 1 3 1 1 ，2 双水相萃取技术在酶及蛋白分离中的应用 双水相技术广泛应用于生物大分子物质的分离和纯化，如氨基酸、多肽、核酸、细 胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等，特别是成功的应用在蛋白质的大规模分离当中。某 些廉价的无机豁与聚合物构成的分离性能良好的双水相体系代替了昂贵的d e x t r a n 与 p e g 组成的双水相体系。如1 9 8 8 年h u s t e d te ta i 就描述了计算机控制的连续逆流萃取酶： 延胡索酸酶从b r e v m a t e r i u ma m m o n i a g e n e s 中被纯化2 2 倍，回收率达到7 5 ，其他酶，包 括青霉索酰化化酶和天冬氨酸酶，被处理具有较好的效果。如b o l a n d 等人利用p e ( ；1 5 5 0 磷酸盐系统从牛肝和猪肾中提取氧化物歧化酶( s 0 d ) 、过氧化氢酶( c a t a l a s e ) 进行 9 前言 了研究并成功用于工业生产。周晓云( 1 9 9 7 ) 利用双水相萃取体系萃取脂肪酶，室温下 提取率可达7 1 ，分配系数达1 7 ，提纯倍数为1 5 。李夏兰( 1 9 9 9 ) 等用双水相体系萃取糖 化酶，回收率达9 6 以上。邱树毅( 2 0 0 0 ) 研究了双水相萃取纯化a 一淀粉酶的各影响因素。 陈琪等( 2 0 0 4 ) 利用双水相体系萃取天冬氨酸转氨酶分配系数和纯化系数分别为2 3 6 和 2 9 4 。 1 ，3 1 2 离子交换层析法分离纯化植物酯酶概述 离子交换层析是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物发生 可逆的离子交换反应而进行的分离方法，这种层析方法一般应用于生物大分子的分离纯 化。但要考虑到离子交换剂的交换作用、介质的排斥和阻滞作用、交换_ 介质的载体及性 质，本实验中选用纤维索和葡聚糖凝胶，根据植物酯酶的性质选择适宜指标的纤维索和 葡聚糖凝胶。在分离纯化植物酯酶的过程中要考虑到被分离酯酶的等电点、缓冲液的p h 值、上样量、样液浓度、洗脱速度、洗脱方式等。 1 3 1 3 植物酯酶法检测有机磷农药的原理 植物酯酶可以催化乙酸萘酯水解为萘酚和乙酸，萘酚与呈色剂固蓝b 作用形成紫红 色的偶氮化合物，从而产生显色反应。有机磷农药能抑制植物酯酶的活性，当试样中有 有机磷农药存在时，植物酯酶受抑制，反应速率发生变化，以至于不显色。因此，当酶 含量不同时，紫红色偶氮化合物的产量不同，溶液颜色深浅不同，用底物分解后产物吸 光度值a 柬表示酶的活性，吸光度值越大，酶的活性越大。由于植物酯酶的成本大大低 于动物性的乙酰胆碱酯酶，无需低温保存，保质期也较长。因此植物酯酶抑制法测定农 药残留是一种经济实用的方法。 1 3 2 本实验研究内容： ( 1 ) 从不同的植物面粉筛选活力较高的植物酯酶 ( 2 ) 植物酯酶的反应条件研究 ( 3 ) 植物酯酶的部分酶学性质 ( 4 ) 双水相法萃取植物酯酶的研究 ( 5 ) 离子交换及凝胶层析法提纯植物酯酶的研究 ( 6 ) 不同的植物酯酶快速检测有机磷农药研究 沈阳农业大学硕士论文 第二章小麦面粉中植物酯酶的筛选 2 1 材料与主要试剂 辽春9 号小麦( 由辽宁省农科院提供) ；豫麦3 9 ( 由河南农科院提供) ；市售山东面 粉，市售沈阳香雪粉面粉( 购于沈阳农业大学市场) ；乙酸一1 一萘酯，乙酸一2 一萘酯( 上海 试剂一厂) 均为化学纯；固蓝b 盐( 上海化学试剂采购供应站) ( f 1 u k a a g 进口分装) ： 磷酸二氢钠，磷酸氢二钠( 沈阳新兴试剂厂) 均为分析纯。 2 2 主要仪器及设备 紫外分光光度计( u v l l o 型) ( 北京瑞利分析仪器公司) ；p h 计( 上海雷磁仪器厂) ； 高速冷冻离心机( 日本日立公司) ；恒温水浴( 上海医用仪表厂) 。 2 3 实验部分 2 3 1 植物酯酶粗酶液的制备 称取加工好的小麦面粉1 9 ，用蒸馏水提取，面粉与水的比例为1 ：5 ( w v ，g v ) 移 入5 0 m l 离心管中，混合均匀后，在2 5 恒温水浴摇床上振荡提取3 0 m i n ，在4 下以 1 0 ，0 0 0 r p m 的速度离心5 m i n ，所得上清液即为植物酯酶原酶液。 2 3 2 不同的显色基质及p h 缓冲溶液的配制 #