天然黄杨生物碱KBA01靶向突变p53抗肿瘤作用机理的初探.doc

昆明理工大学硕士学位论文分类号_ 密级_U D C_硕士毕业论文天然黄杨生物碱KBA01靶向突变p53抗肿瘤作用机理的初探研 究 生 姓 名 v 指导教师姓名、职称 学 科 专 业 细胞生物学 研 究 方 向 肿瘤药理学 论 文 工 作 起 止 日 期 2014年04月2016年04月论 文 提 交 时 期 2016年04月 Mechanism of action of Natural boxwood alkaloids KBA01 targeting mutant p53 ByWei WuA dissertation submitted for the degree ofMaster of Scienceat the KUNMING UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY2016昆明理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： 年 月 日关于论文使用授权的说明本人完全了解昆明理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅，学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印或其他复制手段保存论文。（保密论文在解密后应遵守）导 师 签 名： 论文作者签名： 日 期： 年 月 日昆明理工大学硕士学位论文摘 要恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，其中结直肠癌的致死率排在世界第三位，我国结直肠癌发病率和死亡率逐年升高，现阶段针对肿瘤治疗大多是手术、放化疗等，但患者治疗后常表现存活期较短，预后效果较差。许多抗肿瘤药物是从天然植物中获得，这些小分子药物可以对肿瘤采取精准的分子靶向治疗，然而这些天然植物药物在治疗肿瘤中所占份额较少，同时药理机制也有待完善。野生型p53（wtp53）为抑癌蛋白，是一转录因子，具有调控细胞周期、细胞凋亡、衰老等功能，在肿瘤中发生超过50的p53突变，超过2000多种p53突变类型，即突变p53（mutp53）在肿瘤细胞中高表达，结肠癌、乳腺癌和肺癌中较常见，肿瘤细胞中，具有分子伴侣作用的热休克蛋白（癌细胞中往往高表达，是肿瘤治疗的靶点）Hsp90、Hsp70、Hsp40等与突变p53形成复合体进而稳定突变p53，导致突变p53半衰期延长（超过24h），常在细胞内聚集，很难被降解，从而具有一些获得性功能（Gain of function，GOF）促进肿瘤的发生发展，所以突变p53也就成为了肿瘤治疗的靶点。癌细胞中，需要更加全面地了解突变p53的获得性功能（GOF），才可能找出更多的肿瘤治疗靶点。如突变p53能够促进热休克转录因子1（Heat Shock Factor 1，HSF1）磷酸化，进而引起热休克反应（Heat Shock Response，HSR），就会表达具有分子伴侣作用的热休克蛋白（Heat shock proteins，Hsps），如Hsp90、Hsp70/72、Hsp40和Hsp27等，它们在肿瘤细胞中具有抗凋亡作用，许多Hsp90抑制剂具有打破Hsp90-突变p53复合体的作用，因此许多Hsp90抑制剂具有抑癌功能，但同时这些小分子化合物能够激活HSF1（肿瘤中往往表达量较高，是肿瘤治疗的新型靶点），启动热休克反应，形成负反馈调节，就会促进热休克蛋白表达，进而促进肿瘤发生发展，这也是部分Hsp90抑制剂很难用于临床试验的重要原因。天然黄杨生物碱KBA01来自小叶黄杨的提取物，在治疗心血管疾病方面的研究较多，然而在抗肿瘤方面的研究较少，发现的黄杨生物碱KBA01的活性结构与Hsp90抑制剂雷公藤中南蛇藤素（celastrol）的结构有相似部分。前期研究发现黄杨生物碱KBA01对含有p53R273H突变的结肠癌细胞HT29的细胞毒活性较强，其细胞毒活性是野生型p53的结肠癌细胞HCT116的4倍，是正常人胚肺细胞MRC-5的10倍，所以我们选择结肠癌HT29（p53R273H）细胞作为后续的抗肿瘤活性研究。我们研究发现黄杨生物碱KBA01对HT29细胞有杀伤作用，影响了肿瘤细胞的生长，改变了HT29细胞的形态，抑制了HT29细胞的克隆形成，同时能够降低突变p53R273H蛋白的表达，降低HSF1和磷酸化HSF1（p-Ser326）的表达，能够降低热休克反应，克服了一些Hsp90抑制剂负反馈激活HSF1的作用，进而降低了Hsp90的表达，使得突变p53稳定的复合体解聚，导致突变p53稳定性下降，同时降低了突变p53R273H蛋白半衰期，具有可能通过E3泛素连接酶CHIP的泛素-蛋白酶体途径降解突变p53的作用。进一步还发现黄杨生物碱KBA01具有使得突变p53部分恢复成野生型p53构象的功能，重新恢复野生型p53结合DNA的转录激活功能，导致肿瘤细胞周期阻滞和p53诱导的凋亡相关蛋白表达，如P21、PUMA、NOXA等，引起肿瘤细胞发生凋亡，具有抗肿瘤的作用。因此黄杨生物碱KBA01既能降低突变p53，又能降低部分Hsp90抑制剂引起的热休克反应，有可能成为肿瘤个性化治疗的重要化合物，为癌症的个性化靶向治疗开辟更广泛的道路。关键词：恶性肿瘤；突变p53；黄杨生物碱KBA01；热休克反应；靶向治疗 ABSTRACTMalignant tumor serious threat to human health. Colorectal cancer is the third mortality rate cancer in the world, and its incidence and mortality is increasing year by year in our country. Currently, cancer treatment mostly uses surgery, radiation and chemotherapy, etc. However, after treatment by them, the survival time of patients are still short, the prognosis effect is still poor. Many anticancer drugs were extract from natural plants, these small molecular drugs can target to tumor cell and kill them. However, these natural plants utilization rate is very low in clinical, and the pharmacological mechanism also needs to more research.Wild-type p53 (wtp53) is a tumor suppressor, and it also is a transcription factor. wtp53 can regulate cell cycle, cell apoptosis, aging, and other cell phenomenon. However, there are more than 50% of p53 mutations and more than 2000 kinds of p53 mutation types in tumors. The expression of mutant p53 (mutp53) is higher in tumor cells, and this phenomenon is more common in colon cancer, breast cancer, lung cancer. In tumor cells, heat shock protein (often highly expressed in tumor cells, and will be the target of tumor therapy), such as Hsp90/Hsp70/Hsp40, which plays a molecular partner role in cells. The present study suggests that heat shock protein (Hsp90/Hsp70/Hsp40) can form a stable complex with mutp53, which result in mutp53 half-life extending (more than 24h), gathered in cells. The stable complex is difficult to degrade, sometimes can further promoting the development of tumor. Therefore, the mutp53 can gain a function, which called Gain of function (GOF). Hence, the mutp53 becomes a target of tumor therapy.In tumor cells, we need to more researches to recomprehensive understanding the GOF of mutp53, which will find out more tumor therapeutic targets. mutp53 can promote heat shock transcription factor 1 (HSF1) phosphorylation, and induce heat shock response. However, heat shock protein, such as Hsp90, Hsp27, Hsp70/72 and Hsp40, which have anti-apoptotic effect in tumor cells. Researches show that some of Hsp90 inhibitors could block the bandage between Hsp90 and mutp53, so some of Hsp90 inhibitors have antitumor function. However, at the same time, these small molecular compounds can active HSF1 (HSF1 often high express in tumor cells, and will be a new type of targets in tumor therapy), then induce heat shock response. This negative feedback regulation, can further promoting the expression of heat shock protein, and further promoting the development of cancer. This is why the research about application of Hsp90 inhibitors in clinical is very hard.KBA01, a natural alkaloid, which come from lobular boxwood extract. It is more researched in the treatment of cardiovascular disease, while less study focus on anti-tumor. In recent years, many studies shown that the steroidal alkaloid composition has antitumor activity. Meanwhile, our previous study discovered that the activity structure of KBA01 (an Hsp90 inhibitors, exist in thunder god vine) is similarly to celastrol structure. Our previous studies also found that the toxic activity of KBA01 in HT29 cell (a colon cancer cell, p53R273H) was four-fold higher than the cytotoxic activity in HCT116 cells (a colon cancer cell, wtp53), and 10 times higher than the cytotoxic activity in MRC-5 cell. Therefore, in order to further research the antitumor activity and mechanism of KBA01, we chose the HT29 cells.Our previous studies found that KBA01 had killing effect to HT29 cell. The compound could inhibit the growth of tumor cells, change the shape and inhibit clone formation of HT29 cell. At the same time, when HT29 cell treated with KBA01, the expression of p53R273H would reduce, the expression of HSF1 and phosphorylation HSF1 (p-Ser326) were also reduced, and then reduce the heat shock response, overcome the effect of negative feedback which lead to by Hsp90 inhibitors and while could activate HSF1. The lower expression of Hsp90, which would lead to destabilization of mutp53 and make depolymerization of the stable complexes, as well as reduce the p53R273H half-life. We suspected that the lower expression of Hsp90 speed up the degradation of mutp53 would through the ubiquitin-proteasome pathway. On the other hand, our further study found that KBA01 could restore the wild-type p53 activity function of mutp53, thus induced some protein express, which are downstream of p53 (such as P21, PUMA, NOXA, etc.). This result would lead to tumor cell cycle arrest and induce tumor cell apoptosis. Therefore, KBA01 can accelerate the degradation of mutp53, and can reduce the heat shock response which caused by other small molecules. KBA01 will be become an important compound for personalized therapy of cancer, and our research result will open a wider range road for personalized targeted therapy of cancer.Keywords: Malignant; Mutant p53; Buxus alkaloid KBA01; Heat shock response; Targeted therapy目 录摘 要VABSTRACTVI插图和附表清单VII缩略词IX第一章 绪 论11.1 结直肠癌概述11.2 p53概述与肿瘤治疗21.2.1 野生型p53与肿瘤21.2.1.1 野生型p53结构域组成21.2.1.2 野生型p53与肿瘤31.2.2 突变p53概述与肿瘤41.2.2.1 p53突变类型41.2.2.2 突变p53获得性功能总述61.2.2.3 突变p53与HSF1之间的关系81.2.2.4 突变p53与热休克蛋白之间的关系101.3 诱发肿瘤细胞凋亡与肿瘤治疗121.4 针对突变p53肿瘤治疗的策略131.4.1 靶向降解突变p53141.4.2 靶向恢复突变p53构象171.4.3 其他途径191.5 黄杨生物碱的研究进展191.6 本研究的主要内容及意义21第二章 实验材料与方法222.1 实验材料222.1.1 细胞株222.1.2 主要实验试剂与材料222.1.3 主要仪器232.1.4 引物232.2 试剂配制252.2.1 细胞培养252.2.2 MTT法252.2.3 免疫印迹262.2.4 免疫荧光272.2.5 克隆形成实验272.2.6 构建载体实验272.3 实验方法282.3.1 细胞培养282.3.2 MTT法检测细胞活力292.3.3 免疫共沉淀CO-IP实验292.3.4 转染302.3.5 克隆形成实验312.3.6 实时定量PCR检测312.3.6.1 细胞总RNA的提取312.3.6.2 逆转录cDNA的合成322.3.6.3 实时定量PCR检测322.3.7 蛋白质印迹332.3.7.1 提取细胞总蛋白332.3.7.2 测定蛋白浓度332.3.7.3 免疫印迹检测342.3.8 免疫荧光352.3.9 数据处理36第三章 实验结果与分析373.1 黄杨生物碱KBA01的细胞毒活性373.2 黄杨生物碱KBA01对HT29细胞形态的影响373.3 黄杨生物碱KBA01能够抑制HT29细胞的克隆形成383.4 黄杨生物碱KBA01在翻译后水平降低突变p53R273H蛋白393.5 黄杨生物碱KBA01对含有非p53R273H位点突变细胞的影响403.6 黄杨生物碱KBA01能够下调外源性突变p53R273H蛋白423.7 黄杨生物碱KBA01对HT29细胞中突变p53R273H蛋白稳定性的影响453.7.1 黄杨生物碱KBA01降低Hsp90蛋白表达，同时影响突变p53与Hsp90之间的相互作用453.7.2 黄杨生物碱KBA01能够降低HSF1蛋白表达，同时影响突变p53R273H蛋白与磷酸化HSF1（p-Ser326）蛋白之间的相互作用463.8 黄杨生物碱KBA01能够降低突变p53R273H蛋白的半衰期493.9 黄杨生物碱KBA01降解突变p53R273H蛋白与泛素-蛋白酶体途径的关系503.10黄杨生物碱KBA01能够使得突变型p53R273H蛋白部分恢复成野生型p53构象513.11 黄杨生物碱KBA01使得构象恢复的p53蛋白有调控下游基因表达的作用，同时诱发HT29细胞凋亡53结 论55第四章 讨 论56第五章 展 望59致 谢60参考文献61附录A 攻读硕士期间发表论文目录68附录B 其他需要说明的内容69插图和附表清单图1. 1 野生型p53结构域组成2图1. 2 抑癌基因p53及其调控的信号通路4图1. 3 突变p53获得性功能机制模型图8图1. 4 肿瘤细胞中突变p53与HSF1和热休克蛋白之间的联系12图1. 5 针对突变p53的肿瘤治疗策略14图3. 1 黄杨生物碱KBA01对HT29细胞形态的影响38图3. 2 黄杨生物碱KBA01对HT29细胞克隆形成的影响39图3. 3 黄杨生物碱KBA01在翻译后水平下调突变p53R273H蛋白40图3. 4 黄杨生物碱对非p53R273H突变细胞的影响41图3. 5 黄杨生物碱KBA01能够下调外源性突变p53R273H蛋白44图3. 6 黄杨生物碱KBA01降低Hsp90蛋白的表达同时影响突变p53与Hsp90之间的相互作用46图3. 7 黄杨生物碱KBA01不能引起热休克反应，同时能够降低热休克反应49图3. 8 黄杨生物碱KBA01能够降低突变p53R273H蛋白半衰期50图3. 9 突变p53有可能通过泛素连接酶CHIP的泛素-蛋白酶体途径降解而降低51图3. 10黄杨生物碱KBA01能够使得突变p53R273H蛋白构象部分恢复成野生型p53构象53图3. 11 黄杨生物碱KBA01诱导野生型p53调控的下游基因表达54表1. 1 结直肠癌中常见的p53错义突变类型6表3. 1 黄杨生物碱KBA01抗肿瘤活性筛选37表3. 2 黄杨生物碱KBA01对含有外源突变p53R273H蛋白的NCI-H1299细胞的细胞毒活性4569缩略词简称英文全称中文全称HSF1Heat shock factor 1热休克转录因子1HSRHeat shock response热休克反应ROSReactive oxygen species活性氧Wtp53Wild type p53野生型p53Mutp53Mutant p53突变型p53ATOarsenic trioxide三氧化二砷SAHASuberoylanilide hydroxamic acid辛二酰苯胺氧肟酸MDM2Mouse double minute小鼠双微体基因2FBSFetal bovine serum胎牛血清PARPPoly (ADP-ribose) polymerase聚（ADP-核糖）聚合酶EDTAEthylene diamine tetracetic acid乙二胺四乙酸shRNAshort hairpin RNA短发卡RNATSP-1thrombospondin-1血小板反应蛋白因子-1PBSPhosphate buffered Saline磷酸盐缓冲液BCL2B-Cell Lymphoma 2B细胞淋巴瘤2蛋白PCDprogrammed cell death细胞程序性死亡siRNASmall interference RNA小片段干涉RNAMPFmaturatin-promoting factor成熟促进因子HDAChistone deacetylase组蛋白去乙酰化酶GOFgain of function获得性功能GAgeldanamycin格尔德霉素GRP94glucose related protein 94葡萄糖关联蛋白VEGFvascular endothelial growth factor血管表皮生长因子NMRNuclear Magbetic Resonance核磁共振RITAreactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosisp53基因的活化与肿瘤细胞凋亡的诱导DEPCDiethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯TrisTris (hydroxymethyl) aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷SDSSodium dodecyl sulphate十二烷基磺酸钠TEMEDN,N,N,N-tetra methyl ethylene diamineN,N,N,N-四甲基乙二胺PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳TBSTTween 20-Tris buffered salineTween 20-Tris缓冲液DAPI4,6-diamidino-2-phenylindole二脒基苯基吲哚DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜EBEthidium bromide溴化乙锭第一章 绪 论1.1 结直肠癌概述结直肠癌（Colorectal cancer）是一种常见的消化道恶性肿瘤，易发，严重威胁着人类的健康，发病率和病死率逐年升高1，在恶性肿瘤中位列世界第三，欧美国家发病率较高，随着生活水平提高，近年来亚洲国家（中国，日本，韩国，新加坡等，每年以24倍的速率增加）发病率逐年升高，我国结直肠癌发病率和死亡率位居全部恶性肿瘤第4位，是世界上结直肠癌发病率和死亡率最高的国家之一。每年接近9的癌症患者逝去，多数直肠癌患者确诊时已是中晚期，同时伴随着潜在转移，大约50结直肠癌患者都发生了肿瘤转移，存活率较低，5年内生存率仅为1020。目前，对于结直肠癌治疗主要有腹腔镜手术切除肿瘤（早中期），辅助化疗和放射治疗（晚期）等多方面综合治疗。但部分肿瘤对化疗药物有耐受性，影响化疗效果及预后，这就需要对促进肿瘤侵袭、迁移的分子机理深入研究。因受到基因调控和环境的影响，在结肠癌中发现一些信号通路失调，如p53、Ras、Wnt/-catenin等信号通路，同时发现突变p53在结肠癌中高表达，存在大量p53突变（突变率约4050，肿瘤近端发生率为34，肿瘤远端为45，主要发生在外显子58的DNA结合域），这些分子调控的改变可导致肿瘤耐药，同时表现预后不良。所以需要找出癌细胞与正常细胞不同的关键分子，针对肿瘤细胞的相关通路分子的靶向治疗已成为结直肠癌治疗的新途径2。如今应对结直肠癌措施如下，第一，提高较早的诊断率尤为重要；第二，患者需改变自己的饮食习惯，加强身体锻炼等；第三，治疗结肠癌有效的化疗药物较少，亟待开发使用，近年来，探究天然化合物的药理作用机制，用天然产物作为补充或替代治疗药物已经受到人们的重视。所以，需要采用分子靶向筛选系统得到可以治疗结直肠癌或协助其他临床药物治疗的新型天然化合物3，望其能够降低结直肠癌的复发率、病死率和转移几率，提高治愈率和减小药物给患者带来的副作用等。 1.2 p53概述与肿瘤治疗1.2.1 野生型p53与肿瘤1.2.1.1 野生型p53结构域组成人的p53基因位于染色体17p13.1，大约20kb，包含11个外显子，为抑癌基因，它的研究已超过35年，是“基因组卫士”，起初发现其能与SV40病毒的大T抗原结合，为一转录因子，具有转录激活功能4，p53蛋白结构（图1.1）包含194位氨基酸残基的N端转录激活域（Transactivation domain，TAD），脯氨酸（SH3）富集区域（Proline domain，PD），这两个区域是正调控因子（p300/CBP或TAFII40/60）或负调控因子（MDM2或MDMX）的结合位点，还有94292位氨基酸残基的DNA结合域（DNA binding domain，DBD），此区域多发生p53点突变5，最后还有C端调节域（C-terminal regulatory domain），主要包括核定位信号域（nuclear location signal，NLS）和出核信号域（NES），四聚化域（Tetramerization，TET），C端调节域多发生翻译后修饰。核蛋白p53以四聚体形式存在，不稳定，蛋白含量较低，半衰期较短（2035min），而突变型p53半衰期较长（148h）。hdm2/mdm2作为最主要的p53负调控蛋白, 又是p53的靶基因，通过转录抑制而行使E3泛素连接酶的泛素-26S蛋白酶体途径降解p536。p53的翻译后修饰（PTMs）主要集中在C端调节域（C-TER），如磷酸化（CK1，CK2，HIPK2），乙酰化（CBP/p300，MOZ），糖基化，SUMO化，苏素化和甲基化等，行使较广泛的生理功能作用7。图1. 1 野生型p53结构域组成1.2.1.2 野生型p53与肿瘤转录因子p53，通过调节多个靶基因表达来实现其多种功能（图1.2），主要有以下九方面的作用，第一，细胞周期阻滞：细胞周期中，p53主要对G1和G2/M期检查点监控，具有转录激活功能8，能够激活下游靶基因p21表达，p21又能与cyclin-CDK复合物结合，引起G1期阻滞；p53还有另外四个下游基因14-3-3、cyclin B1、cyclin G和Gadd45（growth arrest and DNA danage 45）参与G2/M期阻滞。cyclin B1与Cdc2(CDK1)结合后细胞才能进入有丝分裂，p53能够下调cyclin B1表达，细胞就不能进入M期，Gadd45可以抑制cyclin B1-CDK1复合物的活性，细胞质中14-3-3通过与CDK1结合，抑制有丝分裂。第二，诱导凋亡：p53能够上调bax、bim、noxa和puma等凋亡相关蛋白，同时下调抗凋亡Bcl-2蛋白表达9，p53可通过线粒体途径对凋亡进行调控，细胞色素C从线粒体上释放，结合到Apaf-1，导致凋亡前体caspase-9蛋白表达，最后导致caspase-3，-6，-7蛋白的表达；p53还可以通过DR5（TRAIL-R2）、Fas（CD95/APO-1）蛋白、PIDD（p53-induced protein with death domain）等死亡受体途径，然后激活caspase-8，最后诱导caspase-3的激活，最终诱导细胞发生凋亡。第三，维持基因组稳定：DNA损伤后，通过ATM基因激活p53，p53诱导CDK抑制剂p21表达，引起G1期阻滞；同时p53还可活化DNA修复基因Gadd45的表达，进行DNA修复，如修复成功，p53就会活化mdm2基因，从而反馈抑制p53表达，受损细胞DNA修复成功就会进入S期，如修复失败，则通过上调DR5、Bax、Fas等基因表达使细胞进入凋亡程序，以保证基因组遗传稳定性。大多数癌细胞发生了p53缺失或突变，DNA损伤后不能通过p53介导进入G1期阻滞和DNA修复，因此遗传信息受损的细胞进入增殖，最终发展为恶性肿瘤。第四，诱导衰老：研究得出p53、Rb、p19Arf和p14ARF等有促进衰老作用10，p53主要介导端粒功能异常、DNA损伤引起的衰老过程，实验证明了p53过度表达的动物，表现出早熟，寿命缩短等负面效应，同时p53失活后会导致细胞摆脱衰老，可以引发肿瘤。第五，抑制血管生成：研究得出p53和血管表皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）有相关联系，野生型p53通过下调VEGF来抑制血管生成，p53突变后VEGF表达增加，肿瘤微血管增多，微环境改变，促进肿瘤的生长。同时p53还能够上调血管生成抑制因子的血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）11，p53突变后，不能对TSP-1进行调节，即TSP-1表达急剧下调，肿瘤生长；第六，调节其他靶基因表达，突变p53能够调控胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGF-binding proteins 3，IGF-BP3）的表达，IGFBP-3起着延长IGF-1半衰期的作用，可调控IGF对细胞的增殖、代谢和有丝分裂的作用，p53突变后，细胞生长代谢紊乱，导致细胞恶性转化；第七，发现p53可调控DRAM、ISG20L1的表达，调节细胞自噬12；第八，p53通过促进下游相关基因表达，进而调控细胞能量代谢和抗氧化应激反应；第九，p53还可以与其他蛋白相互作用，正向或负向调控蛋白的功能等13。图1. 2 抑癌基因p53及其调控的信号通路1.2.2 突变p53概述与肿瘤1.2.2.1 p53突变类型突变p53研究起于1993年，是人类最常见的基因突变，超过50的人类肿瘤中发现p53功能失活或获得性功能，p53突变类型超过2000多例，常见于结直肠癌（表1.1）、肺癌、乳腺癌、和胰腺癌中14。主要是p53缺失或错义突变（接近95），蛋白结构中主要发生了单个氨基酸改变，1/3的点突变中主要是以下两类点突变，DNA结合域突变（如R273H/C，与DNA序列结合的氨基酸残基支链过长从而抑制了与DNA结合的功能）或蛋白构象改变（如R175H、V143A、Y220C、G245S、R249S、F270L、R282W等）15。根据p53功能失活或有获得性功能主要分为以下七种形式：p53基因突变，类型有基因片段缺失、插入、点突变、杂合性缺失等。在所有p53突变形式中，占主导地位的是因点突变引起的错义突变，其比例约占总体的8016。导致p53蛋白截短的无义突变或移码突变不是很常见。p53突变大多数集中在DNA结合域，有4个突变热点区域，密码子129146、171179、234260、270287等区域，这些热点位于进化保守区，具有重要功能。例如在人肝癌中，黄曲霉毒素B1可引起p53第249位密码子突变（AGGAGT）等17；蛋白功能丧失的突变，主要是蛋白构象改变，此类突变后，p53蛋白没有抑癌功能，主要发生在转录激活域，包括p53的DNA结合区域；被DNA肿瘤病毒蛋白失活：在病毒致瘤中，主要的致瘤原因是肿瘤病毒蛋白与p53结合，从而导致p53结构或构象改变，如发现p53相关的SV40大T抗原、腺病毒EBNA-1、E1B、HBxAg、HPV E6等。主要机制是能够促进p53通过泛素-蛋白酶体途径降解，干扰p53的转录激活作用，导致p53失活。这些DNA肿瘤病毒蛋白不仅可以使p53失活，同时也能使pRb失活，两个抑癌基因同时失活，增加了细胞的恶性转化18；负显性突变，由于p53是由四个亚基组成，其中一个亚基发生突变或失活，那么p53蛋白就会失去功能，主要是等位基因其中一个发生突变，那么只有半剂量的p53，抑制肿瘤也很微弱，这会增加李法美尼症（Li-Fraumeni syndrome）患者的易感性19；p53的误位：p53是一种转录因子，只在核内才发挥抑癌作用，由于核定位信号缺失，p53就会在胞质中停留，不能进入核内发挥作用，从而就会缺失抑癌功能20；获得性功能突变：p53突变后重新获得了一些促进细胞恶性转化的功能，这种突变发生在大多数肿瘤中，研究最多，已经成为了肿瘤治疗的靶点；被一些泛素连接酶抑制：如高表达的Mdm2蛋白通过与p53的N端结合而抑制野生型p53功能，或有其他泛素连接酶参与p53泛素-蛋白酶体降解等。p53突变常在肿瘤细胞中发生较晚，有可能与肿瘤的浸润和转移相关，其能够促进细胞DNA损伤、癌细胞存活、增生侵袭等。如具有遗传性的一个p53基因突变患有Li-Fraumeni综合征的人，在50岁时发生第二次突变产生恶性肿瘤的可能性高于p53基因正常的人群25倍，能够发生白血病、肉瘤、乳腺癌等21。 表1. 1 结直肠癌中常见的p53错义突变类型CodonCodon changeNucleotide changeAmino acid change175CGCCACGAArgHis245GGCAGCGAGlySer245GGCGACGAGlyAsp248CGGTGGCTArgTrp248CGGCAGGAArgGln273CGTTGTCTArgCys273CGTCATGAArgHis282CGGTGGCTArgTrp1.2.2.2 突变p53获得性功能总述研究发现突变p53在结肠癌、乳腺癌、肺癌中高表达，能够导致细胞恶性转化，如细胞周期、代谢、粘附和迁移的改变22，同时表现预后不良。从细胞和动物模型的研究中得到突变p53能够促进肿瘤发生，降低化疗药物的敏感性；增加肿瘤细胞的迁移侵袭能力23，增加了癌细胞对射线照射的耐受性，促进了化学物质引起的肿瘤发生；通过电离辐射后，增加了染色体的同源重组，增加了拓扑异构酶的活性，增加了细胞中DNA的合成，增加基因的拷贝数，细胞过度生长；还能够协作TGF-信号通路，增加肿瘤血管生成的能力，促进慢性炎症进而发展成为恶性肿瘤等。Liu等24研究当敲入突变p53R175H或R273H后，相较于p53纯合或杂合缺失的小鼠，敲入的小鼠表现出更广的肿瘤谱。突变p53主要有以下八方面的获得性功能（图1.3）：改变细胞周期，突变p53能够引起基因组不稳定性，打破细胞周期检验点，导致癌细胞无限增殖；主要是失去了野生型p53下游转录激活的功能，下游引发凋亡相关基因低表达，细胞周期紊乱，凋亡抑制发生，从而促进肿瘤发生；突变p53还可以通过蛋白之间的相互作用，影响抑癌蛋白的功能，如p53家族蛋白，p63和p73，抑制p63或p73结合到启动子区域25，或结合DNA修复相关蛋白，或凋亡相关蛋白，抑制肿瘤细胞凋亡；通过突变p53调控的下游基因，有可能结合到G/C丰富的转录起始位点上面，如激活细胞过度生长的相关基因，如c-fos、c-myc、PCNA、cyclin A/B1/B2、cdk1、cdc25c、Fas等，其次，突变p53还能够激活细胞迁移和血管生成的基因ID4H和趋化因子CXCL1、CXCL5、CXCL8/CXCL12，CXCL1和CXCL8是ID4转录激活靶基因26，同时还可以激活MMP-13和EGFR，抑制DNA修复，导致癌细胞过度生长；Lotem等27研究在白血病细胞中突变p53能够抑制c-Myc诱导的细胞凋亡通路。Li等28得出降低内源性突变p53后，肿瘤细胞对一些化疗药物（阿霉素和顺铂等）更加敏感。Blandino等29研究得出非小细胞肺癌NCI-H1299细胞中引入p53R175H或p53R273H突变蛋白后，细胞耐药性增加。Buganim等30研究得到突变p53能够与RAS相互作用，引起前肿瘤因子的表达，如趋化因子，白介素和ECM相连的分子，这些是肿瘤迁移和侵袭的主要调控因子。Kalo等31研究发现突变p53能够抑制TGF- receptor type II的表达，使得TGF-信号通路（抑制肿瘤生长和迁移）失调。Adorno等32得到突变p53能够通过受体增加一些信号通路的信号，如TGF-b、表皮生长因子受体、MET等，同时还发现突变p53能够调节促进肿瘤侵袭的一些因子，如Dicer（miRNAs调节一些基因促进肿瘤细胞侵袭）、DEPDC1、Cyclin G2、Sharp1等表达，增加了肿瘤细胞迁移和侵袭。Muller等33研究突变p53能够增强整合素所驱动的循环或增加生长因子受体的表达；突变p53还能够促进一些蛋白质功能，与其他一些共转录因子（NF-Y、E2F1、Vitamin D Receptor、Ets-1、NF-kB、YAP等）相互作用，如突变p53与CREBP/p300相互作用，染色体中部分组蛋白乙酰化，就会促进基因的转录，如胆固醇合成，活性氧增加，癌细胞耐受性增加，提高了细胞存活力，促进肿瘤发生发展。同时突变p53能够激活HSF1，同时增加磷酸化HSF1（p-Ser326）的转录激活功能，增加热休克反应，使得肿瘤细胞更加地适应肿瘤微环境，促进肿瘤的侵袭和转移。对于p53不同的突变，表现出的功能不尽相同，如p53R273H，p53R273C能够引起肿瘤细胞的侵袭和转移，但p53R273G并未出现类似情况，如R248Q和R248W都是结构突变，当R248Q敲入小鼠体内，小鼠表现出更广的肿瘤谱34，同时减少了生存期，然而R248W敲入小鼠体内后，并未表现出同样的效果；突变p53获得性功能还有其诱导miR-155驱动乳腺癌的侵袭等，同时还有下调miR-16-1、miR-143、miR-145等功能。图1. 3 突变p53获得性功能机制模型图1.2.2.3 突变p53与HSF1之间的关系人类主要有三种热休克转录因子（HSF-1，-2和-4），热休克反应主要是HSF1