（环境科学专业论文）蒽醌类化合物对大型溞（daphnia+magna）急性光致毒性与qsar.pdf

蒽醌类化台物对大型涵( 嘞蛔m 铝 d ) 急性光致毒性与q s a r a c u t ep h o t o i n d u c e dt o x i c i 锣o fa j l t h r a q u i n o n e st om ec m s t a c e a n d 印五刀f 口，押q g - 刀口a n dq s a r a b s t r a c t a n 岫a q u i n o n c s a r ea 1 1 i m p o r t a l l tm d u s t r i a lm t e r i a l ，a n di t i sr 印o n e dt h a ts o i n e 纽断a q u i n o n e sh a v ep h o t o s e n s i t i z a t i o na c t i v 姆t h u s 也e r ec o m p o u n d s ，d i s c h a f g e d 证t o a q u e o u ss y s t e m ，m a yt a k ep l a c ep h o t o c h e l i l i s 拉yr e a c t i o a f c e ra b s o r bv i s i b l cl i g h t ，a n dl e a dt o h a v eag r e a tr i s kf o ra q u e o u se c o l o g ys y s t e m s d q p 办，z 曲m 删h a v eb e e nu s e d 、0 r d 一、v i d ea s as t a n d a r dt e s to r g a n i s mf o re c o t o x i c o l o 百c a le v a l 删o no fc o n t 锄i n a t i o n t h et t l e s i ss t l l d y 也ea c u t et o x i c i t yo f2 0 锄t h m q l l i n o n e st od 嘎砷一拙m 郇弘口u n d e rh r o d i 丘e r e n t1 i 曲们a r kc y c l e s ，1 4 ( 1 i 曲t ) ：1 0h ( d a r k ) ，锄ds o l ed a r k f u m l e n n o r e ，t l l e i r p h o t o i n d u c e dt o x i c 蚵t on 罕砌妇卅q 卵口a 1 1 dt l l ee 虢c t so f 铆os 0 1 u b i l i z i n ga g 曲t so n 1 c p h o t o i n d u c e dt o x i c 姆 w a s i n v e s t i g a t e d b a s e do n t o 姐c 埘d a 诅， a q 嘞t i 能i v e s 自n 】c t u r e - a c t i 、i t yr e l a t i o n s h i p ( q s a r ) w a so b t a i n e d t l l em e c h a n j s mo ft h ep h o t o i n d u c c d t o x i c i 够w a sa l s od i s c u s s e d t h er e s u l t si n d i c a t e d 出a ts e v e nc o m p o u n d sw e r cn o tt o x i c 1 ，2 一d m y d r o x y a n n l r a q l l i 】1 0 e a n d 1 ，4 一d j h y d r o x m 也r a q l l i n o n e w 时e s u b j e c t t o p h o t o m o d i f i c a t i o nu n d e rm ed a y l i g h tn u o r e s c 既tl 锄p t h ep h o t o i l l d u c e dt o x i c 姆o f 也e t e s t e de l e v e n 皤妞唧幽o n e st od 印矗蹿妞埘铅船w a se n h a n c e dd u et op h o t o s e n s 论z a t i o n t h e t w oc o s o l v e n t s ，d i m e m y l s l l l f o x i d ea 1 1 da c e t o n e ，d i dn o ta f r e c tm ep h o t o i n d u c e dt o x i c i 够o f l ec o m p o u n d s t h ep h o t o 址d u c e dt o ) 【i c i 哆o f 也ea i m l r a q u m o n e sd e p e n d e do nt h en 啪b e r ， p o s i t i o na 1 1 de l e c t r o n d o n 釉ga b i l i 移o ft h es u b s t i n l e n tg r o u p st ot h ep a r e n ts 协l c t u r eo f 觚恤a q u 进o n e t h eg 印b e 铆e e nt 1 1 ee n e r g yo f m e1 1 i g h e s 七o c c u p i e dm o l e c u l a ro r b “a la 1 1 d 也e l o w e s tu n o c c u p i e dm o l e c u l a r0 r b i t a lc a i lb eu s e da sa ni 1 1 d i c a t o ro f t h ep o t e n t i a lp h o t o i n d u c e d t o x i c 埘o fa 1 1 t 1 1 r a q u i n o n e st od 印矗行蛔珊铝竹口c u mo ft h ef i n a lm o d e l so ft 1 1 et o x i c i t yo f 也e t e s t e de l e v e na n 断a q u i r l o n e st od 印矗玎扭掰哪口，w e r ek g h e rt h a i lo 9 0 2 ，i n d i c a 血gt h a tt h e m o d e l sh a v eg o o dp r e d i c t i v ea b i l i t ya 1 1 dr o b u s 廿1 e s s t h em a i nf a c t o r sg o v e m i n gp h o t o i n d u c e d t o x i c i 哆o ft h ea n t t l r a q u i n o n ea r em o l e c u l a rp o l a r i 母，山ea b i l i t yo fe l e c t r o nt r a i l s i t i o na n dt h e 1 a r g e s tn e g a t i v en e ta 上o m i cc h a r g e s k 呵w o r d s ：a n t h r a q u i n o 髓；d 印矗开妇m 昭栉彤p h o t o i n d u c e dt o i i c i t y ；q s a r 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：日期：趔、) v 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名： l 丕砀 导师签名整塞重 逃年上月盥日 大连理工大学硕士学位论文 引言 毒理学的研究可以追溯到早期人类社会，当时各种各样的天然毒素用于打猎、战争 和暗杀下毒。环境毒理学( 或生态毒理学) 源于生态学和毒理学，从有机体、人体或是生 态系统水平上研究污染物对环境的影响。工业时代，大量化石燃料、化学农药、化肥、 化学药物、人造纤维、塑料、颜料、染料、食品调味齐u 和防腐剂的使用，大大改善了人 们的生活条件，同时伴随着大量的污染物流入环境。世界著名的公害事件的出现逐渐增 强了公众环境意识，更促进了生态毒理学的迅速发展。 地球上的生物生长离不开太阳辐射，阳光为生物生长提供能量。但太阳光中含有约 4 的紫外光，它可以直接破坏生物的核酸和蛋白质；此外，一些生命体外的化学物质 吸收可见光或近紫外光，发生一系列光化学反应而产生间接光毒性【2 】。地球表面大约7 0 是水环境，而且大多数污染物都是通过工业废水进入自然水体。水环境中的某些污染物 吸收太阳光后，通过一系列的物理化学反应，对水生生物产生毒害作用，进而威胁整个 生态系统和人类的健康。因此，研究水环境中有机污染物的光致毒性具有深远的意义。 蒽醌类化合物是重要的化工原料和中间体，被广泛应用于医药和染料工业。制药和 印染行业中产生的大量未处理或处理未达标废水的直接排放，是造成我国水体污染的一 个重要因素，其中不可避免的会含有大量蒽醌类化合物。在可见光区域，蒽醌类化合物 具有较高的光敏活性，可以通过光化学作用产生高活性的物质，从而对生物分子或细胞 产生一系列的破坏作用呻l 。m a l l a k m 等人在研究多环芳烃( p a h 曲光解产物的毒性时，发 现几种羟基葸醌对浮萍犯e m 力口g 西6 有光致毒性【5 】。虽然关于蒽醌类化合物毒性的研究 有很多【6 ，但关于葸醌类化合物光致毒性的系统性研究，则尚未见到报道。 本文研究了可见光条件下蒽醌类化合物对水生浮游动物大型涵的毒性变化。大部分 化合物在无光照时对大型漫未表现出毒性，而暴露光照条件下多数化含物毒性显著增 大。光致毒性的机理一般认为有两种：光修饰或光敏化【嘲。根据光照条件下，葸醌类化 合物对大型涵的急性毒性数据建立的定量结构一活性关系( q s a r ) 模型，初步探讨了葸 醌类化含物光致毒性机理。为此类化合物的生态风险性评价提供了基础数据。 葸醌类化合物对大型涵( d 珈妞口g 砌急性光致毒性与q s a r 1 研究背景 1 1 蒽醌类化合物的性质和应用 1 1 1 蒽醌类化合物的理化性质与光谱分析 葸醌类化合物通常被认为是蒽醌( a i l m r 卿l j n 彻e ) 的各种衍生物，但广义的蒽醌类化 台物除了蒽醌衍生物外，还包括其不同还原程度的产物，如氧化蒽酚、蒽酚、蒽酮及葸 酮的二聚物【l l 】。图1 1 给出葸醌、氧化蒽酚、蒽酮和葸酚的结构。蒽醌的l ，4 ，5 ，8 位称n 位，2 ，3 ，6 ，7 位称b 位，9 ，1 0 位称m 嚣d 位。葸配衍生物是指蒽醌的a ，p 位 连有不同取代基的化合物。 0 葸醌氧化蒽酚 蒽酮蒽酚 图1 1 葸醌、氧化蒽酚、葸酮和葸酚的结构 f i g 1 1s 讯l c t u r e so f 锄曲r a q 血o n e ，1 0 - h y d r o x y 髓t i 咖e ，姐t 虹o n ea r m9 - 鼬m r a c 锄e 天然的蒽醌类化合物存在于高等植物( 茜草科植物中居多) 、霉菌( 曲霉属和青霉属居 多) 、地衣和动物体内，目前，人们已经从自然界中提取出了3 0 0 多种蒽醌衍生物。这 些天然蒽醌类化合物多数是蒽醌的羟基、羟甲基、甲氧基和羧基衍生物，常以游离状态 或与糖结合成甙的状态存在。蒽酚、蒽酮的羟基衍生物一般存在于新鲜植物中，该类成 分可被逐步氧化 1 1 1 。例如，蒽酚m e j d 位上的羟基容易被氧化，但它与糖结合生成苷后 就比较稳定。 游离蒽醌类化合物几乎不溶于冷水，微溶于冷乙醇，在热乙醇中溶解度较大，一般 可溶于甲苯、氯仿、乙醚、吡啶、丙酮、冰醇酸及碱溶液。蒽醌苷类易溶于热水和碱溶 液，在甲醇、乙醇、冰醋酸及吡啶等溶液中溶解度较大，在冷水中溶解度较小，难溶于 乙醚、甲苯、氯仿等有机溶液j 。 葸醌类化合物具有不饱和酮的结构，当分子中连接助色团后会呈现出多种颜色，而 且随着助色团的增多颜色加深。大多数蒽醌类化合物是黄色、红色、橙红色或紫红色晶 体，且在不同p h 下可能出现不同的荧光。一些葸醌类化合物具有显色反应：1 ) 与碱显 大连理工大学硕士学位论文 色，一些葸醌类化合物滴加氨水或碱液则颜色加深，如大黄的根茎呈黄色，与碱反应显 红色；2 ) 与酸显色，葸醌类化合物与浓硫酸反应呈红至红紫色；3 ) 与乙酸镁显色，含有 a - 羟基蒽醌类化合物的甲醇溶液中，加入0 2 5 0 5 0 乙酸镁甲醇溶液即显色，颜色随 羟基的位置而改变，一般q 羟基的对位有羟基的蒽醌类化合物与乙酸镁反应显紫色，在 邻位有羟基的蒽醌类化合物与乙酸镁反应显蓝色，其它的葸醌类化合物与乙酸镁反应显 橙至红色【1 ”。 蒽醌类化合物多具有一定的酸性，其酸性强弱与分子中是否存在羰基以及酚羟基的 数目和位置等有关。p 一羟基葸醌中，受羰基吸电子作用的影响，p 羟基上氧原子的电子 密度降低，质子解离度增高，故酸性较强；c 【羟基与相邻羰基形成分子内氢键，降低了 质子的解离度，故n 羟基蒽醌酸性较弱。在不同的口h 范围内，羟基葸醌在水溶液中的 存在形式可能是中性化合物、单阴离子化合物和双阴离子化合物。式1 1 显示了，a 7 二羟基葸醌a q ( o h ) 2 在不同p h 范围内存在的形态【1 2 1 。 a q ( o h ) 2 一a q ( o h ) o _ 一a q o - 2 蒽醌类化合物高度不饱和的母核使其在紫外和可见光区具有多个吸收带，这些紫外 和可见吸收峰的位置和吸收强度与蒽醌母核上取代基的性质、数量及排列方式有关。如 2 3 0 蛳附近的峰与酚羟基数目有关：蒽醌母核上带有一个酚羟基时最大吸收峰为2 2 5 蛐；当酚羟基数目增加，该吸收峰则随酚羟基数目的增加，向长波方向移动。蒽醌母核 上有p 酚羟基存在时，2 6 0 2 9 5n m 范围有吸收峰1 9 8 值大于4 1 ，否则提示没有p 酚羟 基存在【l ”。葸醌具有苯样结构和醌样结构，因此在紫外光区有四个特征吸收峰( 见图1 1 ) ， 随着助色团( 如1 c h 3 ，旬h ，_ n h 2 ) 的介入，醌样结构中羰基的吸收带发生红移，导致其衍 生物在可见光范围内有吸收，尤其是位取代基对可见光区的吸收峰影响较大【l3 1 。例如， 蒽醌类化合物含有一个a 羟基，4 0 0 - 4 2 0 啪处出现吸收峰；含有两个或两个以上洳羟 基，则将在4 3 0n m 以上出现吸收峰，且吸收峰的数目随洳羟基数目增加而增多。因此， 通过蒽醌类化合物的紫外可见光谱，可以获得一定的结构信息，对于推测其取代类型 有重要的参考价值i l ”。 蒽醌类化合物对大型涵( d 珈蛔m 昭m ) 急性光致毒性与q s a r 2 5 2m n3 2 5 m2 7 2 咖4 0 5 m 苯样结构醌样结构 图i 2 葸醌的分子结构 f i 晷1 2m o l e c u l a rs t 九l c h i r e so f a n f h f a q l 血o n e 蒽醌羰基吸收峰的红外光谱对结构分析有参考价值。未取代蒽醌两个羰基的化学环 境相同，故红外光谱中仅有一个羰基吸收峰，其频率为1 6 7 5c m - l 。羰基吸收峰受吸电子 基的影响将向高频率方向位移，受给电子基的影响将向低频率方向位移。不含a - o h 蒽 醌化合物的= 0 一般在1 6 7 9 1 6 5 3c m 。1 之间；含一个a 0 h 葸醌化合物的一个羰基与羟 基生成氢键，因此两个羰基的化学环境有明显的差别，在1 r 谱上出现两个羰基峰，分 别在1 6 6 0 c m 1 和1 6 3 0c m 1 附近。如，羟基葸醌红外光谱特征是1 6 7 0c m 4 附近有羰基的 伸缩振动吸收，3 6 0 0 3 1 5 0c m 区间有羟基的伸缩振动吸收，1 6 0 0 1 4 8 0c m 4 区间有苯环 的骨架振动吸收【l “。 蒽醌类化合物的质谱中，分子离子峰为基峰且是强峰。葸醣的质谱特征是相继失去 两分子一氧化碳，形成+ 1 8 0 ( m c o ) 及1 5 2 ( m 。2 c 嘞的强峰。一羟基慧醌和二羟基蒽醌除 了有( m t o h ) 离子以外，还分别有o d - 3 c o ) 和( m _ 4 c o ) 等强峰。旺甲氧基蒽醌的质谱中会 出现0 v i c h 0 ) 强峰i “j 。 慈醌母核劳氢的核磁共振信号分为两类；船芳氢处于c = o 的负屏蔽区，受c = o 的 影响较大，共振主要在低磁场区，峰中心在68 0 7 左右；b - 芳氢受c = o 的影响稍小，共 振发生在较高磁场处，峰中心在66 6 7 左右。1 3 c n m r 在蒽醌类化合物的鉴定中有重要 的地位。蒽醌母核的碳原子可分为四类：a 碳1 2 6 2 ，b 碳1 3 4 3 ，羰基碳1 8 2 5 ，季碳 1 3 2 9 。葸醌衍生物中取代基的性质、数目和位置对芳氢和环上碳的化学位移、峰形均产 生影响，葸醌母核也会影响取代基质子的化学位移和峰形【“j 。 1 1 。2 蒽醌类化含物的应用 多数葸醌类化合物都有颜色，是一类早为人们所熟知和使用的天然颜料染料，如茜 素( 1 ，2 一二羟基葸醌) 是最著名的蒽醌染料，存在于亚洲的茜草根中，数百年以前古埃及人 和古波斯人就使用茜素美化自己的生活。随着染料科技的进步，合成染料逐渐代替了天 大连理工大学硕士学位论文 然染料，大量的蒽醌类化合物作为染料或中间体被合成使用。目前，葸醌染料是用量仅 次于偶氮染料的第二大的染料，由于其耐晒牢度好、颜色鲜艳，在红、紫、蓝、绿的深 色染料中占有不可取代的重要地位。因为a 羟基或氨基的氢与羰基形成氢键后，能使蒽 醌的发色体系产生深色效应，提高发色强度，所以几乎所有的蒽醌染料都是羟基或氨 基的蒽醌衍生物。在印染行业中，蒽醌染料不仅可用于涤纶及混纺织物的印染，还可用 于锦纶、腈纶、丙纶、醋纤、羊毛、丝绸的印染i l “。另外，蒽醌类化合物作为着色剂广 泛应用在食品、药品、化妆品和染发剂中。 葸醌类化合物也是重要的化工中间体。如1 氨基葸醌是用途最多、耗量最大的合成 葸醌染料中间体，是生产溴氨酸、吡唑葸酮的主要原料，不仅用于生产分散、还原、酸 性、活性染料，还用于油墨、涂料、聚合物类颜料的生产，并可作为光降解聚酯的光敏 剂，近年来，还被应用作为液晶染料【1 5 】。 蒽醌类化合物具有生理活性，近些年来被广泛应用于医药行业。许多中草药的主要 活性成分是蒽醌类化合物。天然的蒽醌类化合物多具有致泻作用，是泻药( 西宁掌叶， 各种鼠李属植物) 的主要致泻成分：某些葸醌类化合物( 如大黄素、芦荟大黄素等) 具有抗 菌、抗炎、抗氧化能力；蒽环酮类抗生素是2 0 世纪7 0 年代发展起来的抗肿瘤抗生素【 。 另外，在可见光和紫外光照射下蒽醌类化合物是很好的电子转移介体。一些蒽醌类 化合物吸收光后，与氧反应产生高活性的物质，如单线态氧( 1 0 2 ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 ：) 和羟基自由基( o h ) 【4 】，由于这些高活性物质对生物分子或细胞可以产生强烈的破坏作 用，因此在疾病的治疗中得到应用。大黄酚、大黄素和乙醇提取的葸醌混合物在可见光 4 0 0 5 0 0n m 范围内的消光系数分别是l 黔= 4 0 2 ( 4 3 3n m ) 、l 嚣= 3 8 5 ( 4 4 3n i n ) ，而波长在 4 0 0 - 5 0 0n m 的可见光穿透生物组织不到1m m ，正好与微血管类疾病的病灶深度相符， 有可能成为一类新型的光动力药物【1 6 】。此外，葸醌类化合物在太阳光的可见光区域具有 较高的光敏活性而且价格低廉，容易获得，在光活化农药方面也具有潜在的应用前剥1 6 1 。 利用葸醌类化合物的光敏活性，同时使用t i 0 2 和紫外光处理蒽醌类染料废水的研究也 在进行中【1 7 】。 1 1 3 蒽醌类化合物的毒性 天然存在和人工合成的蒽醌类化合物的广泛应用，使人们的生活总是不可避免的直 接或间接的暴露于此类化合物中。在染料的应用上，西欧的一些消费者认为，由于穿着 和使用有毒染料染色的衣物，使人们处于成衣产品所带来的不可估计的危险之中，称之 为“衣服毒素”和“衣橱内的化学品，i “j 。 蒽醌类化合物对大型涵( d 私砌m 叼功急性光致毒性与c i s a r 全世界每年生产7 1 0 5 吨染料，据估计约有1 0 1 5 的染料在使用过程中被释放 到环境中i l ”。我国是染料生产和出口大国，2 0 0 3 年染料的总产量达到5 4 2 万吨，约占 世界染料总产量的5 5 ，并以年均2 l 的速度增加。但是，伴随着经济发展，染料生产 使用与环境保护的冲突也日益尖锐。我国每年生产大量蒽醌类染料，其生产工艺长，三 废排放量大。制药和印染行业中所产生的大量未处理或处理未达标废水的直接排放，是 我国水体的一个主要污染源。一些发达国家的环保部门已开始对染料生产厂家所排废水 的毒性提出了严格的限制要求。近些年来，涌现出大量有关水中葸醌类化合物处理方法 方面的研究”4 。 般来说葱醌类化合物溶解度低，熔点高，性质稳定，难以生物降解。这些物质一 般具有较高的亲脂性，进入水体后能在水生生物体内富集，而后可能通过食物链的放大 作用对人类构成威胁。有研究表明，某些羟基蒽醌对沙门氏菌胁鹏胁仰j l 拥“r f 蜊) 和小白鼠具有致癌、致畸性【6 】，抑制发光菌( 矿加拍p ，f ) 新陈代谢1 2 0 1 ，甚至2 氨基蒽醌、 l ，8 - 二羟基葸醌和1 氨基2 ，4 二溴葸醌被怀疑对人类有致癌性【2 l 】。2 0 0 2 年y e n 等人研 究了几种葱醌类化合物对水生生物的急性毒性( 见表1 1 ) ，可以看出这些化合物对绿藻 ( 凸，0 烨砌w ，g 护砷和鲤鱼( 唧砌蛐c 卵f d ) 有很高的毒性，但绿藻和鲤鱼对该类化合物毒 性的敏感性较差例。 表1 1 葸醌类化合物对绿藻( c 枷坤肠v “轫r 括) 和鲤鱼( c 抄锄埘p f o ) 的毒性( m g ，l ) t a b 1 1t 0 x i c 姆o f 锄她州n o n e st oc h l o r e l l aa 1 1 dc a r p ( m 叽) 大连理工大学硕士学位论文 蒽醌类化合物对可见光有吸收，且具有较高的光敏活性。i e r l 出a n 等人发现，某 些葸醌衍生物吸收可见光后，能与环境中氧发生电子和能量转移生成高活性的物质( 1 0 2 和0 2 ：) ，然后这些高活性的物质破坏生物分子或细胞而致毒【】。m a l l a k i n 等人研究了 模拟太阳光条件下1 0 种羟基蒽醌对工p m 6 6 口的光致毒性，结果表明模拟阳光条件下 1 ，2 一二羟基蒽醌、1 ，4 二羟基葸醌和l ，2 ，4 三羟基葸醌光解生成对e 坍 口2 f 6 妇毒性更大 的安香息酸化合物；2 羟基蒽醌和1 ，8 二羟基蒽醌通过光敏化作用生成活性氧，导致光 致毒性增大1 5 j 。然而不同取代基的蒽醌类化合物对水生生物的光致毒性的研究尚未见报 道。 1 2 环境中化合物的急性光致毒性 1 2 1 急性毒性及其评价方法 依据染毒期限的不同将毒性实验分为急性、亚慢性和慢性毒性实验。急性毒性是指 机体一次接触或一段时间内多次接触某一化合物所引起的毒性效应，包括死亡效应吼 其目的是确定化合物的致死剂量，评价化合物对机体的急性毒性的大小、毒性效应的特 征和剂量反应( 效应) 关系，并根据半数致死剂量进行急性毒性分级。另外，急性毒性研 究可为亚慢性、慢性毒性研究及其它毒性实验染毒剂量的设计和观察指标的选择提供依 据，为毒性作用机制研究提供线索。 反 应 图1 3 剂量坂应关系图 f i g 1 3r e l a i i o r i s h i p b e t w e e nd o s ea i l dr e s p o i l s e 生物体暴露于污染物之后，可能产生两种类型的反应：1 ) 质效应，效应不能用某 种测定的定量数值来表示，只能以“有或无”，“阴性或阳性”表示；2 ) 量效应，即 葸醌类化合物对大型搔( d 劝h 缸臃咿功急性光致毒性与q s a r 一定剂量外源化学物质与机体接触后引发的生物学变化，此种变化的程度大多可用计量 单位表示，如剂量效应关系和剂量反应关系。剂量效应关系，指不同剂量外源化学物 质与其在个体或群体中所引起的量效应大小之闻的相互关系；剂量反应关系指不同荆 量外源化学物质与其引起的效应发生率之间的关系。剂量效应关系和剂量- 反应关系曲 线有直线型、抛物线型和s 曲线型( 见图1 3 ) 。s 曲线型较为常见，即在低剂量范围内， 曲线开始平缓，继而陡峭，然后又平缓，呈不规则的s 形，曲线的中间部分，即反应率 5 0 左右，斜率最大，剂量略有变动，反应既有较大增减。因此，在化合物毒性评价中 选用反应率5 0 的点，即半数致死效应浓度犯c 5 们c 5 0 ) ，作为判断指标。 急性毒性实验的一般步骤为：设一定数量的剂量组，组问有适当的剂量间距，通过 实验得到化合物引起动物死亡的剂量反应关系并求得三c 5 以 c 5 0 ，然后根据上g 泄岛。 值评价化合物的毒性。可用任何一种公认的统计学方法计算三c 5 艘5 0 值及其9 5 的置 信区间，如概率单位法，霍恩氏( h o m ) 法，寇氏( k a r b e r ) 法，图解法，直接回归法等。其 中概率单位法具有简便、快捷等优点，常用于计算上c 5 0 嬲j o 值。 概率单位法求五c 5 0 的原理为当剂量对数与反应之间存在正态曲线关系，将该曲线转 化为标准正态分布曲线，以横轴表示标准正态离差( 们，当d 兰2 时，死亡率接近1 0 0 ；d 墨2 时，死亡率接近o 。为了消除标准正态离差的负号，将其值一律加5 ，称为概率单位。 经概率单位换算后的对数剂量反应关系可转化为直线关系，概率单位等于5 时对应的反 应即为e c 5 0 ，且该关系表示的死亡率处于l 到9 9 之间。l 猷5 0 的9 5 可信限为： l g e b o = 1 9 e c 5 0 1 9 6 & ， 一三 s 。= 手( 2 n ) 2 d ( 2 1 ) ( 2 2 ) 式中：6 为死亡率以概率单位表示时，死亡率与浓度对数拟合直线的斜率；为实验动 物总数。在使用概率单位法时，要求实验点分布在e 6 0 两侧，且剂量反应曲线呈对称 分布，因此对此方法的使用造成一定的局限性。 概率单位法计算e c 5 0 值时，转化成直线的对数剂量反应关系的斜率同时提供了毒 性作用机理方面的信剧删，直线的斜率反映了生物对化合物的吸收情况。图2 3 给出了 化合物a 和b 具有相同的e c 5 0 值，但是化合物a 的剂量反应曲线比b 陡峭。所以化 合物a 有很高的吸收速率，在狭窄的浓度范围内对生物的毒性效应迅速增加。相比较而 言，生物对化合物b 的吸收速率较低或解毒速率很高。 大连理工大学硕士学位论文 死 亡 窦 概 盥 苴 g l i 一 对数剂量 图2 3 具有相同五c 5 0 值的两种化合物的剂量反应关系图 f i g 2 3d o s er c s p o n s ef o rt w oc h e m i c a l saa n db w m lt 1 1 es 锄e j o 1 2 2 光致毒性的定义与化合物的光化学行为 生活在地球表面上的任何生物都离不开阳光，太阳为生物的生长提供能量，但也可 能对生物体产生毒害作用。除了可见光和红外线，阳光中还有紫外线，大约占到达地球 表面阳光总能量的4 。与u v a ( 3 2 0 4 0 0m ) 相比，u v b ( 2 9 0 3 2 0n m ) 是一种更高能 的射线，容易被生物的核酸和蛋白质吸收，丽产生直接光毒性。还有一些生命体外的化 学物质吸收可见光或近紫外光后，通过光化学反应产生间接光毒性【2 】。 根据光化学第一定律，只有被分子吸收的光才能引发光化学反应。因此，污染物的 光致毒性在很大程度上依赖于对光的吸收，化合物的吸收光谱和光源的发射光谱有重叠 时才可能发生光化学反应。一般认为化合物光致毒性的作用机理有两种：光修饰作用和 光敏化作用【1o 】。通常化合物吸收光子后性质比较活跃，能够参与化学反应生成新的物质， 而导致毒性增加或减少的现象称光修饰毒性。而化合物吸收光后，把能量或电子传递给 其它物质，化合物本身不发生变化，而导致毒性变化的现象称光敏化毒性。图1 - 3 描述 了化合物吸收光子后可能的物理化学变化。 化合物处于基态时，最外层电子位于分子最高占据轨道。这些电子一般被绘画成t ， 磁量子数为+ 1 2 ；或是l ，磁量子数1 2 。最外层的成对电子中的一个电子吸收一个光量 子后跃迁到激发态，跃迁后的电子旋转方向没有改变，自旋量子数的代数和s = 0 ，2 s + l = 1 ，因此称激发单线态。激发单线态的电子可能与氧发生化学反应，或回到基态辐射 荧光，或通过系间窜跃回到能量较低的激发态，并发生旋转方向的转变。经历系间窜跃 后，电子经历旋转方向的转变，导致激发的电子与剩余的基态电子有相同的旋转方向， 即2 s + 1 | 3 ，因此叫激发三线态。在环境光化学里，激发三线态是一个重要的临界态。 葸醌类化合物对大型潘( d 啐枷l f 口卅叼脚急性光致毒性与q s a r 与激发单线态类似，激发三线态的电子可能与氧发生化学反应，或回到基态辐射磷光。 但是，根据p a u l i 不相容原理，具有相同旋转方向的两个电子不能同时存在于个轨道。 因此，激发三线态的电子跃迁到基态是量子理论禁止的，所以，化合物的激发三线态( 约 1 0 一- 1 0 4 秒) 比激发单线态( 约1 0 母秒) 具有更长的寿命，这就解释了为什么磷光可以持续 很长的时间。激发三线态的长寿命提供了更多机会参与环境中的光化学反应，如光敏化 反应。光敏化是一种普遍发生的现象，化台物发生光敏化后可能生成活性氧，而活性氧 与生物的生命活动有着重要的联系。 光修饰作用 圈1 3 化合物的光化学过程 f i g 1 _ 3 p t t 砷d c h e l i c a l ”o c e s s 皓o f c h 咖i c a l s 目前，对p a h s 的光致毒性研究较多。由于p a h s 结构中含有共轭兀键，能够吸收 紫外光，发生系列物理化学反应，导致它们光照前后毒性有所改变。1 9 0 5 年j o d l b a 和t a p p e 协e r 首先发现了葸对草履虫有光致毒性，随后涌现出大量研究p a h s 对细菌、 甲壳类、鱼类和高等植物的光致毒性及其相关的q s a r 方面的文章。1 9 9 6 年加f s t e n 等 人详细总结了p a h s 对植物和动物的光致毒性【2 2 】。w 婀s 或是通过氧化反应生成其它物 质导致毒性的变化，或是通过产生单线态氧致毒。2 0 0 5 年m a t t l l i a sg m t e 等人研究了光 照条件对p a h s 光致毒性的影响，通过吸收光量子总量和实验测定的化合物相对光毒性 效应值来估计其毒性【2 3 】；m a i l a k i l l 等人通过比较化合物的电子云形状相似性分析蒽及其 氧化产物的光致毒性m j 。 大连理工大学硕士学位论文 1 2 3 光敏化与活性氧 在光化学反应中，有些化合物吸收光子后，自身不发生反应，而把能量转移给另一 种化合物，使之成为激发态参与反应，这样的反应称为光敏化反应。吸光的物质称为光 敏化剂，接受能量的化合物称为受体。光敏化作用有两种机理，分别是“类型i ”和“类 型n ”r 见图1 4 ) 。 根据h 1 1 1 1 d 规则，在同一亚层的各个能级中，电子的排布尽可能分占不同的能级， 而且自旋方向相同，这样能量最低。而分子氧的基态包含两个自旋方向相同且不成对的 电子，分别占据不同的轨道，呈现三线态，因此具有很高的活性。如图1 - 3 所示，光敏 化剂吸收光予从基态跃迁到激发单线态或通过系间窜跃转化为激发三线态。激发的光敏 化剂通过光敏化类型失去能量回到基态，氧得到能量转化成单线态氧，单线态氧与底 物反应生成产物。单线态氧具有高活性和生物破坏性，一般与最先接触的分子反应。此 外，光敏化类型i 是发生在空气颖粒物上的重要光化学反应( 图1 4 ) 。在这个反应里，激 发的光敏化剂( 单线态或三线态) 直接与底物或溶剂发生电子转移，使之成为自由基或自 由基离子，进而与氧反应生成加氧产物。 fh + ；告蝥懋烈型! ，单线态氧 子 底物单线态或三线态 。i 一 卜 图1 4 光敏化机制 f i g 1 4p h o t d s e i l s h i z a t j o nm e c h a n i s m s 光敏化是一种普遍发生的现象，光敏化反应通常会生成活性氧，活性氧具有生物破 坏性，与生物的生命活动有着正反两方面的影响【2 5 1 。活性氧是由氧形成的性质活泼的多 种物质总称，主要包括1 种激发态的氧分子，即单线态氧( 1 0 2 ) ；3 种含氧自由基，即超 氧阴离子自由基( 0 2 一) 、羟基自由基( o h ) 和氢过氧自由基( h 0 2 ) ；2 种过氧化物，即过氧 化氢( h 2 0 2 ) 和过氧化脂质( r o o h ) 以及一种含氮的氧化物( n 0 ) 等。这些物质化学反应活 性很强，但是存在的寿命很短，如1 0 2 的平均寿命为2u s ，o h 自由基为2 0 0 s ，0 2 ： 自由基为5s 。 鬻0 黝 自自 晚 加 葸醌类化合物对大型潘叩轴缸m 叼叻急性光致毒性与q s a r 正常生理条件下，机体内约有1 5 的氧分子代谢反应生成活性氧自由基，一方面 参加正常的生物化学反应，完成生理功能；另一方面杀伤入侵的微生物和肿瘤细胞。但 在缺氧或氧供应过多时，代谢产生活性氧自由基的数量超出了机体的清除能力，多余的 活性氧便会对生物机体产生伤害。近年来，人们越来越关注活性氧在人体内的作用，报 道了大量有关活性氧( 尤其是超氧自由基和羟基自由基) 对机体细胞的功能活动和各种疾 病( 如癌、动脉硬化、糖尿病、心脑血栓等) 作用方面的研究进展。目前，自由基生物学 和自由基医学已成为生物化学的一个重要研究领域【2 5 】。 羟基蒽醌是重要的光敏化剂，应用在医疗行业。葸醌类化合物吸收光子后，从基态 跃迁到激发单线态，而后通过系间窜跃转化成激发三线态( 见式1 2 ) ，呈激发三线态的分 子可能把激发能量传递给周围氧分子生成单线态氧( 见式1 3 ) ；激发三线态的分子或与周 围分子发生提氢反应生成半醌自由基( 见式1 4 ) ，然后半醌自由基发生系列反应生成氢过 氧自由基( 见式1 5 1 6 ) ；激发三线态的分子或与周围分子发生电子转移生成半醌阴离子 自由基和羟基自由基( 见式1 9 ) 【3 ，4 2 6 】。式1 7 和1 8 与1 1 0 和1 1 1 分别表示了半醌自由基 和半醌阴离子自由基还原成蒽醌类化合物的过程。 a q + 加_ 1 a q - + 3 a q + 3 a q + + 0 2 _ a q + 1 0 2 3 a q + + r h + a q h + r 。 r h + a q h 砭+ a q h 2 a q h 2 + 0 2 a q + h 2 0 2 2 a q h a q + a q h 2 a q h + o h a q 。+ h 2 0 3 a q + + o h ，a q 。+ h o a q + + h + + a q h 2 a q + _ a q 2 。+ a q 苟 筇 回 乃 劲 d q 0 0 0 0 0 o 0 l l 大连理工大学硕士学位论文 1 3 大型潘在生态毒理学中的应用 13 1 大型潘的生长与培养 大型滏( d 口砷n 妇卅口舶口) 属甲壳纲、鳃足亚纲的枝角类浮游生物【2 7 】，俗称水滢。国内 分布于南北各省，国外分布在北半球，温带南部及亚热带地区，生活在水草繁茂的富营 养型水域中，也可生活于含盐量较高的水体内。大型涵主要以藻类和细菌为食，成潘能 达到5 6 毫米，其生命周期包括四个阶段：卵、幼蚤、发育期和成熟期。大型涵的寿命 依赖其生长条件有很大的变化，如2 5o c 时平均寿命大约4 0 天，2 0o c 时大约5 6 天性。 一年中大多数时期，种群几乎完全是由雌性组成，循环单性繁殖，但在春天或秋天雄性 盛产，产率可达到5 6 。另外，环境温度的降低、种群密度的增高、代谢产物的累积和 食物的减少等都可能诱导母潘产生雌雄分化的卵，种群中出现雄性的大型涵。通常可以 通过大型涵的大小、第一触角的变化、后腹部判断大型滔的雌雄，成熟的雌性和雄性大 型潘的结构如下图1 5 所示。在化合物对大型潘的急性毒性实验中，一般选用单性繁殖 的雌性大型潘，尽量避免使用雄性幼搔。 雌性雄性 图1 5 大型淹生理结构 ( 1 ：喙；2 ：头f 部甲壳；3 ：第一触角；4 ：背部卵室边界) f i g1 5p h y s i o l o g i c a 】s t m t u r eo f d 印 n 抽卅g n 口( 1 ：b e a k 2 ：c a m p a c ee d g eb e l o wt h eh e a d 3 ：丘r s t a n t e n n a e 4 ：p o s t e r i o r b o u n d a r yo f t h eb r o o dc h a m b e r ) 实验室培养中，水质对于大型涵的生长是很重要的。大型潘可以在井水、地表水、 自来水和重组水罩诈常生长。无论用天然水还是人工合成水培养，都应确保水中不含有 蔓坚鲨鱼塑翌茎至堡雯翌堕竺! 壁1 2 墨堡垄塾量：壁兰q ! 坐 任何已知对大型溢有毒的物质，如氯、重金属、农药、多氯联苯等。口h 值、溶解氧、 温度、盐度和食物对湮类生长和繁殖情况的影响已有很多报道 2 9 _ 30 1 ，下面分别介绍大型 潘正常生长和繁殖的条件。 p h 值在6 8 之间都适合大型潘的生长，但实验前后p h 值变动要小于0 3 个单位p ”。 因此，实验室要定期检测水质的p h 值。 大型潘可以在个很宽的温度范围内生长，但突然的温度变化可能引起其死亡。最 佳培养温度在2 0 。c 左右，如果实验室周围温度保持在1 8 2 6n c 时，不用特殊的控温设 备大型潘也能正常生长和繁殖【”。 大型潘能在溶解氧较低( 3m u 的情况下存活，但实验室培养时推荐溶解氧维持在 5m l 或更高。除非培养太拥挤或过多的喂食，通常是不需要曝气的。 推荐培养大型滔用水的总硬度为1 6 0 1 8 0m u 以碳酸钙计算) 。大型渣生长需要光 照，光强在1 0 一2 0 肛e f m 2s ) 或5 0 1 0 0f t c 左右，光周期对大型湮的生长和繁殖没有显著的 影响，每天至少光照1 6h 【2 9 】。 喂以合适数量的食物对大型潘生长是极其重要的，既要提供充足的营养去维持正常 的繁殖，又不能加入过多的食物。过多的食物可能减少实验溶液的毒性，阻碍动物的过 滤器官，或减小溶解氧的浓度增加大型淹的死亡率。重组酵母和单细胞绿藻都能为大型 涵提供合适的营养。 推荐使用干净的玻璃容器培养大型潘，这样有利于观察水涵的活动。一般选用4l 的玻璃烧杯，盛装约3l 培养基，泽类密度为1l _ 培养基中放置不超过4 0 个水涵。容器上 应该覆盖干净的塑料片或玻璃盘，以防灰尘和污垢，减少蒸发。玻璃容器要定期刷洗， 培养基要定期更换，建议每周更换3 次新鲜的培养基。如果不能及时更换培养基，废物 堆积将引起种群的拥挤或雄性卵和或雌性卵的产生。下面以3l 痞器为例，说明更换培 养基的步骤【2 8 】： 1 将大约3 0 0m l 以前的培养基倒入一个暂时盛放的容器中； 2 使用大口吸管从以前的培养容器中，转移大约2 5 到3 0 个成涵到暂时存放的容器中： 3 丢弃培养容器中剩余的大型湮和培养基： 4 用去垢剂刷洗容器，然后用培养基清洗去除所有去垢剂的痕迹( 每周清洗一次) ： 5 向干净的容器中倒入新配制的培养基： 6 轻轻把暂时盛放容器中的溶液( 以前的培养基和大型潘) 转移到装有新配制培养基 的容器中，确保没有动物粘贴在容器壁上； 7 喂食。 大连理工大学硕士学位论文 使用大口吸管转移水潘时应注意水潘不能粘贴到吸管的壁上；转移到另一个容器中 时，吸管的尖保持在水面以下，以防潘类的甲壳进入空气。如果大型潘的甲壳进入空气， 它们就会漂浮在水面上无法进入水里而死亡。 1 3 2 大型洚在毒性实验中的应用 大型涵在水生食物链中占据重要地位，是一种国际通用的实验生物，具有容易实验 室培养、对污染物表现出高敏感性、生命周期短、适合慢性毒性实验等优点【3 2 】，在加拿 大和美国，污染物对大型滔的毒性是一个常规监测项目。目前，大型涵毒性实验按照时 间长短可分为：急性毒性实验( 2 4 、4 8 、7 2 、9 6h ) 、亚致死性毒性实验、慢性毒性实验( 1 4 、 2 1d ) ，更有研究人员从分子水平上探讨了污染物对大型潘毒作用机理。 大型潘的应用起始于1 9 2 8 年，美国科