（材料学专业论文）fe3o4sio2纳米复合固定化葡萄糖氧化酶及应用.pdf

武汉理工大学硕士毕业论文 摘要 光学生物敏感材料是光纤生物传感器中的关键组成部分。高性能的光学复 合敏感材料的制各是研制高性能光纤生物传感器的关键技术。目前报道的基于 酶催化的光纤生物传感器的敏感材料通常由光学敏感材料和生物酶两部分组 成，如果将光学指示剂和酶通过合适的技术组合在一起制成光学复合敏感材料， 可有效提高传感器的响应速度和检测精度，并可实现传感器的微型化，具有较 高的应用价值。人体血液中葡萄糖浓度的检测对人体健康监测和疾病早期诊断 十分重要，基于酶催化的光纤生物传感器是实现这类检测的有效手段之一，其 研究具有重要的理论意义和应用价值。 本文制备f e 3 0 4 s i 0 2 磁性纳米复合粒子( f s n p s ) ，并以此为基体材料固定葡 萄糖氧化酶( g o d ) ，所得到的固定化酶具有优良的特性。制备了同时含有固定 化酶和荧光指示剂的光学复合生物敏感材料，设计和构建了基于光学复合敏感 材料催化的光纤葡萄糖传感器，初步研究了传感器的性能。 本论文的主要工作包括以下几个方面： ( 1 ) 采用共沉淀法制备具有超顺磁性的f e 3 0 4 纳米粒子，粒径在1 5 r i m 左右； 通过溶胶一凝胶法制备形貌粒径单一的f s n p s 。对所得的粒子利用透射电镜，振 动样品磁强计进行表征。所得到的磁性纳米复合粒子平均粒径可达到6 0 8 0 n m 左右，接近超顺磁性，有良好的生物相容性。 ( 2 ) 以f s n p s 为载体通过交联法固定g o d ，研究硅烷化试剂a p t s 浓度、 戊二醛的浓度、最佳给酶量、酶固定化过程中的p h 值等因素对固定化酶活性 的影响；以葡萄糖为底物的固定化酶最佳使用温度为5 0 ，最佳使用p h 值为 7 ，如值为3 4 9 r a m ，与游离酶的相比增大。固定化酶具有较好的热稳定性、贮 存稳定性和操作稳定性。 ( 3 ) 制备了同时含有固定化酶和荧光指示剂的光学复合生物敏感材料，设计 和构建光纤葡萄糖传感器测试系统，初步研究表明t 传感器的检测范围为 1 0 f f - 6 0 0 m g d l ，响应时间为1 5 s 。 武汉理工大学硕士毕业论文 关键词：f e 3 0 4 s i 0 2 纳米复合粒子，固定化葡萄糖氧化酶，光学复合敏感材料， 光纤葡萄糖传感器 本文在国家自然科学基金项目( 批准号：6 0 8 7 7 0 4 8 ) 资助下完成。 n 武汉理工大学硕士毕业论文 a b s t r a c t b i o s e n s i n gm a t e r i a li sa ni m p o r t a n tp a r to ff i b e ro p t i cb i o s e n s o r t h er e s e a r c ho n o p t i c a lb i o s e n s i n gm a t e r i a l si s t h ek e yt e c h n o l o g yt od e v e l o pt h ef i b e ro p t i c b i o s e n s o r sw i t hg o o dp r o p e r t i e s t h er e p o r t e d s e n s i n gm a t e r i a l sf o rf i b e ro p t i c b i o s e n s o rb a s e do ne n z y m ec a t a l y s i su s u a l l yc o n s i s to ft w op a r t s ，o p t i c a ls e n s i n g p a r ta n dc a t a l y s i sp a r t i ft h e s et w op a r t sa r ec o m b i n e di n t oo n eu s i n ga na p p r o p r i a t e m e t h o dt of o r mt h eo p i t c a lc o m p l e xs e n s i n gm a t e r i a l s ，t h er e s p o n s em t ea n d d e t e c t i n gp r e c i s i o no ft h e s e n s o rc a nb e i m p r o v e dg r e a t l y , a n dt h e s e n s o r m i c r o m a t i o nw i l lp r o b a b l yb er e a l i z e d t h i sk i n do fw o r ki sv e r yi m p o r t a n tt ot h e a p p l i c a t i o no f f i b e ro p t i cs e n s o rb a s e do ne n z y m ec a t a l y s i s t h ed e t e c t i o no fg l u c o s e c o n c e n t r a t i o ni nb l o o di so fg r e a ts i g n i f i c a n c ef o rh u m a nh e a l t hm o n i t o r i n ga n de a r l y d i a g n o s i so fd i s e a s e s a m o n gt h ev a r i o u sd e t e c t i n gm e t h o d s ，f i b e ro p t i cb i o s e n s o r b a s e do ne n z y m ec a t a l y s i si sa ne f f e c t i v em e a n s t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ho l lt h i sk i n d o ff i b e ro p t i cb i o s e n s o ri so fg r e a tt h e o r ya n d a p p l i c a t i o ni m p o r t a n c e i nt h i st h e s i s ，t h em a g n e t i cf e 3 0 4 一s i 0 2n a n o p a r t i c l ec o m p o s i t e ( f s n p s ) w a s s u c c e s s f u l l yp r e p a r e da n du s e d 硒t h ec a r r i e rf o rg l u c o s eo x i d a s ei m m o b i l i z a t i o n , a n dt h ei m m o b i l i z e dg l u c o s eo x i d a s e 、) i ，i n lg o o dp r o p e r t i e sh a sb e e no b t a i n e d t h e o p t i c a lc o m p l e xb i o s e n s i n gm a t e r i a l sc o n t a i n i n gb o t hi m m o b i l i z e de n z y l n ea n d f l u o r e s c e n ti n d i c a t o rw e r ep r e p a r e d t h ef i b e ro p t i cg l u c o s es e n s o rb a s e do n c a t a l y t i ce n z y m ew a sd e s i g n e da n dc o n s t r u c t e d ，a n dt h ep r e l i m i n a r ys t u d yo ni t s p r o p e r t i e sh a sb e e np e r f o r m e d t h ew o r ko ft h i sp a p e ri n c l u d e sm a i n l yt h r e ep a r t sa sf o l l o w e d ： ( 1 ) f e 3 0 4n a n o p a r t i c l ew a sp r e p a r e db yg o - p r e c i p i t a t i o nm e t h o d 、i t l ls i z eo f 15 m a g o o dm o r p h o l o g ya n ds i n g l es i z ef s n p sw a sp r e p a r e db ys o l - g e l m e t h o d t h ec o m p o s i t ew e r ec h a r a c t e r i z e db yt e ma n dm o d e l4 i - fv s m t h en a n o p a r t i c l ec o m p o s i t ew i t ha na v e r a g es i z eo f6 0 8 0 n mi sa l m o s t s u p e r p a r a m a g n e t i ca n dh a sp r o m i s i n gb i o c o m p a t i b i l i t y ( 2 ) t h eg l u c o s eo x i d a s ew a si m m o b i l i z e do i lt h es u r f a c eo ft h ef s n p sb y c m s s l i n k i n gm e t h o d t h ee f f e c t so fs i l a n er e a g e n ta p t s ，g l u t a r a l d e h y d e 武汉理工大学硕士毕业论文 c o n c e n t r a t i o n , t h ep ho nc r o s s l i n k i n gp r o c e s sa n dt h ea m o u n to fg l u c o s e o x i d a s eo nt h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e d 口l z y l l l ew e r ei n v e s t i g a t e d a f t e r i m m o b i l i z a t i o n , t h eo p t i m u mp h ，t e m p e r a t u r ea n d o fi m m o b i l i z e d e n z y m ec a t a l y s eg l u c o s ew e r e7 ，5 0 。c a n d3 4 9 r e s p e c t i v e l y t h e i m m o b i l i z e dg l u c o s eo x i d a s eh a sab e t t e rs t a b i l i t i e si nt h e r m a l ，s t o r a g ea n d o p e r a t i o n ( 3 ) t h eo p t i c a lc o m p l e xb i o s e n s i n gm a t e r i a l sc o n t a i n i n gb o t hi m m o b i l i z e d e n z y m ea n df l u o r e s c e n ti n d i c a t o rw e r ep r e p a r e d t h ef i b e ro p t i cg l u c o s e s e n s o rt e s ts y s t e mw a sd e s i g n e da n df a b r i c a t e d ，t h ep r e l i m i n a r yr e s e a r c h r e s u l t ss h o wt h a ti t sd e t e c t i n gr a n g ei s10 0 - - 6 0 0m g d la n di t sr e s p o n s et i m e i sa b o u t1 5 s k e yw o r d s ：f c 3 0 4 s i 0 2n a n o c o m p o s i t e ，i m m o b i l i z e dg l u c o s eo x i d a s e ，o p t i c c o m p l e xs e n s i n gm a t e r i a l s ，f i b e ro p t i cg l u c o s eb i o s e n s o r t h i sw o r kw a sf i n a n c i a l l ys u p p o r t e db yn a t i o n a ln a t u r ef u n d a t i o no fc h i n a ( n o 6 0 8 7 7 0 4 8 ) i v 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特，l i j j n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：熟整日期：迦 q ：至：益 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保 留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 日期： 纠d f 沈 武汉理工大学硕士毕业论文 第1 章绪论 2 1 世纪是一个高度信息化的时代，早在2 0 世纪8 0 年代，世界就已经步入 了传感器时代，极大地推动了信息科学技术的全面发展。美国将传感器列为十 大技术之首，我国将传感器技术列为国家“八五重点科技攻关项目i l 】。传感 器技术的飞速发展和广泛的应用，在国民经济建设发展中起到了重要作用。生 物传感器是用生物活性材料( 如酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物膜 等) 与物理化学换能器相结合的一种交叉学科，是发展生物技术必不可少 的先进监控方法与检测方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法。 在未来2 l 世纪经济科学发展中，生物传感器技术在国民经济中的临床诊 断、工业控制、食品和药物分析( 包括生物药物研究开发) 、环境保护以 及生物技术、生物芯片等研究中有着广泛的应用前景，是介于信息和生物 技术之间的新增长点【2 】。 磁性复合粒子固定化酶技术是上世纪6 0 年代开始发展起来的一项新技术。 酶被固定化后，既能保持酶的催化活性又能克服游离酶的一些不足，显著提高 酶分子结构稳定性；能与反应物分开，有效地控制生产过程；能与产物有效分 离，可避免因热处理而使酶失活的步骤，大大简化生产工艺 3 1 。研制开发新型 优良的载体材料，以此载体材料在适当条件下固定化生物活性物质作为生物识 别元件是光纤生物传感器的一个重要研发内容。 1 1 光纤生物传感器简介 我们目前所处的时代是信息时代，传感器是获取各种信息的主要手段。在 国民经济众多行业中，多少年来一直大量使用电类传感器，但它们具有难以克 服的弊病，如检测精度不高，易受电磁场干扰，稳定性较差，尤其是在易燃易 爆场合，电类传感器容易引起安全事故而无法使用。这使电类传感器具有局限 性，难以满足国民经济和科技发展的新要求。光纤传感器作为新一代传感器， 能以高分辨率测量许多物理量、化学量和生物量。由于以光信号进入现场探测， 可实现现场非电测量，从本质上解决了传统电类传感器难以涉足的易燃易爆、 武汉理工大学硕士毕业论文 强电磁场场所的安全测量问题；可以安全、准确和有效地实现对各种环境尤其 是各种恶劣环境中有关物理量和化学量的检测，以及对复杂的生物环境中生物 待测物的检测。光纤传感技术的这些特点，可将传统的电类传感技术提升到一 个新水平，并使光纤传感器具有很大的市场需求。 1 1 1 光纤生物传感器的特点及分类 光纤生物传感器有其特有的特点： ( 1 ) 传输损耗小，检测范围广，灵敏度高，重复操作性好【4 】。 ( 2 ) 安全环保，结构微型化，不导电可用于生命体在线健康监测，机械 强度好不易折。 ( 3 ) 不同的化学试剂通过不同的载体固定化方法，可实现多种底物的检 测，使用灵活。 ( 4 ) 使用方便，只需有光源照射，成本低廉，且不需电类传感器中的参 比电极1 5 。 光纤生物传感器是生物传感器中的一个重要发展方向，其独特的优点已被 广泛地运用于生物传感技术，是当前国内外的研究热点。 光纤生物传感器根据其传感原理可分为两大类：一类是传光型传感器，另 一类是传感型传感器。在传光型传感器中，光纤仅作为传播光源的介质，对外 界信息的“感觉 是依靠其它的功能元件来完成的 6 1 。传感型光纤传感器是把 光纤作为敏感元件，对外界信息具有一种敏感能力和检测功能，把“传 和“感 合为一体的传感器。在此类传感器中，光纤不仅起传光作用，而且起调制器的 作用，目前在生物医学上应用的主要是传光型光纤传感裂丌。 1 1 2 光纤生物传感器的应用前景 光纤生物传感技术是生物学，光电子学，信息等多学科交叉的产物，具有 广泛的应用价值。光纤生物传感器由于探头固定的是生物活性物质，多次使用 后，其活性会不同程度的减弱，从而影响传感器的稳定性和重复操作性，限制 了生物传感器的市场化。因此在这方面的研究还有待加强和改进。即使现在技 术还未趋于成熟，但依然是国内外研究的热点，将来具有广泛的发展前景。 近年来人们在用于环境监测、食品安全、临床医学、基因检测等方面光纤生 2 武汉理工大学硕士毕业论文 物传感器进行了研究。例如，地下水、河水和湖水中皿硝酸盐含量的不断增加 给环境和人类带来严重的危害，一种检测水中亚硝酸盐浓度的光纤生物传感器， 将细胞色素c 们亚硝酸盐还原酶固定在具有可控孔径的玻璃微珠内，当亚硝酸盐 可逆的与酶的还原和氧化形式键合时，其反射光强将发生变化，由此可检测亚 硝酸盐的含量。传感器的响应时间小于l m i n ，检测下限为0 9 3 9 m ，并且可进行 连续监测。在食品安全检测方面，有光纤表面等离子共振( s p r ) 生物传感器，用 于检测食品中的葡萄糖球菌肠毒素b ( s e b ) 。传感器的敏感部分是一段侧面磨光 的单模光纤，并连接有金属薄层，其表面具有表面等离子层。光纤中传播的光 使表面等离子激发，当水作为相邻介质时，使表面等离子激发的波长大约为 8 1 0 n m 。该共振波长对与表面等离子及金属薄层相邻的介质折射率变化很敏感， 当待测物与固定在传感器表面的的生物分子识别体( 如抗体) 发生作用时，就 会引起其折射率的变化，从而引起共振波长的变化。该s p r 生物传感器检测的最 低浓度可达n g m l ，检测时间小于1 0 m i n 。 人们对用于临床医学检测的光纤生物传感器研究较多。有一种检测人唾液 中链球菌的光纤生物传感器，以溴酚蓝为指示剂，用溶胶凝胶法将其固定在一 段用化学刻蚀法除去包层的光纤上，构建了一种光纤消失波生物传感器，用来 检测人唾液中m u t a n s 链球菌活性。含胆碱磷脂是动物组织中常见的细胞组成部 分，在细胞的生理机能、结构和新陈代谢中起了重要的作用，对其检测具有重 要的临床意义，可诊断出肝病等多种疾病。 上述研究主要涉及环境监测、临床医学检测等领域，具有重要的意义和应 用价值，光纤生物传感器也表现出比传统电类传感器更大的优越性。但敏感膜 的性能易受水中氧的影响，其响应时间和重复性等性能还有待于提高，对敏感 膜的传感机理缺乏深入系统的研究，这是将来必须解决的问题。 光纤生物传感器中敏感材料的固定是技术关键，光纤传感敏感材料通常要 制备成光学敏感膜才能固定到光纤传感器的探头上，用于光纤传感器的敏感膜 具有膜薄、膜层多并且复杂等特点，尤其对于特殊环境中使用的光纤传感器更 是如此。所以，对敏感膜成膜技术的研究对于光纤传感器的研究和发展具有十 分重要的意义。现在研究较多的是采用溶胶一凝胶法直接包埋生物活性物质， 虽然简单方便易于制备，但有其局限性，长期稳定性差，传感器活力下降快【8 】。 采用纳米粒子固定生物活性物质可以解决这不足，因为纳米粒子比表面积 大，单位体积固定活性物质量多，通过化学手段使生物活性物质在纳米粒子表 3 武汉理工大学硕士毕业论文 面形成化学键，可大大提高光纤生物传感器的长期稳定性和操作稳定性，防止 因为物理包埋而产生的活性物质的泄漏，从而降低成本【9 】。尽管有些技术还尚 不成熟，但一些光纤生物传感器已经慢慢走向实用化，例如光纤温度传感器， 光纤压力传感器光纤生物膜层厚度传感器，光纤相干层析( o c t ) 传感器，光纤 葡萄糖传感器等。 虽然光纤生物传感器的发展历史短暂，但由于许多新的技术不断应用于其 中，各种技术难题正在逐步解决，光纤生物传感器在制造和应用上取得突破己 经成为必然。 1 1 3 光纤葡萄糖传感器的研究 人体内有关生物量的检测对人类疾病早期诊断和治疗意义重大。例如，人 体内血糖浓度就反映了新陈代谢水平正常与否。据国际糖尿病研究协会报道， 糖尿病已成为世界第五大疾病杀手，严重危害人们的生命健康。上世纪6 0 年代 初世界上诞生了第一台基于氧电极的葡萄糖传感器，人们开始了对葡萄糖检测 的广泛研究【l o l 。其中重点研究了传感器探头的传感膜的性质和检测手段并作出 改进。由于电类葡萄糖传感器是基于电化学反应，容易受外部电磁场环境干扰， 检测时要达到电化学平衡，反应速度慢。电信号微弱，限制了其使用范围。直 到上世纪八十年代随着光通讯技术的飞速发展，人们把注意力逐渐转向了响应 速度快、安全高效的光纤生物传感器的研制开发，人们进行了大量的研究，希 望将来能走向市场并逐步取代并淘汰电类生物传感器。 1 1 3 1 光纤葡萄糖传感器的原理及其分类 光纤葡萄糖传感器的催化原理是g o d 在氧气分子存在下和葡萄糖发生耗 氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，即： 葡萄糖+ 0 2 屿葡萄糖酸+ h 2 0 2( 1 1 ) 可以通过测定生成的h 2 0 2 量或者是氧气消耗量来间接得出底物的浓度。因 此，光纤葡萄糖传感器由于检测对象的不同分为两种： ( 1 ) 通过h 2 0 2 生成量来实现葡萄糖含量测定：利用g o d 催化氧化生成 h 2 0 2 ，h 2 0 2 和化学发光液作用而发光，通过光强的变换得出h 2 0 2 浓度，间接 4 武汉理工大学硕士毕业论文 得出底物葡萄糖浓度【1 2 】。 ( 2 ) 通过检测耗氧来测葡萄糖含量：由于分子氧对荧光指示剂有猝灭作用， 荧光强度的变化和氧气浓度有一定的对应关系，而氧气浓度和葡萄糖也是一一 对应关系，从而实现对底物葡萄糖浓度的测量。 1 1 3 2 光纤葡萄糖传感器研究进展 由于光纤传感技术的飞速发展，光纤葡萄糖传感器在很多领域得到了广泛 应用并发挥着重要作用。而光纤葡萄糖传感器的传感材料，传感器性能的检测 方法及检测精度的提高越来越引起人们的重视。各国研究者从不同角度对其进 行了大量的研究工作。 在氧敏感材料制备方面，人们开发了多种荧光指示剂，最突出的是钌的配 合物，因其有较高的荧光效率和稳定性而被普遍采用。在制各葡萄糖氧化酶膜 方面，通过物理包埋法将葡萄糖氧化酶固定在溶胶凝胶膜中，底物分子进入溶 胶一凝胶膜内和酶发生反应；曾嘉【1 3 】以壳聚糖微球为载体，通过戊二醛交联，与 酶发生化学键合，实现葡萄糖氧化酶的固定化。研究了固定化条件及固定化酶 的综合性能。用化学交联法固定化酶后，其热稳定性、储存稳定性和游离酶相 比明显提高。刘尔等【1 4 】以醋酸纤维素为载体，采用化学交联法制备了葡萄糖氧 化酶膜；x i a o j u nw u i l5 】等用溶胶凝胶技术固定葡萄糖氧化酶，采用钌的配合物 r u ( d p p ) 3 ( d s ) 2 作为荧光试剂制作敏感膜，从而实现对葡萄糖进行检测。 光纤葡萄糖传感器的检测手段随着技术发展一直在改进，最先开始采用的 是流动注射发光法，这种方法精度高、响应快、操作稳定性好，但是需要发光 液和辅助材料不能用于临床在体监测【l6 。后来人们开始利用荧光猝灭效应来监 测葡萄糖浓度，因为这种传感器可以将敏感材料直接固定在光纤探头，为将来 传感器微型化和实时在体监测打下了良好基础。 1 2 光纤传感敏感材料研究 1 2 1 无机光学敏感材料 无机光学敏感材料包括光纤材料、无机化合物光学敏感材料和光纤光栅材 武汉理工大学硕士毕业论文 料，它们都是由无机材料组成，具有响应快、制备简单、化学性能和机械性能 稳定等特点。光纤材料和无机化合物光学敏感材料是较早用于光纤传感领域的 材料。 1 2 1 1 光纤材料 自从6 0 年代人们认识到可以通过降低石英玻璃总衰耗而使其作为光通信介 质以来，人们对光纤的各种应用一直进行着艰辛的探索。到上世纪末，光纤不 但在通信、广播电视领域中应用，而且广泛应用于各种传感领域。用于制造光 纤的材料主要是无机材料，其中包括石英玻璃、红外玻璃、稀土元素玻璃与晶 体等。在光纤传感领域中，光纤除了用来传输光信号，光纤材料还可以用来作 为敏感材料。人们在传感用光纤材料的研究中，一般主要考虑其光敏性、光衰 减性能、折射率控制、成纤能力、机械强度、化学稳定性以及制造成本等【1 7 1 。 英国k t vg - r a t t a n 教授和他的课题组【1 8 】系统研究了e r 3 + 掺杂、e r 3 + 厂y b 3 + 共掺杂光纤的温度敏感特性。传感器的探头为1 0 m m 的掺杂光纤，并在其中写 有光栅，由激光二极管产生的激发光使掺杂离子产生荧光，其寿命与温度有较 好的对应关系。该传感器的检测温度最高可达8 5 0 0 c ，掺杂元素的含量和探头 长度对传感器的性能有显著的影响。 1 2 1 2 无机化合物光学敏感材料 无机化合物光学敏感材料是指其光学性能可随待测物浓度变化的无机化合 物、单组分和多组分无机光学敏感薄膜。戴珩等人【1 9 】将c o c l 2 作为指示剂固定 在多孔玻璃基体材料中，环境湿度的变化可使将c o c l 2 改变颜色，引起其吸收 光谱强度的变化，从而构建成光纤湿度传感器。该传感器响应时间较快，重复 性较好。s e k i m o t os 等人【2 0 】以氧化钨为基质的钯( p 帆，0 3 ) 或铂( n 厂0 3 ) 为敏感 材料，用硅树酯或溶胶凝胶法固定在一段去除包层的光纤上即形成传感器探 头。敏感材料为黄绿色，当有氢气存在时可将其还原成蓝色的钨青铜( 其中钯或 铂作为催化剂) ，其介电常数发生变化，可观察到较强的消逝波吸收，探头吸收 光强度的变化与氢气的浓度有较好的对应关系。该传感器可实现对氢气的多点 分布式测量。 6 武汉理工大学硕士毕业论文 1 2 2 有机光学敏感材料 由于有机化合物种类繁多，易于进行化学修饰而使其具有所需要的性能， 故有机光学敏感材料是组成光纤传感器的一大类具有广泛和重要应用的光学敏 感材料。通常光学敏感材料由指示剂和基体材料两部分组成，指示剂与待测物 质作用而使其光学性能发生变化是决定光纤传感器性能的主体，基体材料可与 敏感材料形成光纤传感敏感膜，起着固定指示剂的作用，对传感器的性能也起 着重要的影响作用。 1 2 2 1 指示剂敏感材料 指示剂敏感材料是指直接用指示剂与待测物质作用，引起探头光学性能变 化，以达到检测的目的。由此组成的光纤传感器具有制备简单、响应速度快等 特点，人们对这类传感器进行了研究。欧国荣，陈奇洲等人【2 1 】以溴白里酚蓝为 指示剂，设计开发了一个光纤气敏传感检测系统，可用于大气及水质环境中 n i - 1 3 m r 的检测。其探头结构采用溴白里酚蓝+ 氯化铵内充液型，整个系统体 积小，性能稳定，对水中n h 4 + 的检测限为2 1 u n o l l 。一氧化氮是生物体内的一 种重要的信使分子和效应分子。周宜开等人瞄】以鲁米诺( i ，l 蛐i n 0 1 ) 为指示剂，用 塑料光纤将发光体系和发光仪的检测系统连接起来，发光体系由鲁米诺 ( l u m i n 0 1 ) 、过氧化氢和碳酸盐缓冲溶液组成，在最佳条件下，n o 浓度与相对 发光强度之间有良好的线性关系，其线性范围为8 5 x 1 0 1 2 i n o l l 至 1 7 1 0 一o m o l l ，检出限为1 7 1 0 以2 m o l l ，响应时间为3 s 。为研制用于生物体 内n o 的检测的光纤传感器打下了基础。 1 2 3 有机一无机光学敏感材料 有机无机纳米复合敏感材料是有机物和无机物按一定方式在纳米尺度上 进行复合，有可能兼顾两者的优点，获得具有所需性能的纳米复合敏感材料。 用于光纤传感器的光学敏感材料需要具有对待测物质的优异敏感性能，如快速 的响应性、较好的重复性和稳定性、高度的选择性等，这也要求复合材料的两 相( 有机相和无机相) 以很小的尺度进行高度均匀的混和，即形成有机无机纳 米复合敏感材料。 这类敏感材料的特点是：( 1 ) 与传统的复合材料不同，有机物分子与无机 7 武汉理工大学硕士毕业论文 物分子之间具有较强的相互作用，使材料同时具有有机物和无机物的优良特性。 ( 2 ) 由于复合过程一般在液相进行，有机物与无机物之间混合相当均匀，可制 备相当均匀的复合材料，这对控制材料的性能至关重要。( 3 ) 可以严格控制产 物材料的成分，在分子水平上进行设计，从而可制得一些传统方法难以获得或 根本得不到的材料。( 4 ) 可制取高纯度的材料，从而可满足一些特殊要求。由 于有机无机纳米复合材料具有诸多优点，所以有机无机纳米复合技术发展很 快，已经广泛用于材料研究中的许多领域，如结构材料、光学材料、涂膜材料、 自组装材料、超分子材料、电磁流变液材料等。近年来，人们已开始对用于光 纤传感器的有机无机纳米复合光学敏感材料进行了研究。 1 2 3 1 无机基质一有机指示剂敏感材料 这类敏感膜中的无机相主要是溶胶凝胶基质，采用硅酸乙酯为前驱体，在 少量酸( 或碱) 的催化下，与无水乙醇脱水缩聚、陈化，由溶胶转化为凝胶。 由于溶胶凝胶具有其独特的优点，如它与许多有机和无机试剂相容，可用于固 定各种试剂；化学、光学、热力学及机械稳定性好，适用于严酷条件下使用； 光学透明( 至2 5 0 r i m ) ，有利于吸收光或荧光测量；在低温和温和的化学条件下 形成，可包埋热稳定性和化学稳定性差的分子( 如蛋白质) ；有的被包埋试剂比 其在溶液中寿命要长，等等，故这类敏感膜在光纤化学传感器和光纤生物传感 器中具有重要的应用。 溶胶凝胶敏感膜在检测气体方面具有较好的效果。用于检测氧气或二氧化 氮的溶胶凝胶光学敏感膜主要是基于荧光( 磷光) 猝灭原理，通过检测其荧光 ( 磷光) 强度或寿命的变化来检测气态氧、溶解氧和二氧化氮的浓度。指示剂 主要采用钌的配合物。由于荧光寿命是指示剂的本征值，不受外界因素的影响， 故通过检测荧光寿命来实现对待测物的检测可使传感器具有较好的抗干扰能 力。m c d o n s g hc 等人1 2 3 1 制备了以钉的配合物r u ( p h 2 p h e n ) 3 c h 为指示剂的溶胶 凝胶氧敏感膜，研究了水前驱体摩尔比对溶胶凝胶膜微结构和传感器性能的 影响。c h a r tm a 等人刚以四碘荧光素b 为指示剂，制成溶胶凝胶敏感膜，与 基于过渡金属配合物的光纤氧传感器相比，在室温下和溶胶凝胶中，四碘荧光 素b 具有更长的磷光寿命更高的磷光量子产率，故此传感器具有更好的敏感性 能。s h e i l aa g r a n t 等人1 2 5 j 以钌的配合物 r u ( b p y ) 3 c 1 3 为指示剂，并制成溶胶 凝胶敏感膜，通过检测敏感膜荧光和参考光之间的相移变化来检测n 0 2 气体浓 8 武汉理工大学硕士毕业论文 度。检测下限达到5 0 p p m ，响应时间为1 5 s 。 综上所述，无机基质有机指示剂敏感膜具有其独特的优点，在光纤化学传 感器中具有重要的应用，但还存在问题，如制备敏感膜的溶胶凝胶体系单一， 敏感膜易出现裂纹，在溶液中使用时指示剂易从敏感膜中泄漏等。这些问题都 会对传感器的性能产生不利的影响，必须对溶胶凝胶成膜体系进行组分设计和 优化，探索和研究出性能优异的溶胶凝胶敏感膜体系，改进和优化敏感膜的制 备工艺，从而有效解决敏感膜易出现裂纹和指示剂泄漏等问题，研制出高性能 的溶胶凝胶光纤敏感膜。 1 3葡萄糖氧化酶的性质及其固定化研究 葡萄糖氧化酶( g o d ) 能够在有氧环境中催化葡萄糖生成过氧化氢( h 2 0 2 ) 及葡萄糖酸。生物体内有丰富而大量的g o d ，调节生命体的糖代谢反应。g o d 主要来源于青霉和黑曲霉菌株。g o d 广泛应用于医疗健康、食品保鲜、饲料添 加剂行业，主要有去糖脱氧、杀菌、催肥等功效。人类在十八世纪末就已经发 现了g o d ，但由于当时人类认知水平和生产力发展有限，g o d 并没有得到足 够的重视。直到发现g o d 2 0 年后，人们从黑曲霉中提取了g o d ，并详细研究 了其酶学性质和催化原理，才正式的将g o d 推向市场化。中国在早在1 9 7 0 年 就成立g o d 研究小组，做了大量翔实而宝贵的科研工作。现在各个国家对g o d 的综合性能研究已经取得了巨大成果，已经成功将其推向市场应用阶段。 1 3 1g o d 的酶学性质 g o d 晶体在低温下呈现淡黄色，无气味，易溶于水。不溶于氯仿、甘油等 有机溶剂，分子量在l5 个单位左右。g o d 在紫外照射下无荧光激发，最大吸 收波长在4 0 0 r i m 左右，在偏酸性环境下易于储存，最佳催化p h = 6 ，过酸或过 碱环境下都会使其不同程度失活闭。g o d 最佳使用温度在5 0 左右，在2 0 下可长时间稳定储存。 9 武汉理工大学硕士毕业论文 1 3 2g o d 的催化机理 g o d 通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统。g o d 在氧分子环境中氧 化葡萄糖生成葡萄糖酯，同时耗氧生成h 2 0 2 。过氧化氢酶将h 2 0 2 分解生成h 2 0 和0 2 ，然后h 2 0 和葡萄糖酯反应生成葡萄糖酸。g o d 主要功效是催化葡萄糖 氧化。每克g o d 在有过氧化氢酶存在和不存在的条件下分别消耗1 克原子氧 和1 克分子氧 2 7 1 。g o d 对葡萄糖有很强的催化选择性，底物分子上的羟基对 g o d 的催化选择起关键作用，结构稍有改变就会对其催化反应有影响。 1 3 3g o d 的应用 由于g o d 的耗氧和能生成特殊产物作用使其在食品保鲜、饲料添加剂、医 疗健康等领域应用十分广泛。 1 3 3 1在食品保鲜中的应用 g o d 在食品领域具有广泛的应用价值，例如在酿酒中通过添加葡萄糖氧化 酶可将葡萄糖氧化成葡萄糖酯，消耗啤酒中的氧，可防止啤酒因为氧气的存在 而氧化变质，同时可抑制耗氧微生物的繁殖。g o d 在耗氧的同时又生成了过氧 化氢，过氧化氢可以直接杀死有害细菌，延长酿酒保质期，由于g o d 催化反 应的特异性，又不会和酒中其他物质发生反应，对酒的风味没有影响，反而提 高了酒的品质。g o d 在酿酒保鲜中的这一原理被广泛的应用到其他食品行业 中，比如海产虾蟹、牛奶饮料、蔬菜瓜果等【2 8 】。g o d 还可以用在面粉中，提高 面粉韧性，提高面团延展性，增大面包体积，可取代对人体有致癌作用的溴酸 钾k b r 0 4 。在面粉储存过程中，葡萄糖会使面粉发生“褐变”，加入适量的g o d 可以有效的解决此问题，提高食品质量【2 9 】。 1 3 3 2 在饲料添加剂中的应用 g o d 可以作为饲料添加剂用于牲畜疾病防疫以及催肥。由于g o d 在生物 体内氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，当过氧化氢积聚到一定浓度时，能 迅速杀灭牲畜肠道里葡萄球菌、产气夹膜梭菌、韦荣氏菌、假单孢菌等有害菌 体，提高牲畜免疫力和抵抗力【3 0 】。其作用不像抗生素一样会产生药物残留和赖 药性。g o d 发生催化反应时会消耗生物肠道内的氧，生成葡萄糖酸，为乳酸菌 1 0 武汉理工大学硕士毕业论文 的成长提供酸性环境；由于氧气被消耗使肠道形成种厌氧环境，利于培育有 益菌体比如双歧杆菌等厌氧菌群。大量有益菌群在牲畜体内繁殖，提高了生物 体巨噬细胞活性，排出体内毒素，利于牲畜的生长和催肥。g o d 是一种新型高 效的酶饲料添加剂【3 1 1 。 1 3 3 3 在医疗健康领域中的应用 在医疗行业中，通常将g o d 制成试剂盒或者试纸的形式用于血清，尿液 或脑液中葡萄糖的体外定量分析。这种试剂盒简单方便，成本低而效果好，早 已面向市场化圈。g o d 还被用于防治口腔疾病，缓解龋齿和牙菌斑的产生，还 可以用来治疗伤口 3 3 】。 1 4 酶的固定化方法研究 1 4 1 酶与固定化酶的特点 酶( e n z y m e ) ，是生物体产生的具有生命调节能力的蛋白质，它与人类健康 息息相关，人体中各种代谢反应都离不开酶的积极参与。所有的酶都是高分子 的蛋白质，酶效力的发挥对环境要求很高，过酸或过碱，温度过高或过低都会 使酶失去活性。酶是由各种氨基酸通过肽键连接而成，在这种复杂的结果中即 使有微小的改变都能使酶活力降低或彻底失活【3 4 】。游离酶的使用对环境要求苛 刻易受干扰，容易失活且不容易回收的特点使其市场应用方面存在着很大的局 限性。因此，采用适当的手段将游离酶固定在载体上制成固定化酶成为了国内 外研究重点。固定化酶与游离酶相比有以下几个优点： ( 1 ) 产物溶液中没有游离酶的残余，简化提纯工艺； ( 2 ) 易将固定化酶与底物以及产物分开； ( 3 ) 酶促反应过程可以加以严格控制； ( 4 ) 可重复多次使用，大大降低成本； ( 5 ) 具有较好的长期稳定性，使用环境宽松。 武汉理工大学硕士毕业论文 1 4 2 酶的固定化方法 固定化酶是光纤生物传感器的重要组成部分也是关键技术之一，对其性能 有着直接的影响。酶的固定化是指采用特定的材料作为载体，通过物理或化学 的手段将酶吸附包埋或者共价交联到载体上形成一种稳定的结构，不改变游离 酶的催化活性，可多次回收重复利用的技术方法。酶分子之间通过外力聚集在 一起也叫固定化酶，属于无载体固定化酶【3 5 1 。现今研究较热门的是有载体的固 定化酶，通过研究不同的固定化方法将酶固定在载体上，得出不同催化效果的 固定化酶。现今国内外研究较多的固定化方法主要有以下几类【3 6 】： ( 1 ) 物理吸附法：主要是酶分子和载体之间通过库伦力相结合，主要是以吸 附的方式固定，因此酶的活性得到了保护，但是固定化酶使用的稳定性不高， 容易在使用中由于外力酶分子和载体脱落。物理吸附法载体一般选择有较大表 面能的基体，比如具有大比表面积的纳米粒子，活性炭，硅胶等。 ( 2 ) 包埋法：包埋法是将酶分子整个包进基体中，不改变酶分子结构，酶能 稳定存在于基体中不被泄漏出来，而底物分子能自由进出基体和酶分子接触而 反应，生成的产物通过孔洞排出。包埋法属于物理方法固定化酶中的一种，没 有改变酶分子构象，从而使酶活力得到保护。但是由于底物分子和酶不直接接 触，且反应生成的产物也不容易排出，具有一定的局限性【3 7 1 。 ( 3 ) 共价交联法：这是一种通过化学手段固定化酶的方法，是目前比较热门 的研究方向。主要通过一些带有两个相同功能基团的双功能交联剂( 比如戊二醛) 起作用。双功能试剂的一个基团和酶反应，另一个基团和载体直接交联，通过 这样的交联剂将酶分子和载体用化学键稳定的结合。共价交联法最显著的优点 是，酶被固定化后其储存稳定性、操作稳定性、热稳定性等大大增强，且对催 化环境的要求变得宽松，其催化过程不易受外界环境改变影响。共价交联法载 体主要有纳米粒子、多孔玻璃、壳聚糖等。其缺点是：固定化过程较繁琐，酶 固定化后由于空间构象有所改变从而使酶发生部分失活，导致酶活回收率不高。 ( 4 ) 离子结合法：此法选用的载体是具有离子交换基团的非水溶性基体。要 有聚电解质如离子交换树脂等，常见的有高分子衍生物类基体。离子结合法制 备简单，过程可控，酶结构没有发生改变，酶活性得到保护【3 引，但是和吸附法 一样是依靠物理的库伦力相互作用，容易在机械外力作用下使酶脱落，影响固 定化酶稳定性。 武汉理工大学硕士毕业论文 以上为比较常见的几种固定化酶方法，由于固定化机理不同，所以制备有 难有易，效果也各不相同。在实际固定过程中，要根据自己固定化酶的目的和 酶种类的不同来选择固定化方案。 1 5 选题的目的，意义与主要研究内容 1 5 1 选题的目的和意义 检测人体内有关生物量对于人类疾病的早期诊断与治疗十分重要。血糖是 衡量新陈代谢水平的重要指标之一，血糖超标将直接加大糖尿病发病率。对人 体内有关生物量的检测手段通常有实验室分析、仪器分析、电化学生物传感器、 放射性免疫检测等。但实验室分析和仪器分析耗时长、成本高、电化学生物传 感器响应慢、安全性和精度低，放射性免疫检测会造成污染，给人体带来潜在 的危害。尤其是上述手段均无法实现对人体内有关生物量的在线检测，因而无 法获得人体的准确生理信息【3 9 】。光纤生物传感器具有独特的优点，是检测葡萄 糖的有效手段之一。光纤生物敏感材料是光纤生物传感器的关键组成部分，其 研究对于提高传感器的性能具有十分重要的意义。 目前基于酶催化的光纤生物传感器的敏感材料主要由分离的酶膜和光敏膜 两部分组成，酶催化效应需通过长距离扩散到达光敏膜，造成传感器响应慢、 精度低、稳定性差的问题，本文提出制各同时含有生物酶和光