结核分枝杆菌基因组学.ppt

结核分枝杆菌基因组学,黄海荣,国家结核病参比实验室,提纲一、结核分枝杆菌基因组总论二、目前一些相关实验室技术的遗传学背景1基因分型技术2耐药的分子生物学诊断3新近的新疫苗、免疫诊断技术,Mapsofotherspp.nearlyidentical,MoreThan4,000genes,GenomeofM.tuberculosis,Coleetal.(1998)Nature393:537-544,TheStructureofDNA,Figure1.SchematicdiagramofsequencingstrategyusedbythepubliclyfundedHumanGenomeProject.TheDNAwascutinto150Mbfragmentsandarrangedintooverlappingcontiguousfragments.Thesecontigswerecutintosmallerpiecesandsequencedcompletely.,Figure2.SchematicdiagramofsequencingstrategyusedbyCelera.TheDNAwascutintosmallpiecesandsequencedcompletely.Thesefragmentswereorganizedintocontigsbasedonoverlappingsequences.,结核分枝杆菌的基本特征,H37Rv的全基因组由4411529个碱基组成，大约包括4000个基因，GC含量高达65.6%，表明结核分枝杆菌蛋白质在氨基酸组成上存在偏向性。H37Rv基因组中基因分布密度是平均1.1Kb长度有一个基因，这一数值与大多数原核生物的基因密度接近。与其他快生长的细菌如枯草杆菌不同的是：H37Rv基因方向没有明显的偏向性，59%的基因转录方向与复制叉移动方向相同，而这一数值在枯草杆菌为75%。,在H37Rv基因组中已发现约4000个开放阅读框，约占细菌编码能力的91。通过数据比较，现已确定了约40%的结核杆菌蛋白的功能；另有44%的蛋白与其他蛋白有相似性或可以获得其功能相关信息；剩余的16%的蛋白与其他已知蛋白没有相似性，可能是分枝杆菌特有的功能蛋白。,为什么要研究基因功能?更好的了解疾病的发病机制开发新型的更为有效的治疗措施开发或改良疫苗,Howtofindfunction?,ConservedAspandGluresidues,1.Multiplesequencealignment,2.“Unknowns”,Rv2874(DsbD)EMdomain,Rv1347cacyltransferase,Pa2754=Rv1720c,Pa2307=Rv3735,Pa1218=Rv0820,Rv2238cAhpE,Whatisanoperon?Anoperonisasetofgenesthatare:locatedonthesameDNAstrandcodedinthesamedirectionadjacenttooneanothertranscribed/expressedtogetherWhypredictoperons?Knowingtheoperonsofagenomehelpsresearchersbetterunderstanditsorganization.Ifresearchersknowhowoneofthegenesintheoperonfunctions,theycanbeconfidentthattheothergenesintheoperonfunctioninasimilarmanner.AbetterunderstandingoftheM.tuberculosisgenomewillleadtobettertreatment.,M.tuberculosisgenomesequence,常用的基因分型技术的遗传学背景,RFLPSpolgotypingMIRU-VNTR,基因组中的重要的结构序列-重复序列,结核杆菌基因组中存在重要的重复序列:插入序列(insertionsequence,IS)，以及分枝杆菌分散重复序列(mycobacterialinterspersedrepetitiveunit,MIRU),直接重复序列(Directrepeat,DR)。,IS6110RFLPDNAfingerprinting,IS6110属于IS3家族。IS6110是结核杆菌基因组中最常见的IS序列，也是目前研究比较清楚的IS序列。在不同株细菌中，IS6110的拷贝数变化很大，从0个到超过25个，这种差别是利用IS6110进行菌型鉴定的基础。,根据结核分枝杆菌基因组中存在插入序列IS6110的数目和位置不同，利用限制性内切酶切割IS6110上相应位点并电泳分离，可以得到类似指纹（Fingerprinting）样的特征性条带，这些条带被称为IS6110RFLPDNA指纹，该项技术为研究结核分枝杆菌基因分型奠定了基础。,ChromosomeofMycobacteriumtuberculosisHypotheticalStrainXandGenotypingofM.bovisBacilleCalmetteGurin(BCG),theM.tuberculosisLaboratoryStrainH37Rv,andStrainXontheBasisofIS6110InsertionSequencesandMycobacterialInterspersedRepetitiveUnits(MIRUs).,MycobacteriumtuberculosisIS6110RFLPDNAFingerprinting,Spoligotyping,Spoligotyping的方法是根据在结核分枝杆菌中存在直接重复区域（DirectRepeatDR区），DR区间的寡核苷酸序列呈多态性而构建的。,具体方法为：采用PCR的方法扩增结核分枝杆菌基因组DNADR间隔区，引物为DRa:5-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3,DRb:5-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3。且DRa5末端标记有生物素。PCR产物与已知固定在膜上的43个DR间隔区进行杂交，通过增强化学发光试剂盒进行检测。,Spoligotyping,TheDRlocuspolymorphism:(vanEmbdenetal.),M.canettii,M.microti,M.bovis,M.tub.,IS1096,40,47,?,Beijing,TheDRlocusconsistsinaseriesofmotifs(arepeatandauniquesequence)ItchangesbydeletionofrepeatsandbyinsertionofISelementsParticularpatternsconstitutesignaturesforgeneticgroups,MycobacteriumtuberculosisSpoligotypingGenotype,Variablenumbertandemrepeat(VNTR),分散的重复单位(MIRU)是位于基因间的一种特殊的分散重复序列，根据序列、组成和长度在46到101bp这些情况可将MIRU分为3种。结核杆菌H37Rv基因组中有65个拷贝的MIRU，分布于41个位点，主要位于操纵子的基因之间。MIRU可以以连续重复的形式在不同种细菌中存在不同的拷贝数，由此被用来进行菌型鉴定。,每个特定的VNTR位点由两部分组成，即中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有至少一个以上称为重复单元的短序列，一般该重复单元的碱基对数目不变，而串联在一起的重复单元的数目是可变的。,ChromosomeofMycobacteriumtuberculosisHypotheticalStrainXandGenotypingofM.bovisBacilleCalmetteGurin(BCG),theM.tuberculosisLaboratoryStrainH37Rv,andStrainXontheBasisofIS6110InsertionSequencesandMycobacterialInterspersedRepetitiveUnits(MIRUs).,Jinghua2_1(ETRA),1000500200100,ETRA_75bp_397bp_3U,1000500400200100,3U,2U,3U,3U,4U,5U,新型疫苗、免疫学诊断ESAT-6CFP-10新型疫苗ELISPOTT-SPOT,差异区域（Regionsofdifference，RDs）/缺失区域（deletedregions）,与分枝杆菌的抗原变异有密切关系。RD1是惟一的在BCG不同类型的菌株和田鼠分枝杆菌中都发生缺失，而在致病性的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中都存在的缺失区域,它是目前发现的惟一的具有上述特点的DNA片段。,实线代表基因未发生缺失，虚线代表基因发生了缺失。RD1两侧的虚线代表基因未列出。由上至下列出的细菌分别为结核分枝杆菌H37Rv，牛分枝杆菌BCG，田鼠分枝杆菌OV254，结核分枝杆菌Tb56和牛分枝杆菌AF2122/97。,几种分枝杆菌中RD1的缺失情况,RD1长9.455bp，虽然目前已有较多的关于RD1的报道，但对于这一序列的真实功能还属未知，甚至对于这一段序列包含多少个基因也还未有定论。一般认为，RD1可能共包括11个基因，即从Rv3866到Rv3879c间的基因片段，包括Rv3867、Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3871、PE35、PPE68、esxB、esxA、Rv3876、Rv3877，其中esxB（Rv3874）和esxA（Rv3875）编码的两个蛋白CFP-10和ESAT6目前正倍受关注。,CFP-10（Culturefiltrateprotein）又称结核杆菌培养滤液蛋白，而Esat6（Earlysecretedantigentarget）又叫早期分泌抗原，这两种蛋白是细菌早期分泌的强T细胞抗原，近来已被应用作结核病早期诊断的指标。esxB和esxA两个基因存在于同一操纵子内，被共同转录，它们的产物被共同分泌，最终以1:1的比例共同起作用。在RD1区与这两个编码基因相邻的其他基因，业已被证明组成了一个分泌系统。,GrowthinC57BL6mice,TBTBRD1BCG,CurrentthoughtsonH37RvRD1,Attenuationmutantre-createdMutantmakeslessantigens,yetgrowthimpairedThebacteriathatmakesmoreantigenicproteinsgrowsbetterinthehost!,耐药的分子生物学检测方法,HAINTestGeneChips/Microarray,结核分枝杆菌耐药相关基因1异烟肼:katG基因、inhA、ahpc基因、oxyR基因2利福平：rpoB基因3链霉素：rpsL基因、rrs基因4吡嗪酰胺：pncA5乙胺丁醇：embCAB操纵子6喹诺酮类：GyrA和GyrB,其他抗结核药耐药相关基因卡那霉素和卷曲霉素的作用机制类似于链霉素，都是通过作用于16SrRNA改变核糖体结构，抑制蛋白合成。在rrs基因1400位碱基突变与高水平的卡那霉素耐药有关。卡那霉素和卷曲霉素或紫霉素之间存在交叉耐药。环丝氨酸的杀菌机制是通过抑制D丙氨酸消旋酶和D丙氨酸：丙氨酸合成酶的活性抑制肽糖苷的合成。D丙氨酸消旋酶的编码基因是alrA，耻垢分枝杆菌的alrA已被克隆。当在耻垢分枝杆菌和BCG中用多拷贝载体表达alrA时会产生环丝氨酸耐药。研究已发现耻垢分枝杆菌中alrA启动子突变会引起环丝氨酸耐药。乙硫异烟胺在结构上与INH类似，可能其作用靶位也是分枝菌酸合成。InhA突变可以导致乙硫异烟胺与INH交叉耐药，但肯定还有其他基因参与乙硫异烟胺耐药的发生，过氧化物过氧化氢酶的突变在乙硫异烟胺耐药中并不起作用。,（1）灵敏度：研究试剂检出阳性的样本占对比试剂检出阳性样本总数的比例。（2）特异度：研究试剂检出阴性的样本占对比试剂检出阴性样本总数的比例。（3）阳性预期值（PPV）：研究试剂检出为真阳性结果的样本占总检出阳性样本的比例。（4）阴性预期值（NPV）：研究试剂检出为真阴性结果的样本占总检出阴性样本的比例。,判断一种诊断方法优劣的几项常用指标,GenomeProteomeTranscriptomeVaccinomeImmunome,后基因组时代,结语结核杆菌全基因组序列的阐明及其详细的生物信息学分析，为人类提供了大量的信息，对于阐明结核分枝杆菌的独特的生物学特点非常有价值。基因组学的研究成果必将深化人类对结核病新型治疗和预防措施的研究。,谢谢！,自然突变在不同的药物发生率不同:异烟肼（isoniazid，INH）为3.610-6、利福平