（环境工程专业论文）挺水植物根际微生物生态研究.pdf

摘要 挺水植物是水生生态系统的一个重要组成部分，研究表明植物不仅能够通过 吸收作用去除氮、磷等污染物，还能够富集重金属，此外，植物根系还可以分泌 物质为根际微生物提供营养，从而降解有机物。本课题通过现场采样调查和实验 室模拟对挺水植物根系微生物生态进行研究。 ( 1 ) 现场采样调查研究。以天津大学两个相邻的湖泊( 青年湖和爱晚湖， 其中青年湖中芦苇和香蒲各自生长，爱晚湖中这两种植物混合生长) 为现场，研 究植物种类和生长方式对植物根际微生物生态的影响，以及对植物根系分泌物成 分的影响。磷脂脂肪酸的分析结果表明，根际微生物数量明显地高于非根际；香 蒲根际微生物数量和多样性指数均大于芦苇，说明香蒲的根际效应较芦苇明显。 挺水植物根系能够分泌氨基酸、有机酸、糖类及脂肪酸、酚酸、芳香酸、酚类、 酯类、胺类等物质，不同植物分泌的种类和数量都不尽相同，同种植物在不同的 生长状况下分泌的物质也都不相同；青年湖芦苇分泌的物质种类最多，且酸类物 质的种类也最多，这与其有机碳含量较高相吻合；爱晚湖中香蒲和芦苇分泌的有 机酸及氨基酸的组成和数量差别相对较小，说明植物的种类和生长方式对植物根 系分泌物的分泌有着重要的作用。 ( 2 ) 实验室模拟研究。在现场采样的基础上，以芦苇苗为实验材料，分为 有植物和无植物两个组，在实验室中研究了沉积物中有机碳含量和酞酸酯初始浓 度对芦苇根际微生物生态和酞酸酯降解菌的影响。结果表明，有机碳含量对根际 微生物的生态特征有着显著影响。有机碳含量高的沉积物( 采自青年湖) 中微生 物数量主要受有机碳影响，根际和非根际微生物数量差异不大：而有机碳含量低 的沉积物( 采自敬业湖和马蹄湖) ，受植物的影响程度较大，即根际微生物含量 明显高于非根际。从微生物总量来看，在无植物组中，敬业湖和马蹄湖都是在未 染毒的情况下微生物量最多，说明在没有植物且沉积物中有机碳含量较低的情况 下，酞酸酯的含量显著影响沉积物中微生物的生长。在可降解菌的研究中，不同 于其他两种沉积物，植物对青年湖沉积物中可降解菌的数量影响不大，这是由于 青年湖沉积物有机碳含量较高，使酞酸酯的有效浓度显著降低所致。 关键词：挺水植物；根际微生物；根系分泌物 a b s t r a c t e m e r g e n tp l a n t sa r ei m p o r t a n tc o m p o n e n to fa q u a t i ce c o s y s t e m s t h es t u d i e s h a v es h o w nt h a t p l a n t sc a nr e m o v en i t r o g e n ，p h o s p h o r u sa n do t h e rp o l l u t a n t sb y a b s o r p t i o na n da c c u m u l a t eo fh e a v ym e t a l s i na d d i t i o n ，p l a n tr o o te x u d a t e sc a na l s o p r o v i d en u t r i t i o n f o rt h er h i z o s p h e r em i c r o b i a lt ot h e d e g r a d a t i o no fo r g a n i c c o m p o u n d s i nt h i sw o r k ，s t u d i e so nm i c r o b i a le c o l o g yo f t h er h i z o s p h e r eo fe m e r g e n t p l a n tw e r ec a r r i e do u tb yf i e l ds a m p l i n ga n dl a b o r a t o r ys i m u l a t i o na n da sf o l l o w s ： ( 1 ) f i e l ds a m p l i n g ：t h ef i e l ds t u d yw a sc o n d u c t e di nt w oa d j a c e n ts h a l l o wl a k e s ( q i n g n i a nl a k ea n da i w a nl a k e ；pa u s t r a l i sa n dzo r i e n t a l i sg r e ws e p e r a t e l yi n q i n g n i a nl a k e ，w h i l eg r e wt o g e t h e ri na i w a nl a k e ) l o c a t e di nt i a n j i nu n i v e r s i t yt o i n v e s t i g a t et h e e f f e c to fp l a n t s p e c i e sa n dg r o w t hs t r a t e g y o nt h e r h i z o s p h e r e m i c r o b i a le c o l o g ya n dp l a n tr o o te x u d a t e s p h o s p h o l i p i df a t t ya c i d sa n a l y s i ss h o w e d t h a tt h en u m b e ro fm i c r o o r g a n i s m si nr h i z o s p h e r es e d i m e n tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nn o n r h i z o s p h e r es e d i m e n t ；t h en u m b e r sa n dd i v e r s i t yi n d i c e so fzo r i e n t a l i s r h i z o s p h e r em i c r o b i a lw e r eg r e a t e rt h a npa u s t r a l & ，i n d i c a t i n gt h a tt h er h i z o s p h e r e e f f e c to fzo r i e n t a l i sm o r eo b v i o u s e m e r g e n tp l a n tr o o te x u d a t e si n c l u e da m i n o a c i d s ，o r g a n i ca c i d s ，s u g a r sa n df a t t ya c i d s ，p h e n o l i ca c i d s ，a r o m a t i ca c i d s ，p h e n o l s ， e s t e r s ，a m i n e sa n ds oo n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei n t y p e sa n dc o n t e n t so fa m i n oa c i da n do r g a n i ca c i db e t w e e nt h et w op l a n t s t h er o o t e x u d a t e sc o n t e n to ft o r i e n t a l & w a sh i g h e rt h a np a u s t r a l 括，w h i l es m a l ld i f f e r e n c e i nr o o te x u d a t e sc o n t e n tb e t w e e nzo r i e n t a l & a n dp a u s t r a l i sw h e nt h e ym i x e d g r o w e d ( 2 ) l a b o r a t o r ys i m u l a t i o n ：o nt h eb a s i so ff i e l ds a m p l i n g ，e f f e c to fs e d i m e n t o r g a n i cm a t t e rc o n t e n ta n di n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fp h t h a l a t ee s t e r so nr h i z o s p h e r e m i c r o b i a le c o l o g ya n dp h t h a l a t e - d e g r a d i n gb a c t e r i aw a ss t u d i e di nt h el a bb yu s i n gp a u s t r a l 括a se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fo r g a n i c c a r b o nh a das i g n i f i c a n ti m p a c to nt h er h i z o s p h e r em i c r o b i a le c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s t h en u m b e ro fm i c r o o r g a n i s m si ns e d i m e n t ( t a k e nf r o mq i n g n i a nl a k e ) w i t hh i g h o r g a n i cc a r b o nw a sm a i n l ya f f e c t e db yo r g a n i cc a r b o n ，a n dt h em i c r o b i a la m o u n t si n t h er h i z o s p h e r ew a ss i m i l a rt ot h o s ei nt h en o n - r h i z o s p h e r e ，w h i l em i c r o b i a la m o u n t s i nt h er h i z o s p h e r ew e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ei nt h en o n r h i z o s p h e r eo f s e d i m e n t ( f r o mt h em a t il a k ea n dj i n g y el a k e ) w i t hl o wo r g a n i cc a r b o nc o n t e n t a s f o rt h et o t a la m o u n to fm i c r o b i o l o g i c a l ，i nt h eu n p l a n t e dg r o u p ，m i c r o b i a la m o u n t si n n o n s p i k e ds e d i m e n t sf r o mj i n g y el a k ea n dm a t il a k ew e r eh i g h e r ，i n d i c a t i n gt h a t p h t h a l i ca c i de s t e rh a das i g n i f i c a n ta f f e c to nt h eg r o w t ho fm i c r o o r g a n i s m si nt h e u n p l a n t e ds e d i m e n t sw i t hl o w e ro r g a n i cc a r b o nc o n t e n t d i f f e r e n tw i t ht h eo t h e rt w o i a k e s t h e r ew a sn oo b v i o u s l yd i f f e r e n c ei nd e g r a d e rn u m b e r so fp h t h a l a t ea c i de s t e r s b e t w e e np l a n t e dg r o u pa n du n p l a n t e dg r o u pi nq i n g n i a nl a k e ，b e c a u s eo r g a n i c c a r b o nc o n t e n ti ns e d i m e n t sf r o mq i n g n i a nl a k ew a sh i g h e r ，l e a d i n gt ol o w e r e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o no f p h t h a l a t ea c i de s t e r s k e yw o r d s ：e m e r g e dp l a n t ，r h i z o s p h e r em i c r o b i a l ，r o o te x u d a t e s 第一章绪论 1 1 挺水植物简介 1 1 1 水生植物概述 第一章绪论 水生植物是指生长在水中或至少是由于水分充足而周期性缺氧的基质上的 任何大型植物( 包括水生植物或水生大型藻类) ，尤其是在湿地和其他水生生境 中生长的植物，这是美国f i c w d ：鉴别和描述管理湿地联合手册( 1 9 8 9 ) 中 关于水生植物的定义【l 】。按水生植物生长环境和生活习性，可以将其分为挺水植 物、浮水植物、浮叶植物和沉水植物几种。挺水植物茎和叶挺出水面，根和地下 茎生于水底泥中，有完善的维管束、通气组织、保护组织和机械组织，主要有芦 苇、香蒲等；浮水植物植物体完全漂浮于水面，具有特殊的适应漂浮生活的组织 结构，如凤眼莲、浮萍等；浮叶植物根茎生于底泥，叶漂浮于水面，主要有睡莲、 荷花等；沉水植物植物体完全沉于水气界面以下，其根相对退化，往往扎根水下 泥土里或漂浮于水中，通气组织发达，有利于在水中缺乏空气的情况下进行气体 交换，沉水植物的叶子多表现为丝状或带状，如菹草、水车前、苦草、聚草等【2 3 l 。 由于水生植物既有造景作用又具有生态功能，因此随着园林造景的广泛应 用，这种植物材料日益受到人们的重视。我国水生植物约有4 0 0 种，许多著名水 生植物的原种都以我国为分布中心，如香蒲属约1 6 种，我国分布1 1 种；眼子菜 属约1 0 0 种，我国分布2 8 种；茶陵属2 种，我国有1 种1 4 j 。如此丰富的野生种 植资源是水生植物多样性研究和开发利用的有利条件。此外，现今水生态环境破 坏日益严重，充分利用水生植物不仅能丰富园林景观，还能改善水体，减轻污染。 1 1 2 挺水植物作用 本文主要研究挺水植物，它们的性状介于陆生植物和水生植物之间，在空气 中的部分具有陆生植物的特征，在水中的部分则具有水生植物的特征。赵玲【5 j 等的研究观察表明挺水植物叶表皮细胞的结构与其它水生植物不一样，而与陆生 植物比较相似，其具有气孔、气孔器，有的植物表皮还长有表皮毛。 挺水植物的生态功能具体可以表现在三个方面：吸收利用和富集作用；为微 生物与水生动物提供栖息地；维持、加强水利传输【6 】。首先，挺水植物能够直接 从水层和底泥中吸收氮、磷等作为营养物质转化为蛋白质等自身的结构。马井泉 第一章绪论 等【7 1 在城市河流水体旁边设计并构建了梭鱼草、茭草和香蒲3 种挺水植物湿地。 在检测的1 个月内，3 种人工湿地对总氮( t n ) 的净化效率分别达到7 5 、5 7 和8 0 ，对总磷( t p ) 的净化效率为9 0 、9 7 和9 0 。同时，挺水植物还能 吸收、富集重金属和有毒有害物质，脱毒后储存于体内或在植物体内被降解，最 后可通过收割除去。唐述虞等【8 】通过建设芦苇、香蒲、灯心草等人工湿地处理铁 矿酸性重金属废水，结果表明，废水酸度明显降低，系统对c u 、f e 、m n 、z n 、 m g 的去除率均在5 6 9 8 ，分别为9 7 8 、8 6 6 、5 6 o 、8 7 4 、6 3 2 ； 此外，生长旺盛的挺水植物茎叶发达，与水的接触面积大，形成了密集的过滤层， 可以减缓水流，过滤及沉淀砂粒和有机微粒。其次，挺水植物的根系发达、茎秆 粗壮中空，具有发达且完整的通气组织，可以保证器官和组织对氧气的需求p j 。 在有光照的情况下植株固定二氧化碳放出氧气，一部分氧气直接释放到空气或水 中，一部分供自身呼吸作用消耗，还有一部分通过植物的通气组织输送到地下器 官，经由根系向根区释放【10 1 ，在根区还原态的介质中形成氧化态的微环境，促进 根区的氧化还原反应和好氧微生物的活动：挺水植物在水中部分还能附生大量藻 类，为微生物提供了更大的接触表面积；作为水生生态系统中的初级生产者，挺 水植物不仅为水生动物提供丰富的食物，还为它们提供栖息生境和繁殖场所，有 利于保持生物多样性和维持整个水域生态系统的稳定，张鸿等j 研究表明，水芹 的根系分泌物还可以促进某些嗜磷、氮细菌的生长，促进氮、磷释放与转化，从 而间接提高净化率，有植物的湿地系统，以上细菌数量明显高于无植物系统，且 植物根部的细菌比介质处高l 2 个数量级。最后，植物根和根系具有对介质的穿 透作用，在介质中形成许多微小的气室或间隙，减小了介质的封闭性，增强了介 质的疏松度，从而使得介质的水力传输得到加强和维持；成水平等试验发现，经 过4 个多月的污水处理后，不种植物的对照土壤介质板结，发生淤积；而种有香 蒲的人工湿地，尽管香蒲地上部分已经死亡，但由于根的存在，水力传输好，渗 虑性能好，污水能很快地渗入介质，处理效果十分明显【l 2 | 。 近年来，随着生态环境的不断恶化，植物修复是一个热门的研究话题，当前 植物修复主要应用于以下六个方面【l3 j ： ( 1 ) 植物刺激。在植物根际的作用下，激发降解微生物大量生长与繁殖， 提高降解微生物的数量及其活性，从而降解土壤中的污染物。该技术主要应用于 清除环境中难分解的有机化合物，如有机石油烃、多环芳香烃( p a h s ) 、有机氯 溶剂、杀虫剂与多氯联苯合物( p c b s ) 等。 ( 2 ) 植物提取。种植具有积累污染物能力的修复植物，其根系能够吸收污 染土壤中的污染物质并运送至植物地上的部分，通过收割植物地上的部分清除土 壤中的污染物。该技术主要应用于清除环境中的重金属与无机污染物。 第一章绪论 ( 3 ) 植物稳定。利用植物、根际微生物的分泌作用螯合或沉淀土壤中有毒 金属，减少土壤污染物活动性，降低其生物有效性和防止其进入地下水和食物链， 从而减少其对环境和人类健康的污染风险。植物还可保护污染土壤不受侵蚀、减 少土壤渗漏以防止金属污染物的淋移，通过根部累积和沉淀或根表吸附来加强对 污染物的固定，阻止其向深层土壤或地下水中扩散，从而减少污染物质的毒害作 用。该技术同样主要应用于清除环境中重金属与无机污染物。 ( 4 ) 植物挥发。修复植物通过吸收并在植物体内促进某些土壤污染物转化 为可挥发态，从土壤中或植物体内挥发至大气，达到治理污染的目的。植物挥发 清除环境中具有挥发性的重金属( 如汞) 与有机污染物( 如三氯乙烯) 等。 ( 5 ) 植物过滤。借助修复植物发达的根系所具有的强吸收与固持作用，从 污水中吸收、浓集、沉淀金属或有机污染物，从而减少污染物的扩散与危害。该 技术主要应用于清除地下水、表面水体、废水中的重金属或无机化合物。 ( 6 ) 植物降解。将土壤中污染物转移到修复植物体内，然后通过植物体内 的代谢作用降解污染物。该技术主要应用于清除可被修复植物吸收与利用的污染 物，如除草剂、有机氯溶剂与火药。 1 2 根际环境 根际环境是指与植物根系发生紧密相互作用的土壤微域环境，是植物在其生 长、吸收、分泌过程中形成的物理、化学、生物学性质不同于土体的、复杂的、 动态的微型生态系统。它是土壤圈、水圈、大气圈和生物圈相互作用的结果 1 4 】。 根际环境的研究主要集中在两个方面，一是农业方面，探讨根际的物理、化学和 生物环境与作物生长发育、抗逆性和生产力的直接关系；二是环境污染及其治理 研究f l 引。根际修复是一种利用植物、微生物和根际土壤环境修复有机污染物的新 兴技术，植物对有机污染物的修复作用主要是通过根际实现的，有机污染物在根 际环境中的行为明显不同于非根际环境，污染物在特异性根分泌物主动营造的根 际微域环境中将发生各种与非根际不同的物理、化学、生物过程，使其毒性和植 物有效性发生改变，从而直接影响它们在土壤植物系统中的迁移和转化。根 际修复作用不仅包括根系本身的吸附、吸收和降解，还包括根系与根际微生物、 根系与根际土之间的相互作用，进而对污染物的迁移、转化和生物有效性产生影 响。 植物根际环境在污染土壤的植物修复中发挥着极为重要的作用。根际由于生 长发育和生理代谢活动，形成了一个不同于非根际土壤的微生态系统( 植物根 际) ，它是土壤、植物、微生物相互作用的场所，也是土壤水分、养分、污染物 第一章绪论 进入植物体的门户。根际的物理、化学和生物学性质与非根际土壤存在极大的差 异，这会影响到根际土壤污染物的存在形态、分布、迁移和生物有效性，使得污 染物在根际土壤中表现出一些特殊的化学行为。例如，在根际中进行的酸碱反应、 氧化还原反应、络合解离反应、生化反应、活化固定、吸附解吸等，能改变污染 物的生物有效性和生物毒性。 1 3 根际微生物 1 3 1 根际微生物作用 根际是指生物和物理特性受根系紧密影响的区域，它与微生物群系共同构成 一一个极复杂的生态区系，是确保植物根系生长发育正常进行的生境场所，也是植 物与外界环境进行物质与能量交换的主要场所，此处微生物多样性丰富，具有强 烈的根际效应。根际微生物是指根系直接影响的条件下存在的特定微生物区系。 根际微生物的数量比相邻的非根际土壤中的微生物数量要高，两者之间的数量关 系可用“根土比”( r s ) 来表示。因此，根际微生物所形成的微生物环境对植物 生长起到极其重要的作用。 根际微生物对整株植物有一定作用，有益菌可以使根系长而发达，叶色浓绿， 树苗健壮，茎部宽厚，甘粒产量增加。如西南农大生态病理研究室研制开发的“丰 收菌”生物肥料，作用于大田试验中的水稻，收到了良好的效果。再如日本比嘉 照夫研制成一种复合微生物肥料有效微生物群( e f f e c t i v em i c r o o r g a n i s m s ，e m ) ， 其代表性微生物主要有乳酸菌、酵母菌、放线菌和光合细菌，具有i 亩效、低成本、 无毒、无污染的特点。e m 制品广泛应用于种植业，使土壤有机物加速分解和转 化，并同时能提高土壤速效有机质及其他养分含量、增加产量、改善品质和防病 抗病。目前，e m 技术及产品在很多国家和地区的种植业、养殖业和环境保护等 领域广泛推广应用【1 7 j 。 根际微生物具有分解和转变作用，可以分解一些根围土壤和根系所分泌的有 机物供植物根系吸收，分解某些物质还可以起到解毒效应。微生物死后被分解为 简单物质被植物利用，通过根际微生物的分解作用也可以减少土壤养分流失。另 外，植物不能直接利用空气中的分子态氮和土壤中难溶性磷酸盐，而氮和磷制约 光合作用、影响植物生产率，重施氮磷肥又会带来环境污染问题，但根际微生物 可以使不可给态养分转化成可给态养分。 在对植物病害的生防作用方面，多数促生菌在植物根系繁殖并具备保护植物 免受或减轻病原微生物侵袭的功能。植物根际促生菌主要是通过合成抗生素、产 生嗜铁素和诱导系统抗性的产生几个方面防治植物病害，另外，也通过竞争和定 第一章绪论 殖优势抑制病原菌的繁殖发展。有些抗生素是菌株防病促生的重要因素。 由于植物根系能够为根际微生物提供营养物质和能源物质，因此根际微生物 的种类和数量远高于周围环境，代谢活性也比非根际微生物高。众所周知，微生 物具有降解多种有机污染物的能力，而根际环境中较高水平的微生物的活性、多 样性与生物量对提高土壤沉积物中外来污染物的降解速率具有重要作用【l 引。在 已有的关于根际微生物降解有机物的报道主要涉及多环芳烃、有机氯农药【1 引、有 机磷杀虫剂【2 0 】等。如k h a n t 2 1 】等对芘在黑麦草根际土和非根际土中的消减行为进 行了研究，培养1 8 周后的结果表明根际土中芘的去除效率明显高于非根际土， 且微生物多样性结果显示根际土中芘降解菌的数量明显高于非根际土。f a n 等【2 副 研究了芘在苜蓿根际和非根际的降解情况，6 0 天后根际土中芘的剩余浓度明显 低于非根际土，且根际土中细菌和真菌的数量分别是非根际土中的5 0 7 5 倍和 1 8 2 3 倍。这些研究充分说明了根际微生物对根际有机污染物降解的促进作用。 然而，也有研究表明 2 3 1 ，在植物修复除草剂阿特拉津污染时一些植物的种植并未 影响根区土壤的降解菌数量，而根区土壤对阿特拉津的矿化率甚至比未种植植物 的土壤还低。他们认为可能是实验用植物的根系分泌物不含有能促进阿特拉津降 解菌生长的物质，也不能诱导微生物可能的降解途径，而且还有可能作为碳源或 氮源与阿特拉津竞争，导致矿化率下降。因此，研究根际环境中植物与微生物的 相互作用，进而有效降解污染物，对于污染土壤沉积物的修复具有重要意义。 1 3 2 环境对根际微生物的作用 环境因素对根际微生物的作用可以考虑两个方面，一个是植物类型对微生物 群落结构的影响，一个是植物根系分泌物对根际微生物的作用。 首先植物类型对微生物群落结构有着很大的影响。植物类型是决定微生物群 落结构的主要因子，植物种类不同，其根际沉积物质就会不同，而根际沉积物质 是刺激植物根际微生物繁殖的重要能源和养分源，是决定微生物群落结构组成的 重要因素。根际沉积物质数量越多，利用这些物质为能源的根际微生物数量也越 多；根际沉积物质种类越丰富，微生物可利用的能源物质范围就越广，则根际微 生物群落结构越多样【2 4 1 。s m a l l a 等【25 】采用p c r d g g e 技术研究了马铃薯、草莓 和油菜的根际微生物群落结构，其结果分析显示不同作物的根际微生物群落结构 变化存在差异，且这种差异在连作后表现得更加明显。另外，连作也引起土壤微 生物群落结构的改变，o l s s o n 等【2 6 对大麦连作和轮作土壤细菌群落的脂肪酸结 构进行比较，结果连作土壤细菌脂肪酸的含量明显高于轮作处理。可以看出种植 的植物种类和种植方式的改变能引起根际微生物群落结构的变化，而根际微生物 群落结构的变化也会反作用于植物的生长发育。 第一章绪论 其次植物根系分泌物对根际微生物有着决定性的作用。植物在其生长过程中 不断分泌或溢泌无机离子或有机化合物，这是植物长期适应外界环境而形成的一 种适应机制，活的植物体释放有机物到根际中，为土壤微生物提供了丰富的碳源 和能源。根际微生物在与外界进行物质和能量交换时，无机离子通过主动或被动 方式在根际土壤与根系内部相互传递，并通过改变根际土壤的p h 值与氧化还原 电位，间接影响植物对根际矿物营养元素的吸收与利用。植物根系分泌物有2 种 产生途径，即代谓 途径和非代谢途径，其中前者又分为初级代谢和次级代谢。初 级代谢为植物的生长和发育提供必需的物质、能量和信息1 27 l 。如白羽扇豆在缺磷 环境下，根系大量分泌柠檬酸和苹果酸，对土壤中的难溶磷起到活化作用【2 引。非 代谢途径产生的根分泌物主要指植物残体或脱落物等的降解产物。根系分泌物产 物包括糖类、有机酸、氨基酸等。其中产生的糖类包括葡萄糖、果糖和麦芽糖等 至少1 2 种；而有机酸则是它的重要组分；并会产生2 0 多种氨基酸和化感物质。 此外，根系分泌物中含有极少量甾类化合物、脂肪酸、微量生长物质和酶类【2 9 | 。 由于这些有机物质的投入，根际微生物的数量远高于非根际。某些根系分泌物对 根际微生物具有一定的选择压力，大多数情况下，根分泌物对根际微生物的作用 是松散的、非特异性的，主要是促进革兰氏阴性无芽孢杆菌在根际的聚集。 1 3 3 根际微生物的分析方法 土壤中的微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和最 具影响力的组分之一【3 0 1 。其生物多样性，不仅代表着土壤的生物活性，同时反映 了土壤生态胁迫机制对其微生物群落的影响。传统研究土壤微生物群落是通过微 生物分离方法进行的，不仅工作量大和研究成本高，而且许多微生物是无法人工 分离培养的【3 1 】。引入存在于活体微生物细胞膜的磷脂脂肪酸( p h o s p h o l i p i df a t t y a c i d ，p l f a ) ，作为微生物的生物标记( b i o m a r k e r ) 【3 2 1 ，用于鉴定土壤微生物种 类和识别微生物类群，具有较高的准确性、稳定性和敏感性1 3 引，能够快速、直接、 较全面、有效地提供土壤微生物群落的信息，且试验条件要求较低，结果较为客 观、可靠，被广泛地应用于土壤微生物群落研搿3 4 j 。 下面介绍目前常见的部分应用于微生物生态研究领域的分析方法。如b i o l o g 微平板分析法、以p c r 为基础的r r n a 及r d n a 的分析方法、梯度凝胶电泳、 磷脂脂肪酸法( p l f a ) 等方法。 b i o l o g 微平板分析：g a r l a n d 和m i l l s 在1 9 9 1 年建立，用于研究不同环境下 土壤微生物群落结构和功能多样性【35 1 。其机理是借助多底物的酶联反应( e l i s a ) 和平板( b i o l o g ) 可研究不同微生物群落对单一碳源底物的利用能力的差异， 通过对所得数据作统计分析，获得土壤微生物群落结构和功能多样性信息。 第一章绪论 b i o l o g 微平板包括b i o l o gg n 微平板、b i o l o gg p 微平板、b i o l o ge c o 微平板、 b i o l o gf f 板和b i o l o gy t 板。其中前三个常用于细菌微生物群落水平生理图谱 ( c l p p s ) 分析，后二个主要用于真菌微生物c l p p s 分析 3 6 , 3 7 。b i o l o g 微平板 分析具有灵敏度高、分辨力强、无需分离纯种微生物、操作简便等优点。但是该 方法也有一些不足之处，主要是影响平板微孔显色的因素较多，除了培养液中微 生物的种群组成、数量与活性外，样品的预处理、培养时间和温度、培养液是否 含有干扰物质等因素都会影响平板显色结果，同时数据处理过程通常比较复杂而 繁琐也是其不足之处。 以p c r 为基础的r r n a 及r d n a 的分析方法：r d n a 在细胞中相对稳定，拷 贝数多，并存在于所有细菌中。r d n a 由保守区和可变区组成，在细菌中高度保 守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。 原核生物的r r n a 分为3 种，分别为5 sr r n a 、1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a ，并且它 们位于同一操纵子上。其中1 6 sr r n a 序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的 标准方法，2 3 sr r n a 分子比较大，并且只有少数种的核酸序列被报道，尚未在 细菌分类和鉴定中得到广泛应用。1 6 s - - 一2 3 sr d n a 间区( i n t e r g e n i cs p a c e r e g i o n ， i s r ) 由于没有特定功能和进化速率比1 6 r d n a 大十多倍，近几年来在细菌系统 发育学，特别是在相近种和菌株的区分和鉴定方面占据一席之地。由于以上序列 每年都以很快的速度补充到g e n e b a n k 中去，这使得微生物工作者能够比较方便 地利用这一数据库进行微生物群体多样性研究【3 8 1 。 梯度凝胶电泳技术：包括变性梯度电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ， d g g e ) 和温度梯度电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 。d n a 分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果，有机溶剂、温度和 p h 等因素可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。d n a 序列由于含有的碱 基不同，其d n a 解链温度( t m ) 也就不同，理论上来说，即使是同样大小的 d n a 片断，如果有一个碱基对的差异，都会引起t m 明显的差异。d g g e 或t g g e 就是应用这种差异来区分不同的d n a 序列。首先在电泳中随着变性剂浓度或者 温度的梯度升高，不同d n a 片断会在聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 胶的不同 位置部分解开双螺旋，使其移动速度显著下降，最后在其相应的变性剂梯度位置 停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。m u z y e r s 掣3 9 】首次将d g g e 技术应用于分子微生物生态学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物 群落多样性和种群差异方面具有独特的优越性。由于d g g e 技术避免了分离纯 化培养所造成的分析上的偏差，通过指纹图谱直接再现群落结构，目前己经成为 复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态性、重要基因定位、表达及调控 的评价分析的强有力工具。 第一章绪论 磷脂脂肪酸法。脂类物质是构成生物细胞膜的主要成分，它在细胞中含量稳 定，约占细胞干重的5 。细胞中包含脂肪酸的脂类物质主要有碳水化合物、脂 性醇、磷脂、糖脂和中性脂等。通常，这些脂类物质的组成和含量在同一种微生 物中是稳定的和可遗传的。磷脂是一类含有磷酸的脂类。土壤微生物中主要含有 甘油磷脂，它是微生物细胞膜上磷脂双分子层的主要组成成分。甘油的前两个碳 链烃基被脂肪酸酯化，第三个碳链烃基被磷酸酯化，磷酸又与一极性醇羟基键连 接，构成了甘油磷脂。土壤中的磷脂大部分以活体生物的组分形式出现，细胞外 的磷脂含量通常很少 4 0 1 。磷脂脂肪酸( p l f a ) 即为甲基化土壤中提取磷脂成分 后，得到的脂肪酸产物。它具有属的特异性，不同的微生物能够通过不同生化途 径形成不同的p l f a ，部分p l f a 总是出现在同一类群微生物中，而在其它类型 的微生物中很少出现。当微生物死亡时，脂肪酸被迅速代谢，因此脂肪酸只存在 于活体细胞中。基于以上特性，p l f a 技术被研发并被广泛运用于土壤微生物群 落结构的分析中，十分适合微生物群落的动态监测。并且可以通过脂肪酸组成和 含量的差异来鉴定纯培养微生物的种类，该鉴定技术已趋成熟，m i d i 公司开发 的s h e r f o c k m i s 微生物种类自动鉴定仪就是成功的典例。 p l f a 技术的发展，首先是脂类物质提取技术的发展。早在2 0 世纪6 0 年代 以前，科学家们就在尝试着建立测定食品中脂类物质的方法，但是当时的方法并 不十分令人满意，存在着提取时间长、提取剂消耗大和只能提取部分脂类等缺点。 1 9 5 6 年，b l i g h 和d y e r 首次提出了一个简单、快速地提取鱼类中脂类物质的方 法，这为磷脂脂肪酸技术运用于土壤微生物群落结构研究奠定了基础，现代土壤 p l f a 提取剂也通常被叫做b l i 曲d y e r 提取剂，这种提取剂的选择建立在给 定氯仿、甲醇和水的一个混合比率，并得到均一相的混合液以增大脂类物质的提 取效率基础上。通过实验，最终确定了氯仿、甲醇和水的比例为1 ：2 ：o 8 时能够 得到最高的p l f a 提取效率。但是，b l i g h 和d y e r 的方法在当时仅限于食品，特 别是鱼类的磷脂提取中，未被应用于土壤。并且，这个方法只能确定总脂类的含 量，而如果只知道总脂的含量，不能达到对土壤微生物群落结构进行分析的目的。 w l l i t e 和t h u l i d 等在2 0 世纪7 0 年代末和8 0 年代初发展了磷脂脂肪酸分析术。 w h i t e 等分析了河口和海底积物中磷脂的含量，并与a t p 和d n a 合成等表征沉 积物微生物生物量的方法行了比较，认为磷脂可以作为表征微生物生物量的一个 指标。同时，还提出了该方法可以根据脂类物质的组成，对微生物群落结构进行 分析。但是，他们并未具体的脂肪酸种类进行测定。t u n l i d 等在加拿大微生物 学杂志上表的文章具有现代p l f a 分析技术的雏形。他们利用磷脂脂肪酸技术 对油菜根微生物生物量和群落结构进行了定量分析，促进了p l f a 在土壤环境学 中的应用。运用p l f a 方法定量分析微生物群落的生物量和群落结构，是一种快 第一章绪论 捷、可靠的检测方法。 p l f a 方法是一种快速、可靠而可重现的分析土壤微生物群落结构的方法， 是一种可定性和定量分析土壤中微生物群落多样性的方法。可用于表征在数量上 占优势的土壤微生物群落，包括不可培养微生物。该方法最适合用作总微生物群 落分析，而不是专门的微生物种类的研究。总结起来，p l f a 方法有如下优点： 检测环境样品中微生物群落时，可避免由培养和直接的计数方法引起的问题；不 仅可用于检测土壤样品，还可用于检测沉积物、水和腐殖质中微生物多样性；相 对容易且能快速处理大量样品；与传统方法相比，能更精确地测定微生物的生物 量；p l f a 谱图包含了磷脂结构的详细信息，可利用这些信息研究微生物群落结 构和微生物的代谢条件。 p l f a 方法也被多位科学家用于科研中。a r a b 等【4 l 】利用磷脂脂肪酸图谱 ( p l f a ) 研究了对小麦根腐病表现不同抗性的两种小麦基因型根际微生物的群 落结构组成。结果显示，在小麦品种b o h o m h 2 6 根际提取的假单胞杆菌的特 有脂肪酸1 9 ：0 c y 和s i f t 含量高于品种s a l a m o u n i ，说明假单胞杆菌在小麦品 种b o h o u t h 2 6 根际定殖数量多。另外，即使相同基因型的植物，在不同的发 育阶段根际微生物的群落结构也不n t 4 2 1 。z a k 等 4 3 】研究发现，植物种类数量与 土壤微生物磷脂脂肪酸( p l f a ) 含量相关。随着植物种类数量增加，土壤中的 细菌与放线菌的p l f a s 数量下降，而真菌的p l f a s 数量上升。 1 4 根系分泌物 对于根系分泌物的提出由来已久，早在1 7 9 5 年p l e n k 就首次发现了植物能 够过根系向外分泌一些物质，1 8 3 0 年d e c a o l l e 也观察到根分泌物对邻近植株的 促生和抑制作用。随后，1 9 0 4 年德国微生物学家h i l t n e r 提出了“根际”的概念， 其定义为植物根表面2 m m 范围内的对根具有重大影响的土壤区域，并认为根系 分泌物是引起根际土壤与非根际土壤理化性质差异的主要原因，同时这也标志着 人们对根系分泌物及其生态效应的进一步认识【4 4 1 。此后人们对根分泌物研究逐步 展开。1 9 2 0 年，l y o n 和w i l l s o n 发现，生长于无菌水培液中的植物能释放有机 物，为深入研究奠定了基础。2 0 世纪5 0 年代r o v k a 等【4 5 人和v a n c u r a 等【4 6 j 人对 根土界面根系分泌物进行了系统的研究。直到7 0 年代对根系分泌物的研究才出 现了蓬勃发展的趋势，并在近一二十年成为世界的研究热点【4 7 | 。 根系分泌物是指植物在生长过程中，通过根系向生长基质中释放的各类物 质，包括低相对分子质量的有机物质、根细胞脱落物及其分解产物、高相对分子 质量的黏胶物质、气体、质子和养分离子等。植物分泌根系分泌物是植物长期适 第一章绪论 应外界环境而形成的一种适应机制。根系分泌物的产生基本上来自于代谢途径和 非代谢途径。后者指产生的根分泌物不受代谢控制，主要来自衰老根表皮细胞分 解的产物等。代谢途径又可分为基础代谢和次生代谢。基础代谢是在逆境胁迫下， 为植物的生长、发育和生殖提供物质能量信息，根系主动或被动地向环境释放各 种化学物质的过程。目前，对于根系分泌机制尤其是占主体的基础代谢的见解并 不一致。一种认为根系的物质分泌可能是沿电化学梯度的扩散过程，最后发生渗 漏，这个过程是被动释放过程。细胞内物质受到细胞膜渗透性的控制，它们的扩 散和渗透可能是分泌释放的基本过程，属于这一过程的根系分泌物包括：糖、有 机酸、氨基酸、水、无机离子和维生素等。另一种认为根分泌物释放的机制可能 是一个逆电化学梯度、耗能的主动分泌过程，这种分泌具有很强的选择性，是植 物活细胞的一种基本功能，最典型的例子是专一性根分泌物铁载体的释放过 程，植物铁载体是受缺铁胁迫诱导在植物体内合成的代谓 产物，通过主动分泌作 用释放到根际。除了基础代谢产物外，根系还可以分泌种类繁多的次生代谢产物。 这些次生代谢大多数是植物对不良外界环境刺激的反应，它们在保护植物免受病 原体和杂草的侵害及种问化感作用和选择有益根际微生物种群方面起着重要的 作用。根分泌的次生代谢产物中大多是相克物质和植物抗病毒激素类物质。 根分泌物释放的部位主要集中在根的顶端区域，包括根冠区、分生区、伸长 区和根毛区。由于根系的不同部位所执行的功能及作用不同，因此所分泌的物质 在种类和数量上存在着差异。根冠区的细胞寿命短、易脱落，细胞内的高尔基体 分泌大量粘液，主要是多糖，在根冠表面形成粘胶层。分生区表面光滑，细胞排 列规则，粘液分泌较少。伸长区的细胞壁微纤丝重排，土壤矿物颗粒侵入粘液