（作物遗传育种专业论文）SARSCoV+X2蛋白亚细胞定位及其诱导细胞凋亡的研究.pdf

中文摘要2 0 0 2 年底，在我国南方发现了一种新型的传染性严重急性呼吸系统综合征( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，s a r s ) ，并波及众多国家和地区，引起广泛关注。随后经过各国研究者通力合作，很快确证了一种新的冠状病毒为导致该疾病的病原体，并命名为s a r s 相关冠状病毒( s a r s c o y ) 。紧接着完成了s a r s - c o y 的基因组测序，并通过多种途径分析了其基因组结构特征。据预测，s a r s c o y 的基因组有1 4个潜在的编码蛋白大于4 0 个氨基酸的开放阅读框架( o r f ) ，包括复制相关蛋白酶基因和四个主要的结构蛋白( s 、m 、n 、e ) 基因，以及几个与其它已知蛋白无明显同源性的未知蛋白的编码基因。未知蛋白x 2 由o r f 4 编码，共1 5 4 个氨基酸，与其它已知蛋白没有明显的同源性。本研究把x 2 基因插入绿色荧光蛋白表达载体p e g f p n i 、p e g f p c 1 和载体p c m v - m y c ，构建重组质粒，转染2 9 3 、c o s 7 和v e r o 细胞，通过细胞荧光和免疫荧光观察发现，x 2 蛋白定位于细胞核，并且呈点状聚集：进一步与核仁蛋白c 2 3 共定位，发现x 2 蛋白定位于核仁，且在不同细胞中，x 2 蛋白的定位状态表现一致。通过构建一系列x 2 蛋白缺失突变体与e g f p 融合表达载体，在转染细胞内进行与c 2 3 的共定位，发现x 2 的核仁定位信号位于c 端的1 3 4 - 1 5 4 位氨基酸残基，这与用生物信息学方法分析的结果一致。采用流式细胞仪分析，发现x 2 蛋白的表达能引起v e r o 、2 9 3 和c o s 7 细胞出现g 0 g l 期阻滞，并且能够诱导c o s 一7细胞发生凋亡。这些结果为进步研究x 2 蛋白在s a r s - c o v 的复制、感染和致病方面的作用提供了有用的参考信息。关键词：严重急性呼吸综合征；s a r s c o v ；未知蛋白x 2 ；核仁定位；细胞凋亡a b s t r a c ts a r si sas y s t e md i s e a s et h a ti n j t i r e sm a n yo r g a n s ，s u c ha sl u n g ，l i v e r , k i d n e y , a n di m m u n eo r g a n e ，a n dt h er e s p i r a t o r yd i s t r e s sa n dd e c r e a s e di m m u n ef u n c t i o na r ep r o p o s e dt ob et h em a i nc a u s e so fd e a t h s a r s - c o y , c a u s eo ft h el i f e t h r e a t e n i n ga t y p i c a lp n e u m o n i a ，i sn o tc l o s e l yr e l a t e dt oa n yo ft h ep r e v i o u s l yc h a r a c t e r i z e dc o r o n a v i m s t h eg e n o m eo fs a r s c o vc o d e sr e p l i c a s ea n df o u rm a j o rs t r u c t u r a lp r o t e i n s ，w h i c ha r ec o m m o nt oa i lk n o w nc o r o n a v i r u s ，a n dan u m b e ro f u n c h a r a c t e rp r o t e i n s p u b l i s h e ds t u d i e ss u g g e s tt h a ts o m eu n c h a r a c t e rp r o t e i n sm a yh a v ei m p o r t a n tr o l e si nt h er e p l i c a t i o n ，v i r u l e n c ea n dp a t h o g e n e s i so fv i r u s e s a m o n gt h ep o t e n t i a ls a r s - c o vu n c h a r a c t e rp r o t e i n s ，x 2p r o t e i n ( o r f 4 ) i sc o m p o s e do f15 4a m i n oa c i d s ，l a c k i n gs i g n i f i c a n ts i m i l a r i t i e st oa n yk n o w np r o t e i n s t i l ln o 、v - t h e r ei sn or e p o r t e ds t u d ya b o u tt h ef u n c t i o no fx 2p r o t e i n i nt h i ss t u d y , x 2c d n aw a sl i n k e dw i t ht h ee g f pa n dm y ct a g sa tt h ena n dct e r m i n u s ，r e s p e c t i v e l y , a n dt r a n s f e c t e di n t oc o s 一7c e l l s i m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n go f t h ee x p r e s s e dt a g g e dx 2p r o t e i ns h o w e dt h a tx 2p r o t e i nw a sm a i n l yl o c a l i z a t e di nt h en u c l e a r f u r t h e rc o l o c a l i z a t i o nw i mc 2 3 n u c l e o l i na n t i b o d yd e m o n s t r a t e dt h a tx 2p r o t e i nl o c a l i z e di nt h en u c l e o l u so ft r a n s f e c t e dc e l l si nt h ea b s e n c eo fa n yo t h e rv i r a lp r o t e i n sa n dd i s p l a y e dd o t t e dn u c l e o l u ss i g n a lp a t t e r n t h el o c a l i z a t i o np a t t e r no fm y c - x 2a n de g f p x 2f u s i o np r o t e i n sw e r es i m i l a rt ot h a ti nt r a n s f e e t e dv e r o ，2 9 3a n dc o s 一7c e l l so fx 2 一e g f p , a n dx 2p r o t e i nw a sm o b i l ef r e e l yt ot h en u c l e o l u sf r o m1 2 ha f t e rt r a n s f e c t i o n b yu s i n gas e r i e so fx 2 - t r a n c a t e dm u t a n t sf u s e dw i t he g f p , an u c l e o l u sl o c a l i z a t i o ns i g n a lf r o ma m i n oa c i d1 3 4t o1 5 4w a si d e n t i f i e d w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h a to f b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s o v e r - e x p r e s s i o no fx 2 e g f pp r o t e i nc o u l db l o c kc e l lc y c l ep r o g r e s s i o na tg o g ip h a s ei nv e r o ，2 9 3a n dc o s - 7c e l l s ，a n de s p e c i a l l yi n d u c ea p o p t o s i si nc o s - 7c e l l s t h e s er e s u l t si sp r o v i d e san e wi n s i g h tf o rf u r t h e rs t u d yo fx 2p r o t e i no nt h ep a t h o g e n yo fs a r s c o vi n f e c t i o n k e y w o r d s ：s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ；s a r sc o r o n a v i r u s ；u n c h a r a c t e rp r o t e i nx 2 ；n u c l e o l u sl o c a l i z a t i o n ；a p o p t o s i si i附件一论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四j l i 农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：矗宁， 辔一i -年5 月知日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：衢，；馥导师签名她翰吕重 j年g 月如日。l r年6 月“m 日第一部分文献综述2 0 0 2 年1 1 月底，在广东发现了一种新型的，由未知病原引起的传染性非典型肺炎( 又叫严重急性呼吸系统综合症，s e v e r e a c u t e r e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，简称s a r s ) ，之后，此病迅速蔓延至周边3 2 个国家和地区，截止2 0 0 3 年7 月1 3 日，共有8 4 8 9人被确诊感染该病，导致死亡8 1 2 例，死亡率高达9 6 ；其中，在中国大陆累计确诊5 3 2 9 例，死亡3 4 8 例，死亡率达到6 5 哆当时，由于该病具有流行性广、发病率高、病死率高、病原未知等特征，一度引起普遍性恐慌，也引起各国政府和w h o的高度重视。2 0 0 3 年3 月1 2 日，w h o 发出了关于该病的全球性警告，并积极组织协调，于3 月1 7 日成立了由全球1 0 个国家和地区的1 1 个顶尖实验室组成的合作研究网络，稍后中国疾病预防控制中心病毒研究所和广东省疾病预防控制中心也加入了该研究网络。该项合作研究项目启动以后，各国科学家迅速展开围绕s a r s 的各方面研究工作，并取得了惊人的研究进展：确定病原体为一种未知的冠状病毒，并在很短的时间里完成全病毒基因组测序工作。2 0 0 3 年4 月1 6 日，w h o 在上述研究的基础上，正式宣布引起s a r s 的病原体是一种新的冠状病毒，并将其命名为s a r s 相关冠状病毒( s a r s c o v ) 。s a r s 病原体的确定，以及s a r s c o 7 基因组序列的测定，为深入研究s a r s 的致病机理奠定了良好的基础。1 1 冠状病毒概述冠状病毒是已知的基因组最大，有被膜，单股、正义r n a 病毒 ( + ) s e n s es s r n av i r u s ，属于巢状病毒目( o r d e r ：n i d o v i r a l s ) ，冠状病毒科( f a m i l y ：c o r o n a v i r i d a e ) ，冠状病毒属( g e n u s ：c o r o n a v i r u s ) 。成熟的冠状病毒颗粒的直径约为6 0 2 0 0 n m ；其形态学上的显著特征是，在病毒被膜外，有明显的长约2 0 n m 的棒一球状突出，电镜负染照片上病毒颗粒呈王冠状，因而得名1 2 1 。冠状病毒的基因组r n a 是一个无节段的正义、单链r n a ，长度一般在2 7 3 1 k b ，该r n a链具有一个正链r n a 病毒特有的重要结构特征：5 端具有甲基化帽子结构，3 端具有p 0 1 y a 尾巴结构n5 1 ，这种结构和真核m r n a 十分相似，是其r n a 自身即可发挥翻译作用的结构基础。病毒体由核衣壳和被膜组成，核衣壳呈螺旋对称型，由病毒的衣壳蛋白n( n u c l e o c a p s i dp h o s p h o p r o t e i n ) 与病毒基因组r n a 相连构成。被膜上主要有三种结构蛋白，分别为s 蛋白( s p i k eg l y c o p r o t e i n ) 、e 蛋白( s m a l le n v e l o p eg l y c o p r o t e i n )和m 蛋白( m e m b r a n eg l y c o p r o t e i n ) ，有的冠状病毒还具有h e 糖蛋白( h e m a g g l u t i ni n a c e t y l e s t e r a s eg l y c o p r o t e i n ) 1 6 ”。s 蛋白属于i 型糖蛋白，形成病毒伸出被膜的棒球状结构，它在病毒与宿主细胞的表面受体结合及介导膜融合，进入细胞的过程中起关键性作用。在病毒的成熟过程中s 蛋白需要翻译后加工，主要是糖基化和被胰蛋白样蛋白酶酶切成s i g h s 2 片段。s 1 片段主要参与病毒与宿主细胞问的识别，而s 2 片段则在s 1 片段识别和结合宿主细胞后发生构象变化，从而促进病毒与宿主细胞的融合。s 蛋白也含有重要的病毒中和抗原决定簇，s 蛋白氨基酸的改变将极大的影响病毒的毒力及对宿主细胞和组织的向性【引。m 蛋白是负责病毒颗粒组装的主要蛋白，属于i 型膜蛋白，在病毒的被膜及出芽过程中起重要作用。m 蛋白可分为一个大的c 端膜内区、三个跨膜区和一个n 端膜外区。大部分的m 蛋白陷于膜内，但羧基末端在出芽时整合进病毒体核心，这对于维持其核心结构是必需的bl o 。e 蛋白也是一种膜蛋白，由占全长2 3 的n 端疏水跨膜区和一段伸向病毒颗粒内的c端组成，在成熟病毒体中e 蛋白表达水平低，但在感染细胞靠近病毒出芽部位表达水平较高。e m i l y 等【1 1 1 用重组痘苗病毒对e 蛋白进行表达，发现e 蛋白定位于高尔基复合体；当m 蛋白与e 蛋白共表达时，二者均定位于高尔基体膜上，并靠近冠状病毒出芽部位。可见，冠状病毒e 蛋白在病毒体组装时也起到关键性作用【1 2 ” 。冠状病毒的基因组还编码一些功能未知的蛋白，这些蛋白虽然不是冠状病毒复制、组装所必需的，但在病毒与宿主的相互识别和病毒的释放过程中可能具有重要作用 5 。1 4 。”，因此也是研究者密切关注的焦点。冠状病毒基因的转录、翻译和翻译后加工有其十分独特之处：冠状病毒成熟颗粒中并不存在r n a 病毒复制所需的r n a 聚合酶，因此它进入宿主细胞后，首先将直接以病毒基因组r n a 为模板，表达出r n a 聚合酶，然后利用该酶完成负链亚基因组r n a 、各个结构蛋白m r n a 的合成以及病毒基因组r n a 的复制。另一个独特之处在于，冠状病毒的各个结构蛋白成熟的m r n a 的合成并不存在转录后的修饰剪切过程，而是在初次转录过程中，通过r n a 聚合酶和一些转录因子，以一种“不连续转录”机制合成的，在转录过程中，每个亚基因组的合成都涉及到一个不连续的步骤，即基因组3 ，端主体序列与5 ，端引导序列的融合【1 6 1 。引导序列在转录时可以自由交换，因此引导序列和m r n a 序列可以来源于两个不同的r n a 分子，这一过程可能发生于亚基因组负链r n a 模板合成时【1 718 1 。冠状病毒的成熟的病毒颗粒是在宿主细胞内组装完成的，病毒的一些结构蛋白之间的相互作用是病毒颗粒组装的基础。首先，n 蛋白在基 雅r r n a a ：的特殊的包装信号序列的引导下，选择性地结合基因组r n a a ：特殊的包装序列，形成螺旋形的核衣壳；进一步在病毒出芽区附近藉n 蛋白与m 蛋白的相互作用选择性的组装基因组r n a ，形成基因组r n h 核心；在此基础上，n 蛋白与s 、e 、m 蛋白相互作用，进而组装成病毒颗粒。但这种病毒颗粒的组装并不依赖于n 蛋白和病毒基因组r n a ，单纯的m 蛋白和e 蛋白就足以形成病毒样颗粒。但由于e 蛋白在病毒表面的数量很少，因此m 蛋白在病毒颗粒的形成过程中的作用就显得尤其重要。但缺乏e 蛋白时，病毒颗粒的组装明显受到影响且生长缓慢。病毒外壳组装的动力来自于m 蛋白三个跨膜区的侧向相互作用，这种侧向的相互作用对同源的m 蛋白有很高的选择性。s 蛋白通过c 端跨膜区和胞内区与m 蛋白以非共价键连接而整合入病毒颗粒2 0 1 。初步组装好的病毒颗粒需要通过高尔基体的加工，再释放到宿主细胞外，侵染其他细胞。不同冠状病毒的成熟的病毒颗粒从宿主细胞释放的方式也有所不同，有的利用宿主细胞的分泌途径以胞吐方式释放，有的以细胞融合的方式在细胞之间播散，也有的以裂解宿主细胞的方式来获得释放。病毒颗粒释放的方式可能与病毒的播散和引起的症状有关，如猪传染性胃肠炎病毒( t g e v ) 主要局限于肠道感染，鼠肝炎病毒( m h v )却在宿主体内广泛播副1 9 + 2 0 1 。就目前所知，冠状病毒只侵染脊椎动物，与人类和动物的多种疾病有关【2 l 】。由于该病毒的宿主细胞主要为上皮细胞，因此常引起呼吸道、消化道和神经系统疾病。冠状病毒引起的人类疾病主要有两类，首先是呼吸道感染，其次是消化道感染2 2 1 。成人普通感冒有2 0 是由冠状病毒感染所引起，在儿童可引起上呼吸道感染，但很少波及下呼吸道【1 0 】。1 2 s a r s 相关冠状病毒研究进展自从2 0 0 3 年4 月6 日，w h o 宣布s a r s 的病原体为一种新的冠状病毒以来，世界各国许多从事相关研究的研究人员就迅速展开了对s a r s c o y 的各方面的研究工作，为实现s a r s 的预防控制和临床诊断与治疗奠定了基础。1 21s a r s c o v 的病原学研究2 0 0 3 年3 月，香港、德国、美国、加拿大等多个实验室相继从取自s a r s 患者的标本中分离出一种新的冠状病毒2 5 ，2 6 ”i ，初步确定该病毒是s a r s 的病原体，命名为s a r s 相关冠状病毒s a r sc o y 。k s i a z e k 等口8 谰患者咽拭子标本接种v e r o e 6 细胞，发现细胞病变，呈现局部性细胞变圆、有折光、细胞脱落。电镜超薄切片观察发现，在粗糙内质网腔和囊泡内有特征性冠状病毒颗粒；电镜负染色检查显示有冠状病毒特异结构：免疫组化和免疫荧光染色显示s a r sc o v 与i 组冠状病毒多克隆抗体有反应，而与i i 或i i i 组冠状病毒抗体则无反应。用间接荧光抗体试验和e 【j i s a 法检测，感染的细胞与患者的血清有反应，而与献血者血清无反应。k u i k e n 2 9 等报道，在4 3 0 名s a r s 患者中有3 2 9 名诊断出有s a r s - c o v ；其他呼吸系统疾病患者中仅有个别散在的有s a r s c o v 。实验动物( 猴) 的研究进一步提供了s a r s c o y 是s a r s 病原体的证据。k u i k e n 2 9 i等用从培养细胞中复制、分离得到的s a r s c o y 感染4 只猴，感染后2 3 天，有3 只猴表现出嗜睡特征；第2 - 6 天，在病猴的鼻、口、咽分泌物中发现有s a r s c o y ：电镜观察，在感染猴发炎肿大的肺上皮细胞( i i 型肺细胞) 中发现有冠状病毒样颗粒，类似于冠状病毒感染的v e r o 细胞内的冠状病毒颗粒。4 只猴中有3 只出现了与s a r s患者类似的组织病变。以上研究结果完全满足了经r i v e r s 修改后的科赫定律，即确定一种病毒性疾病的病原体至少需要满足6 项标准2 9 】：从患病宿主中分离出病毒；在实验宿主或培养细胞中复制病毒；可滤过性；在原宿主或相关种类宿主中产生相同疾病；从中再次分离出病毒；感染后，可检出此病毒的特异性抗体。至此，在众多研究人员的共同努力下，最终确证了s a r s c o v 是人类s a r s 的病原体，为预防、治疗s a r s 奠定了坚实的基础。1 2 2s a r s c o v 基因组结构及其预测编码蛋白在确定s a r s c o v 是s a r s 的病原体后极短的时间内，加拿大不列颠哥伦比亚癌症机构基因科学中心的m a r r a m i 等率先完成对s a r s c o vt o r 2 分离株的全基因组测序工作，随后另外一些分离株的测序也相继完成，截止2 0 0 3 年5 月在g e n g b a n k 登记的s a r s c o y分离株序列已有2 3 条，其中全序列1 4 条。m a r r a 等测定的t o r 2 分离株基因组全长2 9 7 5 1个碱基；美国疾控中心( c d c ) 的r o t a 等测定的u r b a n i 株基因组共有2 9 7 2 7 个碱基。其结构特征为3 端有p o l y a 结构，5 端有帽子结构，g + c 含量4 1 左右，通过序列比对分析发现s a r s c o y 与已知冠状病毒核苷酸序列同源性仅为5 0 6 0 2 4 1 。s a r s c o v 基因组具有典型的冠状病毒基因组结构特征：5 一短的非翻译区一复制酶蛋白r e p 一刺突蛋白s 一小分子膜蛋白e 一膜蛋白m 一核壳蛋白n 一短的非翻译区p o l y a 一3 。与其它冠状病毒相比，s a r s c o v 基因组在编码结构蛋白区域，没有明显的基因重排，r e p 、s 、e 、m 、n 蛋白的基因没有大的插入或缺失，无编码血凝素脂酶( h e ) 的基因。s a r s c o v 复制酶基因占全基因组的2 3 ，可编码两个多聚蛋白，它们经水解为r n a 聚合酶和解旋酶等阱】。同其它冠状病毒一样，s a r s - c o v 基因组也编码几个未知蛋白，在不同的冠状病毒中，这些蛋白有很大的差别，它们对病毒的复制不是必需的，但可能在病毒的复制、致病机制、免疫应答等方面有特殊的作用。s a r s c o v 基因组可编码5 个大于5 0 个氨基酸的未知蛋白，x 1 和x 2 位于s 和e 之间，x 2 嵌合在x 1 和e 之间，x 3 、x 4 、x 5 位于m 和n 之间。此外，在m 和n 之间还有两个小的开放阅读框架( o r f s ) 分别编码两个小于5 0 个氨基酸的蛋白质。通过对g e n e b a n k 的检索( b l a s t 和f a s t a ) ，发现s a r s c o v 的这些未知蛋白编码序列与任何已知蛋白的编码序列均无显著相似性。m a r r a 等在s a r s c o yt o r 2 分离株全基因组中发现了1 4 个潜在的开放阅读框( o r f ) ，依次为：o r f l ( 2 6 5 - 2 1 4 8 5 b p ，复制酶编码基因) 、s ( 2 1 4 9 2 2 5 2 5 9 b p ，) 、o r f 3( 2 5 2 6 8 2 6 0 9 2 b p ，x 1 ) 、o r f 4 ( 2 5 6 8 9 2 6 1 5 3 b p ，x 2 ) 、e ( 2 6 11 7 2 6 3 4 7 b p ) 、m( 2 6 3 9 8 2 7 0 6 3 b p ) 、o r f 7 ( 2 7 0 7 4 2 7 2 6 5 b p ，x 3 ) 、o r f 8 ( 2 7 2 7 3 2 7 6 4 1 b p ，x 4 ) 、o r f 9( 2 7 6 3 8 2 7 7 7 2 b p ) 、o r f i o ( 2 7 7 7 9 2 7 8 9 8 b p ) 、o r f ll ( 2 7 8 6 4 2 8 11 8 b p ，x 5 ) 、n( 2 8 1 2 0 2 9 3 8 8 ) 、o r f l 3 ( 2 8 1 3 0 2 8 4 2 6 b p ，) 、o r f l 4 ( 2 8 5 8 3 2 8 7 9 5 b p ) 【2 1 。1 2 3s a r s - c o v 基因组的变异性比较冠状病毒由于基因组比较大，在宿主免疫选择的压力下，容易发生突变，s a r s c o v也有同样的特点。新加坡的r u a n 等比较了1 4 个s a r s c o v 分离株的全基因组序列，其中5 个分离自新加坡，另外9 个分离自中国香港、大陆等地，他们总共发现了1 2 7个单核苷酸突变点，其中有9 4 个突变改变了编码氨基酸。根据发生在9 4 0 4 、2 2 2 2 、2 7 8 2 7 位的c g 突变和1 7 5 6 4 位的t g 突变，可将这1 4 株s a r s c o y 分为两种基因型c ：g ：c ：c 和t ：t ：t ：t 【3 0 t 。军事医学科学院的李兰娟等分析了1 7 个s a r s c o y 分离株，在以上四个突变位点之外还在2 1 7 0 6 位发现了一个比较显著的a g 突变，他们将这1 7 株s a r s c o y 分为两种基因型c ：g ：a ：c ：c 和t ：t ：g ：t ：t 。在这两种基因型当中t ：t ：g ：t ：t 型与来自香港m 酒店的病原有关，而另外一个基因型的分离株则与m 酒店的分离株无关。提示，在s a r s 从广东传到香港的过程当中，s a r s c o y 在宿主的免疫选择的压力下发生了较为显著的基因突变，以此来逃避宿主的免疫选择。在前述的5 个突变位点中有两个包含在s 蛋白的编码区( a g ，c t ) ，从而导致a s p g l y 和t h r l l e 的突变，而s蛋白是介导病毒入侵宿主的重要蛋白，同时也是病毒的主要的抗原表位，这也进一步印证了s a r s c o v 的突变与宿主的免疫选择密切相关( 3 l 】。1 24s a r s - c o v 的系统发生学分析根据病毒的遗传学和血清学特征，可以将已知的冠状病毒分为三类，第一类包括来自猪等动物的冠状病毒，如猪传染性胃肠炎病毒t g e v p t g v 、人冠状病毒2 2 9 e h c v 一2 2 9 e 、猪呼吸道冠状病毒p r c v 、猪流行性腹泻病毒p e d v 、猫传染性腹膜炎病毒f t p v 、猫肠炎冠状病毒f c v f c e v 、犬冠状病毒c c v ；第二类包括来自牛、鼠等的冠状病毒，如牛冠状病毒b c o v 、小鼠肝炎病毒m h v 、人冠状病毒o c 4 3 h c v 一0 c 4 3 、大鼠唾液腺炎冠状病毒s d a v 、猪血凝性脑脊髓炎病毒h e v p h e v 、兔肠炎冠状病毒r t c v r t c e v 、北海鸥病病毒：第三类来自鸡等禽类，如火鸡蓝冠病毒t c v 、禽传染性支气管炎病毒i b v 等；此外，还有一些分类未定的冠状病毒，如马冠状病毒、鸭冠状病毒、绵羊冠状病毒等【3 】o在冠状病毒的系统分类研究的基础上，国内外研究者都对s a r s c o y 在全基因组序列、同源基因、同源蛋白三个水平上进行了系统发生学研究。刘涛【3 3 1 等分析了以下1 6 个冠状病毒分离株的基因组序列，它们是：2 株禽传染性支气管炎病毒( i b v 和i b v b c k ) 、4 株牛冠状病毒( b c o v 、b c o v q 、b c o v e n t 、b c o v l u n ) 、1 株人冠状病毒( h c v 2 2 9 e ) 、4 株小鼠肝炎病毒o l t t v 、m h v 2 、姗v p e e n 9 7 1 、n t v m l i o ) 、l 株猪流行性腹泻病毒( p e o v ) 、1 株猪传染性胃肠炎病毒( t g v ) 、3 株s a r s 病毒( s a r s u r b a n i 、s a r s c u h w l 、s a r s t o r 2 ) ，构建了r e p 、s 、e 、m 、n 蛋白的系统发生树和冠状病毒全基因组的系统发生树。一般认为，全基因组包含了该物种最丰富和最原始的进化信息，故全基因组序列的系统发生学分析最能反映病毒整体的演化关系。s a r s c o y 全基因组序列的系统发生学分析表明，s a r s c o y 独自成一组，与i b v 有较近的进化关系。同源基因的系统发生学分析结果表明，其他冠状病毒的r e p 、s 、e 、m 、n 基因的系统发生树与基因组的系统发生树基本一致，只有n 基因的系统发生树在传统分类的第一组冠状病毒范围内与全基因组系统发生树略有不同，s a r s c o y 的r e p 、s 、e 、m 、n 基因的系统发生树却与全基因组的系统发生树并不一致。在s 、m 基因的系统发生树中，s a r s c o y 和i b v 的亲缘关系较基因组水平更接近；在e 基因的系统发生树中，s a r s c o v 与t g v 的亲缘关系进一步增强；n 基因的系统发生树中，t g v 的演化位置迁向s a r s c o y 一侧，显示在n 基因上t g v 与s a r s c o y 有相当的接近程度；只有r e p基因的系统发生树与全基因组的系统发生树基本一致。s a r s c o g5 个同源基因各自的演化关系表明，s a r s c o v 各同源基因的演化历史彼此不同，其中结构基因的演化与全基因组的演化不同，这是s a r s c o y 与其他冠状病毒明显不同之处 2 钔。同源蛋白的系统发生学分析结果表明，其他冠状病毒的r e p 、s 、e 、m 、n 蛋白的系统发生树与基因组的系统发生树基本一致，只有e 蛋白在第1 和3 组冠状病毒问出现重组现象，而s a r s - c o v 的r e p 、s 、e 、m 、n 蛋白的系统发生树却与全基因组的系统发生树之间的关系却并非如此。在e 蛋白的系统发生树中，i b v 、t g v 和s a r s c o y的e 蛋白虽然聚在一起，但彼此间的进化关系并不清楚；m 蛋白的系统发生树中，s a r s c o y 与i b v 的进化关系最接近；而r e p 、s 、n 蛋白的系统发生树与全基因组的系统发生树则基本一致。5 个主要的结构蛋白的系统发生学分析结果表明，s a r s c o v和t g v 、i b v 的亲缘关系更近一些33 1 。以上研究结果表明，s a r s c o y 与其他已知冠状病毒的关系都比较远，是一种新的冠状病毒，但与第二组冠状病毒更接近些，因此在进一步研究的基础上s n i j d e r将其定义为第二组冠状病毒的一个新的分支【3 2 】。1 2 5s a r s c o v 的来源目前的研究证明s a r s c o v 是s a r s 的病原体，而s a r s - c o v 是一种前所未知的新的冠状病毒，但这种新的冠状病毒最初的宿主是什么，它是怎么获得感染入的能力的，至今尚不明了，有待进一步的研究。已知人类感冒有2 0 是由冠状病毒感染所引起的，但冠状病毒一般只引起上呼吸道感染，很少波及下呼吸道，且引起的病症都不是十分严重。与此相反，冠状病毒在家禽、家畜却能引起灾难性呼吸道和肠道疾病的流行 4 0 1 。已有研究显示，单一基因的改变就足以产生致死性的新冠状病毒，因此有人认为s a r s c o y 是由已知的人冠状病毒与其他冠状病毒通过基因交换而产生的。理论上，s a r s c o v 可以是人或动物冠状病毒突变过后获得新毒力因子的突变子；也可以是两种人的冠状病毒或一种人的冠状病毒与动物的冠状病毒发生重组而产生的新病毒。在s a r s 恢复期患者的血清里有s a r s c o v 抗体，而在此前的献血者的血清里却没有此种病毒的抗体，这一事实排除j s a r s c o y 是由已知的人的冠状病毒通过突变或重组而产生的可能性。s a r s c o y 全基因组序列测定完毕后，系统分析学研究结果也否定了以上种种推测；此外，s a r s c o v 基因组分析也没有发现来自其他病毒或宿主的基因【4 0 j 。2 0 0 3 年5 月，香港大学微生物系和深圳市疾控中心公布了他们有关s a r s c o y 来源的研究结果，他们在野生动物果子狸的样品里发现一种基因组与s a r s c o y 几乎完全相同的冠状病毒i 而且在十名受检的野生动物经营者中，有5 名s a r s c o y 抗体检测呈阳性反应j 。但这点并不足以说明果子狸就是s a r s c o v 的最初宿主，它可能只是整条传染链中一个环节，女n 1 9 9 9 年在马尼拉发现的引起1 0 0 多人死亡的n i p a h 病毒，该病毒是从猪传染给人的，但其最初的宿主却是蝙蝠。要找n s a r s c o y 的最初宿主，必须要对s a r s 原发地的家养和野生动物进行s a r s c o y 抗原的血清学筛查，同时还必须从中分离出冠状病毒，进行基因组测序，通过比较基因组分析，以揭示s a r s c o v 从其天然宿主传到人类的分子机制。1 2 6s a r s 的病理特征及其引起的机体免疫反应s a r s 是一种全身损伤性疾病，主要靶器官为肺、免疫器官和小静脉p 4 2 ，死亡的主要原因是由于肺泡腔内充满大量的脱落的肺上皮细胞、渗出的炎症细胞和蛋白性渗出物，肺泡腔内广泛形成透明膜，双肺实变，造成有效呼吸面积减少，导致呼吸窘迫、免疫功能低下以及全身继发性感染。国内研究者报道t s a r s 死亡病例的病理变化及其特点，并重点探讨了重症s a r s 主要靶器官( 肺和免疫器官) 的病理发生、发展过程。发现不同时间死亡患者肺脏呈现明显不同的病变，其主要病变呈3 种类型：弥漫性水肿伴透明膜形成型；肺泡上皮坏死脱落伴增生和机化型；纤维增生伴早期纤维化型。重症s a r s n 脏组织学病变的3 种分型，本质上反映了肺脏病变的发生发展过程。王德文等认为，仅就6 周内所见，重症s a r s 肺脏病变先后经历3 个阶段，即急性渗漏性炎症期；肺泡上皮坏死脱落伴增生机化性炎症期；纤维增生伴早期纤维化期。随病程延长，肺纤维化进行性加重；肺泡壁原始间叶细胞，肺泡上皮细胞增生、损伤和增生的巨噬细胞在肺纤维化中起着重要作用【”。3 6 1 。周光德等通过6 例s a r s 死亡病例材料，研究t s a r s c o y 对心脏、尤其是其传导系统的影响，发现s a r s 患者的心脏损伤表现为，t 3 肌细胞空泡变性、萎缩和少数心肌细胞肌浆溶解，心肌间质轻度水肿、少量炎细胞浸润及轻度小血管炎；心肌细胞胞质内偶见病毒包涵体。表 强s a r s c o y 不仅能够感染心肌细胞，而且可感染心脏传导系统中的特化心肌细胞，可引起心脏轻度病毒性心肌炎性改变d7 1 。s a r s c o y 感染人体后能引起机体的免疫应答，但有证据表明s a r s 的发病恰恰是由应答过度所造成的免疫耗竭引起的。目前研究认为，s a r s 的发病可分为三个阶段d 8 】：病毒的入侵和复制过度免役应答急性肺损伤，早期炎症细胞及其分泌的炎症因子在体内的堆积，以及由此造成的免疫损伤可能是s a r s 致命的根源。s a r s c o y 依靠宿主细胞的表面受体或交叉抗原表位而激发的机体过度免疫反应，可造成p 一选择素等黏附因子介导的白细胞趋化、滚动、黏附以及趋化因子、炎性因子的释放，激活多种免疫活性细胞的介导和参与，以致造成一系列由过度免疫反应所引起的病理损伤，如巨噬细胞、n k 和c t l 产生的吞噬、细胞毒和细胞凋亡；也有经抗原递呈细胞加工、处理后所激发的特异免疫应答所引起的更为严重的病理性免疫效应，从而使病灶发生免疫功能紊乱，最终视患者肺组织细胞为靶细胞，而使之发炎、水肿、渗出、变性、坏死和功能丧失【3 9 。1 2 7s a r s o o v 基因组编码蛋白研究进展s a r s c o y 基因组是单股正义r n a ，是连续的非节段型基因结构。在现有的报道中，关于结构蛋白的功能和结构的研究报道比较多，也有对非结构蛋白( 蛋白酶) 和未知蛋白x 1 和x 4 的报道。1 2 7 1s a r s - c o vs 蛋白研究进展许多研究表明，s a r s c o y 的s 蛋白在病毒感染过程中起重要作用，它在病毒与宿主细胞表面受体的结合及介导膜融合的过程中起关键作用。将目前g e n e b a n k 所收录的s a r s c o vs 蛋白编码基因和氨基酸序列进行同源性分析，发现各分离株s 蛋白比较保守，变异率低，是用于研制保护性疫苗的理想抗原。s a r s c o vs 蛋白全长1 2 5 6 个氨基酸，成熟的s 蛋白可分为两部分s 1 和s 2 ，s 1 形成蛋白的球状部分，是细胞受体结合部位；s 2 蛋白形成蛋白的棒状部分，其作用是介导病毒与宿主的膜融合。r u i 等预澳i j s a r s 病毒s 蛋白一级结构中，卜1 3 位氨基酸是信号肽7 2 9 7 7 0 、8 7 9 1 0 1 6 、1 1 6 4 一1 1 8 5 位氨基酸处分别有一个螺旋区域，提示可能为s 29中的n m c 螺旋，与病毒外膜同宿主细胞膜融合有关，1 1 9 7 1 2 1 8 位氨基酸有一段跨膜序列，推测可能是s 蛋白和病毒被膜相结合的位置。n 螺旋之前预测可能有一个球状结构域，提示可能为s 蛋白的s l 部分。s a r s c o vs 蛋白有识别宿主细胞上相应受体的功能，在黏附宿主细胞膜的区域有一个特异的结合区域，它结合受体后可诱导s 蛋白的构象改变，可被那些抑制膜融合和病毒进入的肽类分子所阻断43 1 ，s a r s c o vs 蛋白所识别的受体与其它冠状病毒也不相同，它主要是通过血管紧张素转换酶2 ( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e 2 ，a c e 2 )作为其功能受体【“5 1 。w o n g 等研究发现s 1 的1 2 3 2 7 和1 2 4 8 1 位氨基酸不与a c e 2 结合，但s 1 的3 1 8 5 1 0 区域可以有效地结合a c e 2 ，这个片段包括7 个半胱氨酸，其中5 个和与a c e 2 接合有关，通过点突变分析显示4 5 2 位谷氨酸和4 5 4 位天冬氨酸突变后，s 蛋白会失去接合a c e 2 的活性，这证实了s a r s c o ys 蛋白这一区域是与亲和细胞相应受体结合的结构域，同时也证实a c e 2 是s a r s c o y 的一个功能受体【4 ”。s 蛋白是冠状病毒产生主要免疫原性的成分，其抗原表位较多且分散，作为生产疫苗的首选抗原蛋白，且基因较大，因此有必要对其抗原表位进行系统分析，人类基因组南方中心根据s a r s c o vs 蛋白抗原表位分析结果，对其抗原表位进行综合评价，并给出了评分在前十位的抗原表位。郭瀛军等利用s 基因的s 2 片段( 7 2 8 1 1 8 7 位氨基酸) 为抗原基因构建d n a 疫苗，并用该疫苗对小鼠进行肌肉接种免疫，在接种后的的2 周就能检测到病毒特异性抗体，随时间的推移，抗体水平逐渐升高，表明以s 2 蛋白为抗原能诱导产生8 a r s c o v特异性抗体。1 272 s a r s c o ve 蛋白研究进展e 蛋白是s a r s c o y 的小被膜蛋白，全长2 3 1 b p ，编码7 7 个氨基酸，属于型跨膜蛋白。中山大学的吴德等克隆并表达了e 蛋白，他们利用c l u s t a l w 软件通过氨基酸序列对比发现，参与蛋白序列比对的1 2 株s a r s c o y 中，他们克隆的s a r s c o ve 蛋白与g z 0 1 ( a a p 5 1 2 3 0 1 ) 和u r b a n i ( a a p l 3 4 4 3 1 ) 株有一个氨基酸残基不同，但与其他1 0 株完全相同 g z 0 1 和u r b a n i 株的第2 4 位为蛋氨基酸残基( m ) 而其他株的是缬氨酸残基( v ) 。对e 蛋白的序列进行了h l a 肽结合位点、二级结构、疏水区和跨膜区预测，结果发现这个突变点位于h l a 肽结合位点的v l l f l a f v ( m ) v f l l 区上，该区有1 个大的d 螺旋、3 个b片层和4 个环形结构，第2 4 位氨基酸残基的变异( a a 2 4v a a 2 4m ) 对这些结构( 包括疏1 0水区和跨膜区) 没有影响。由此，可以认为s a r s 病毒的e 蛋白的结构在不同分离株之间是稳定的，这为利用e 蛋白作为抗体诊断不同病毒株的可行性提供了理论依据4 6 l 。第三军医大学吕燕波等分析了s a r s 病毒e 蛋白的b 细胞表位和二级结构，在s a r s病毒e 蛋白n 端的第卜6 a a 、1 3 1 9 a a 、3 94 3 a a 、4 7 6 4 a a 区段和第7 3 7 6 a a 区段有b 一折叠中心；第6 1 2 a