（环境科学专业论文）降解秸秆微生物菌种的筛选及高效菌群的构建.pdf

a b s t r a c t i no r d e rt or e s o l v et h ep r o b l e mt h a tc a u s e db yt h es t r a ww a s t ea n dm a k ef u l lu s eo ft h e c r o ps t r a w , t h ec e l l u l o s e d e g r a d i n gm i c r o b i a lc o m m u n i t yw a se x p e c t e dt ob eo b t a i n e da n di t s e f f e c t so ns t r a wd e g r a d a t i o nw e r es t u d i e d s c r e e n i n go fm i c r o b i a lc o m m u n i t y ：c e l l u l o s ec o n g o r e dc u l t u r em e d i u mw a su s e df o r s c r e e n i n gs o i ls a m p l e s ，a n dt h e nc m c ，f p a ，cia n dp - g a s ew e r eu s e df o rr e s c r e e n i n g b y w h i c ht h es t r a i n sw i t hh i g hc a p a c i t yw e r eo b t a i n e d t h es t r a i n sw e r em i x e dc u l t u r e d ，a n da m i c r o b i a lc o m m u n i t yw i t hh i g hc a p a c i t yw a ss c r e e n e d s t u d yo ff a c t o r sa f f e c t i n gm i c r o b i a lc o m m u n i t yf e n n e t a t i o n ：w es t u d i e dv a r i o u sf a c t o r s a f f e c t i n gm i c r o b i a lc o m m u n i t yl i q u i d - s t a t ef e r m e t a t i o ni n c l u d i n gd i f f e r e n tt i m e ，t e m p e r a t u r e ， p hv a l u e s ，cr e s o u r c e sa n dn r e s o u r c e si nf i x e dt i m ee v e r yd a y d e t e r m i n a t i o no fy e 9 e r - 7 2 s e - - 9 3 ：w es t u d i e dt h ea b i l i t yo fc o ms t r a wd e g r a d a t i o no f y e 9 e r - 7 2 s e - 9 3b yu s i n gw e i g h tl o s sm e t h o da n ds e mp i c t u r e s s t r a i n si d e n t i f i c a t i o n ：t h ea n a l y s i so fm o r p h o l o g ya n d16 sr r n ag e n es e q u e n c e sw e r e p e r f o r m e dt oi d e n t i f yt h es t r a i n so fy e 一9 ，e r - 7 2a n ds e 一9 3 t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： s c r e e n i n go fm i c r o b i a lc o m m u n i t y ：f i v es t r a i n st h a tc o u l dd e c o m p o s ec e l l u l o s eb e t t e r w e r eo b t a i n e df r o ms o i l s a m p l e s t h e nt h e yw e r ec u l t u r e db ym i x e df e r m e n t a t i o n t h e c o m b i n a t i o no fy e 一9 e r - 7 2 s e 一9 3e n h a n c e dc e l l u l a s ea c t i v i t i e sc o n t a i n i n gc m c ，f p a ，c ia n d 1 3 - g a s et os o m ed e g r e e ，a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yo fc m c ，f p a ，cla n dp - g a s ew a s 3 1 8 ，1 6 7 ，1 0 8a n d1 1 2u m l s t u d yo ff a c t o r sa f f e c t i n gy e - - 9 e r - 7 2 s e 9 3 f e r m e t a t i o n ：t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m u mt i m ef o re n z y m ep r o d u c e db yy e 9 e r - 7 2 s e 9 3 w a st h ef o r t hd a y , t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ew a s4 0 ，t h eo p t i m u mp hv a l u ew a s7 5 ，t h eo p t i m u mcr e s o u r c ew a sc o r n s t r a wa n dt h eo p t i m u mnr e s o u r c ew a sn a n 0 3 d e t e r m i n a t i o no fy e - 9 e r - 7 2 s e - 9 3 ：t h ec e l l u l o s e ，h e m i c e l l u l o s ea n dl i g n i nc o n t e n t sw e r e r e d u c e db y2 4 0 7 ，2 8 31 a n d18 3 9 r e s p e c t i v e l yi n8d a y s t h es e m p i c t u r e si n d i c a t e d t h a tc o r ns t r a ww a sd e g r a d e db e t t e rb yy e 一9 e r - 7 2 s e 一9 3t h a ns i n g l es t r a i n s t r a i n si d e n t i f i c a t i o n ：t h e yw e r ec l a s s i f i e da s s t r e p t o m y c e s c a r p a t i c u s ，s t r e p t o m y c e s g r i s e o r u b e n sa n ds t r e p t o m y c e sr o c h e ir e s p e c t i v e l yb yt h ea n a l y s i so ft h e i rm o r p h o l o g ya n d 16 sr r n a g e n es e q u e n c e s t h es t u d yf o u n dt h a tt h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h em i c r o b i a lc o m m u n i t yw a sh i g h e rt h a n t 1 1 a to fs i n g l eb a c t e r i a t h es t u d yc o u l dp r o v i d eat h e o r o t i c a lb a s i so nm i x e df e r m e n t a t i o n b e t w e e n m i c r o o r g a n i s m s k e yw o r d s ：c e l l u l o s e ，a c t i n o m y c e t e ，m i c r o b i a lc o m m u n i t y , c e l l u l a s ea c t i v i t y , i d e n t i f i c a t i o n 第一章绪论 第一章绪论 农作物秸秆是指收获农作物后余下的植物的茎或藤蔓，主要包含禾本科和豆科农作 物秸秆。农作物秸秆资源极为丰富，我国每年生产7 亿吨以上，可以为人类提供大量的 能量和化学原料。但是，秸秆还没有得到充分有效的利用，在我国农村主要用于喂饲 家畜、生活燃料、直接还田，还用于育菇和建筑工业原料等。这些方法还比较原始，效 率亦比较低，大约1 3 的秸秆不能得到妥善地处理，被直接焚烧在田旱或堆积在地头路 边任其腐烂掉，既是对宝贵资源的浪费，又引起了环境污染，甚至可能还会导致各种事 故的发生【2 1 。 农作物秸秆主要是由纤维素、半纤维素和木质素三大组分构成的。近些年科研人员 非常关注秸秆纤维素的研究，在生物转化方面取得了很大地进展，尤其是纤维素生物转 化工艺的发展，对于食品短缺、化石燃料不足、处理农业废弃物等问题都将能得到有 效解决【3 】。但是，在自然状念一f 秸秆难以被微生物分解，用物理、化学法处理的缺点是 能耗高，又会引起环境污染1 4 j 。 秸秆纤维素作为一种最有潜力的低成本原料，由于其结构复杂，并不适于直接作为 碳源使用。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节，纤维素的有效利用与转化将能 缓解当前世界能源危机、粮食不足、环境污染等问题。但是其主要的应用瓶颈在于无法 大规模商业化利用秸秆纤维素。 1 1 秸秆的性质 1 1 1 秸秆的结构特点 农作物秸秆的主要成份是纤维素、半纤维素和木质素，另外还有少量的果胶、含氮 化合物及无机灰分等。纤维素是大分子多糖，由葡萄糖够成。半纤维素是由单糖组成的 异质多聚体。木质素是由醇单体构成的酚类聚合物。几类秸秆的主要成分见表1 1 【5 】。 在漫长的进化过程中植物细胞壁形成了木质纤维素复杂的化学成分和结构，用以支 撑组织，并使其不容易被微生物和酶降解。在植物细胞壁中，纤维素、半纤维素和木质 素呈不连续的层状结构，常常缠绕在一起，并与蛋白质、酸类等其他物质相互交联成致 密的复杂结构。填充在细胞壁的纤维素构架中的细胞问质是由木质素和半纤维素构成 的，作用就是增强植物体机械强度，加固木化组织，及抵御外界环境的侵害等【6 j 。木质 素是难以糖化的复杂的不定型高聚物，是植物体内最难分解的组分，并且在纤维素周围 形成保护层，影响纤维素糖化。木质素中氧含量低，能量密度比纤维素甜。 在植物细胞壁结构中，大部分苯甲基醚键在木质素大分子侧链的c 【位醚化，使其在 碱性条件下比较难降解。木质素与半纤维素通过共价键结合在一起，半纤维素与纤维素 以氢键紧密结合【6 j 。 第一章绪论 表1 1 纤维素、二卜纤维素及术质素在农作物中的比例( ) t a b l elt h er a t e so fc e l l u l o s e ，h e m i c e u u l o s ea n dl i g n i ni nc r o ps t r a w 1 1 2 秸秆纤维素的结构特点 植物每年通过光合作用，能生产出亿力吨的纤维素，是目- f i i j , a 浆造纸，纺织工业和 纤维化工原料的重要来源。纤维素是由许多d 一葡萄糖基通过p l ，4 一糖苷键连接起来的链 状高分子化合物，其英文名为“c e l l u l o s e ”。它是a n s e l m ep a y e n 在1 9 3 8 年用木材经硝 酸、氢氧化钠溶液交替处理后，分离出一种均匀的化合物而首次定下来的【8 】。纤维素分 子主要含有c 、h 、o 三种元素，其中c 含量为4 4 4 4 ，h 含量为6 1 7 ，o 含量为4 9 3 9 。 纤维素的化学式为( c 6 h 1 0 0 5 ) 。，其中n 为葡萄糖基的数量，称为聚合度( d p ) ，它的 数量为几百至几千甚至上万。纤维素的重复单元是纤维二糖。 1 2 秸秆资源的开发利用 秸秆中的主要成分纤维素和半纤维素都是多糖聚合物，水解后可生成葡萄糖、木糖 等糖类。这些糖类经过微生物发酵可转化为乙醇、丙酮、丁醇、乙酸和丁二醇等液体燃 料和化工原料；也可作为抗生素、有机酸、单细胞蛋白( s c p ) 和酶制剂的发酵原料。 木质素的单体也可进一步转化为其他化工产品。 1 2 1 秸秆还田技术 秸秆除了具有较高的热值和粗纤维含量之外，还含有丰富的有机质、氮、磷、钾， 以及镁、钙、硫和其他重要的元素，在秸秆腐解过程中，会陆续释放出来，为作物所利 用。因此，农作物秸秆还罔技术是改良土壤结构的一种有效途径，可以增加土壤有机质、 增加土壤孑l 隙度、提高有机质含量，缓解n 、p 、k 比例失调的矛盾，使养分结构趋于 合理【9 1 0 1 。同时可以节约生产成本，增加农作物产量，降低环境污染，具有促进农业可 持续发展的战略意义。秸秆还田方式多样，主要分为直接还田、间接还田和生化腐熟还 田三大类。直接还田包括直接粉碎还田，整秆还田，覆盖栽培还田；间接还田包括堆沤 腐解还田，烧灰还田，过腹还田，菇渣还田，沼渣还阳；生化腐熟还f f l 包括催腐堆肥技 第一章绪论 术，速腐堆肥技术，酵菌堆肥技术【l o 】。 然而秸秆还田还存在一些问题有待解决：( 1 ) 我国耕地多是一季接一季地耕种，发 酵时间短，没腐烂的秸秆起不到肥f ；1 1 作用，反而影响出苗率；( 2 ) 缺少廉价、配套的 还田机具。 1 2 2 生产饲料 单细胞蛋白( s c p ) ，也称微生物蛋白，大多数是以工农业及石油废料为原料经过人 工培养获得的微生物菌体。为了缓解随着养殖业的发展壮大出现的饲料蛋白短缺问题， 从2 0 世纪6 0 年代起，国内外科研人员丌始致力于单细胞蛋白的研究，并取得了可喜的 成绩。2 0 世纪9 0 年代以来，开始研究以木质纤维素为底物培养微生物，获得大量菌体 细胞来生产s c p 。美国的研究人员通过构建含有木质素解聚糖酶基因和纤维素酶基因的 工程菌，可以直接利用稻草和麦秸秆等农作物秸秆生产s c p 饲料【1 2 】。陈合等【3 】利用3 种菌进行混合发酵可以直接降解秸秆生产蛋白饲料，为玉米秸秆生物利用提供了一种新 途径。但是，由于缺乏纤维素酶系全且高效的菌种，及工艺简单、性价比高的发酵技术， 迄今仍未实现s c p 饲料的大规模生产【l 引。 青贮的原理是利用原料和大气中的乳酸菌，使切碎的青饲料及其流出液在密闭的条 件下，通过厌氧发酵，使原料中的糖类转化为乳酸，产生酸性环境，使青贮料的p h 降 至4 2 以下，抑制和杀死各种有害微生物，从而达到保存饲料和长期使用的目的f l 引。与 饲喂干秸秆相比奶牛饲喂青贮饲料，产奶量可增加1 5 以上，同时奶牛的繁殖率及其它 健康指标都有大幅度提耐1 5 】。美国每年青贮饲料播种面积占饲料总种植面积的1 2 ，欧 洲达到了8 0 左右；俄罗斯青贮饲料中有8 0 是由饲料加工而成的；日本常年利用青贮 饲料饲养奶牛和肉牛6 l 。 秸秆微贮饲料，是区别于青贮饲料的另一种厌氧发酵饲料，就是将微生物高效活性 菌种加入农作物秸秆中，并贮藏于密封的容器中，经过一定时间的发酵过程，农作物秸 秆就会成为具有酸香味的饲料【1 7 】。与青贮相比，微贮发酵则是定向发酵，是向发酵饲料 中添加活性微生物菌种，使之从发酵初期就成为优势菌群，从而达到抑制有害微生物、 稳定微贮饲料品质的目的。张满副1 8 】研究发现，喂饲微贮饲料的动物采食速度和采食量 分别比喂饲未经处理的玉米秸秆提高了3 5 9 1 和2 1 4 3 。 1 2 3 生产绿色建材 目前，我国建材工业的生产消耗资源量非常大，环境污染严重，效益低下，不利于 生态环境的可持续发展【1 9 】。绿色建材是采用清洁生产技术，以工农业或城市固废为主要 原料生产而成的，具有无毒害、无污染、无放射性，可循环利用等显著特点，有利于保 护生态环境和人类健康 2 0 1 。今后，生产绿色建材将有广阔的发展前景，成为主要的发 展方向。 硅钙秸秆轻体墙板是以秸秆和工业废渣为主要原料生产出的新型绿色建材。具有防 火、防潮、耐压、抗震、无毒无害、节约空间、隔音、安装运输方便、减轻劳动强度等 第一章绪论 优点，能节约工程总造价1 0 。可替代木材、石膏、玻璃钢等其他建材，广泛应用于高 低层建筑内墙设置。用秸秆的屑与亚粘土配料生产出超轻质建筑砖【2 1 】。 秸秆是高效、经济的建筑业原料，对于缓解木材供应不足，节约森林资源、发展低 碳经济具有现实意义，有利于实现农业生产废弃物的循环利用，减少焚烧秸秆引起的环 境问题【2 2 1 。 1 2 4 生物质燃料 生物质是指由植物或动物生命体衍生得到的物质的总称，主要由有机物组成。我国 年产生物质总量近5 0 亿吨( 干重) ，含有的潜能相当于2 0 亿吨石油，为我国当前一次 性能源耗量的3 倍。其中植物生物质，如农作物秸秆、蔗渣、芦苇和竹子等，总量已超 过1 0 亿吨。 生物质资源可大规模再生，对人类生存发展起到重要的支撑作用。其中木质纤维素 资源丰富、价格低廉，并且开发利用还很少。借助现代尘物技术手段，把纤维素类生物 质资源转化为液体燃料和其他化学原料，将能够有效减缓对石油资源的过度依赖，缓解 能源资源紧缺，而且对于改善自然环境和减缓温室效应等一系列问题也会产生积极地影 响。生物质资源的转化利用将成为新的经济增长点，有效促进农村经济发展，甚至对全 球经济的可持续发展起到促进作用。面对我国人口众多，能源短缺，资源不足等现状， 大规模的开发利用生物质资源具有特别重要的现实意义，对我国社会和经济的健康发展 将产生深远影响【2 3 | 。 1 2 4 1 纤维素燃料乙醇 根据本国实际国情各国发展出自己的燃料乙醇生产方式。如在美国燃料乙醇的生产 主要以玉米为原料；在巴西主要以甘蔗作为燃料乙醇的生产原料；同本于2 0 0 7 年开始 研究以谷物秸秆壳皮和使用过的建筑材料为原料生产纤维素乙醇。而我国人口基数大， 农作物秸秆资源丰富，利用秸秆纤维素生产燃料乙醇的应用前景广阔。秸秆纤维素燃料 乙醇的生物转化途径主要经过底物预处理水解糖化发酵乙醇的分离提取4 个步骤。 河南天冠燃料乙醇有限公司拥有年产3 0 万吨燃料乙醇生产线，是国际上最大级别 装置，于2 0 0 8 年投入试运行。加拿大i o g e n 公司于2 0 1 0 年1 月中旬宣布，2 0 0 9 年纤维 素乙醇生产量比2 0 0 8 年翻了一倍多，达到5 8 1 万升( 1 5 3 万加仑) ，自2 0 0 4 年以来， 累计生产量已超过了1 0 0 万升( 2 6 4 万加仑) 。美国a b e n g o a 生物能源公司可用酶法每 天转化6 0 0 吨的谷物秸秆为乙醇。 但是，由于纤维素难降解，预处理成本较高，纤维素酶用量大，转化利用率低等原 因，秸秆纤维素发酵生产燃料乙醇尚不足与化石燃料竞争，需要找到一条简单、高效、 经济、稳定的生产工艺路线【2 4 之5 l 。 1 2 4 2 生物制氢 氢能是二次能源，具有清沽、高效和可再生性等优点。利用农作物秸秆发酵制氢生 4 第一章绪论 产出清洁能源，同时又处理了农业垃圾，改善了生态环境。因此，以秸秆纤维素发酵产 氢具有极大的发展前景。 孙学习等【2 6 z7 】以玉米秸秆作为发酵底物，牛粪堆肥作为菌种来源，进行了3 0 l 规模 的厌氧生物发酵制氢放大实验。顾顺等【28 】用稀硫酸预处理秸秆，其发酵产氢效果良好， 产氢量是未经处理秸秆的1 9 6 倍，极大地提高了秸秆的产氢能力。包红旭等【2 9 】构建复合 菌群来降解经过酸化汽爆预处理的玉米秸秆，发现其产氢能力得到了显著提高。 目前，以天然木质纤维素如秸秆发酵产氢的研究报道还不多。虽然对秸秆纤维素产 氢有了一定的研究进展，但是工艺成本较高，产氢的效率较低，在秸秆资源实际利用方 面仍然不够成熟。 1 2 4 3 沼气发酵 在我国农村已大规模应用沼气能源。目前主要以禽畜粪便为原料发酵产生沼气，往 往容易出现原料供应不足的现象，如果能合理有效利用我国丰富的农作物秸秆资源来生 产沼气，对于缓解能源紧缺，提高生活环境质量将能起到积极地作用。科研工作者已在 这个领域展开了深入的研究。 覃文能等【3 0 j 采用沼液预处理的玉米、稻草秸秆，发酵期问其沼气产气量在5 0d 内 保持在稳定较高的水平，甲烷含量高达6 0 以上。刘思颖等【3 i 】研究干发酵生产沼气，通 过一系列试验，确定了稻草秸秆粉干发酵产气的的最佳生产条件，在p h7 5 ，温度3 3 ， 含水率8 0 ，污泥接种量3 5 时，1 0 0g 稻草秸秆2 0d 积累的发酵产气量高达1 2 5 0m l 。 干发酵与传统湿发酵相比具有低耗能、低成本、高产量、高效率等优点，但是在厌氧发 酵产沼气过程中，厌氧菌降解木质纤维素能力很差，影响酸化和气化过程，导致农作物 秸秆的降解时间久，产生的沼气量少，效率低等问题【3 2 1 。何荣玉等【33 】研究发现，秸秆干 发酵过程中加入复合菌剂和发酵促进剂后，秸秆产气量和纤维素降解率都会有明显的提 高。李晓华等【3 4 】利用细菌代谢能量学理论，研究农作物秸秆发酵产生沼气的能效问题， 得出结论为目前秸秆沼气发酵技术的最大能源转换率不到2 5 。 为了应对能源与资源危机，未来的沼气将成为生物燃气，大规模用于供气、发电和 交通运输等【1 2 】。但是，利用秸秆纤维素发酵沼气的工业化进程仍有许多问题需要解决， 如产气量较少、预处理成本高、易形成二次污染等。 1 3 微生物降解纤维素的机理 1 3 1 纤维素酶的多酶体系 纤维素结构的复杂性，决定了任何单- 7 中酶都难以高效的水解它。能水解天然纤维 素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系。通过对纤维素酶系分离纯化的研究，按底物特异 性可将纤维素酶分为以下组分：( 1 ) 外切3 - 1 ，4 葡萄糖酶，主要为p 1 ，4 一葡聚糖纤维二 糖酶( c b h ) ，从纤维素的非还原糖端水解p 1 ，4 葡萄糖苷键，产生纤维二糖。( 2 ) 内切 p 一1 ，4 一葡萄糖酶( e g ) ，又称内切纤维素酶或内切葡聚糖酶，它并非单一组分，而是包括 第一章绪论 多个组分，组分数又随菌株而异，因此又称c x 酶。无规则水解p 1 ，4 糖苷键，形成葡 萄糖、纤维二糖、纤维三糖和大小不同的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更多的可供 水解的末端【1 2 】。( 3 ) p 1 ，4 葡萄糖苷酶( b g ) ，又称纤维二糖酶( c b ) ，主要裂解纤维二 糖和从纤维糊精的非还原木端水解葡萄糖残基，产物为葡萄糖。纤维素酶系除了这三大 组分之外，还有纤维二糖脱氢酶( c d h ) 、纤维二糖醌氧化还原酶( c b q ) 、磷酸化酶和 纤维素酶小体等。 1 3 2 纤维素酶解机制 目前普遍接受的酶解机制是协同作用模型如图1 1 所示【1 2 】。无定形区的纤维素分子 链经e g 随机水解切断，出现更多的纤维素分子端基，有利于c b h 水解纤维素。c b h 与e g 再共同作用得到水解产物纤维二糖，由b g 水解产生葡萄糖。 还有一种外切酶- 夕| 、切酶协同作用可以水解天然纤维素，o hi n1 2 所示。外切纤维素 酶i ( c b hi ) 外切纤维素链还原端，而外切纤维素酶i i ( c b h i i ) 外切纤维素链非还 原端。 不溶性纤维p 7 l 、竹ti l l ：r纤维素 c b h 闭邙少：= 伸c b h l i 纤维糊精五了石夏而夕维二糖 c b 葡萄糖 图1 1 协同降解模型 图1 2 纤维素酶水解纤维素的可能途径 一种更新的天然纤维素酶解理论认为，在非水解性质的解链因子或解氢键酶作用 下，首先打开纤维素链间和链内氢键，形成无序的非结晶纤维素，然后经三种酶协同作 用将纤维素水解为纤维糊精和葡萄糖1 2 】。 1 4 纤维素降解菌的类型 一般来说，降解纤维素的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌三大类。自2 0 世纪 6 0 年代以来，国内外已经先后报道了数千个能产生纤维素酶的菌株，分别隶属于5 3 个 属f 3 5 36 1 ，近2 0 0 个种。 1 4 1 降解纤维素细菌类型 细菌通常是单细胞生物，体积小，比表面积较大，这些特点使物质能够快速进入细 胞，因此肥沃土壤中细菌数量要比真菌多。细菌产酶量比较低，n i l 产生的主要是胞内 酶，很少能分泌到细胞外，一部分会吸附在细菌的细胞壁上。细菌产生的纤维素酶大多 第一章绪论 数难以降解结晶纤维素。此外，细菌产生的大多都是中性和碱性纤维素酶【37 1 ，对天然纤 维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。但是与真菌相比其产生的这些纤 维素酶耐热性更强，而且还有很强的耐碱性 38 1 。纤维素细菌能够产生内切纤维素酶和 外切纤维素酶，还可以产生由不同种纤维素酶和半纤维素酶组成的纤维小体，此纤维小 体可以分泌到细胞外，对纤维素具有比较高的降解能力1 3 9 1 。 大量研究证明，能有降解纤维素的细菌有：芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) ，纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) ，瘤胃球菌属( r u m i n o c o c c u s ) 等，在p h 为 中性或偏碱性，温度为3 0 4 0 条件下生长情况良好 4 0 - 4 1 ；高温厌氧梭状杆菌 ( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) ，嗜热厌氧纤维素降解细菌( c l o s t r i d i “ms p e v a ) 等，能在 5 0 , - , 7 0 较好地生长，产生胞外酶，且酶活力明显高于中温菌。 1 4 2 降解纤维素真菌类型 贫瘠土壤中降解纤维素的真菌较多。真菌的纤维素酶系结构比较合理，主要分泌胞 外酶，产酶效率很高。除了纤维素酶以外，真菌还可以产生半纤维素酶、果胶酶以及淀 粉酶等。 真菌一般可分为高温真菌和嗜温真菌。高温真菌的菌丝具有机械穿插作用，能够有 效地降解纤维素、半纤维素和木质素，因此是降解纤维素的主要类群4 2 扔】。纤维素降解 真菌大多属于嗜温真菌，在温度2 5 3 0 范围内生长最佳。典型的代表有木霉属 ( t r i c h o d e r m a ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m s ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、漆斑菌属( m y r o t h e c i u m ) 、 毛壳属( c h a e t o m i u m ) 和脉胞霉属( n e u r o s p o r a ) 。木霉属和曲霉属是市场中纤维素酶 的重要来源。其中绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 矛l 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 被公认是产纤 维素酶最稳定和无毒安全的菌种m 】。然而真菌发酵周期长，遗传背景复杂不易改造，不 利于提高产量和缩短发酵周期1 4 5 。 1 4 3 降解纤维素放线菌类型 放线菌繁殖慢，而且对纤维素和木质素的降解能力不及真菌，目前降解纤维素这方 面的研究较少。但是，放线菌能形成芽孢以抵抗高温和各种酸碱度等不利的条件，所以 在高温环境下，可以利用放线菌降解木质素和纤维素。放线菌中极少含有致病菌，还能 产生抑制杂菌生长的抗生素，具有极大的开发利用价值。可以从沙土、果园土、马粪和 堆肥等多种自然环境中获得放线菌。典型代表包括：诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) ，节杆菌属 ( a r t h r o b u c t e r ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) ，高温放线菌属( t h e r m o a c t i n o m y c e s ) ，小单胞茵 属( m i c r o n o m o s p o r a ) 3 6 】。 第一章绪论 1 5 纤维素降解菌的研究进展 1 5 1 产纤维素酶菌株的筛选 自1 9 1 2 年p r i n g s h e i m 等首次从土壤中分离出纤维素分解菌以来，研究人员开始关 注具有纤维素降解能力的微生物，并取得了很大地进展【46 l 。将从自然环境中得到的微 生物进行分离纯化，筛选出数干个纤维素降解菌株，并深入研究了菌株的纤维素降解性 能。 宋波等【4 7 】从食草动物的粪便中筛选到1 株链霉菌属的放线菌x w 5 ，其产生的c m c 活力最高达到4 5u m l ，该菌株在生长过程中还可以产生抗生素，抑制杂菌生长，而且 由于放线菌中很少有致病菌，因此丌发利用前景广阔。张楠等【4 8 】从牛粪堆肥中分离出6 株能降解纤维素的高温细菌，通过测定基因序列及其生理生化特征，初步鉴定为枯草芽 孢杆菌fb a c i l l u ss u b t i l i s ) 。尹磁等【4 9 】从造纸废水处理池中分离得到一株能降解纤维素的 菌株，鉴定为荧光假单胞菌，并且比较了不同碳源对产酶效果的影响。韩绍印等1 5 0 】从造 纸厂废纸浆中分离出一株巨大芽孢杆菌，对环境有很强的适应能力，在温度2 0 5 0 ， p h 值为5 1 0 培养条件下生长迅速并且产生纤维素酶，在降解纤维素方面具有广泛应用 前景。 从自然界筛选出的纤维素菌株的产酶能力，及生产性能还不z 只匕e , ，4 k 1 h 好地适应工业化生 产的需要，而且由于自发突变频率较低，短时间内难以获得高产菌株，因此科研人员丌 始对纤维素菌进行定向育种。常用的选育方法有诱变育种、基因重组和杂交育种、蛋白 质定向进化技术、r n a 干扰技术和基因工程技术等。刘光烨等【5 i 】采用n t g 和u v 连续 诱变处理绿色木霉获得突变菌株s o 4 6 5 ，其微晶粉末纤维素酶活力提高了8 2 倍。胡婷 婷掣5 2 】通过进行原生质体紫外诱变，得到的纤维素酶高产菌株比出发菌株c m c 酶活力 提高了1 2 4 3 。 1 5 2 纤维素降解菌群的研究进展 有些菌种很难获得纯培养，如具有纤维素降解功能的中温好氧细菌。在初步分离过 程中，这些细菌和没有纤维素降解能力的细菌常混杂在一起，细菌降解纤维素产生的糖 类及其代谢产物被非纤维素降解细菌利用。菌株的纤维素降解效果也并不理想，经过长 期的研究发现，很多单菌株对天然纤维素的降解效果不太好，且传代性状不稳定【5 引。 微生物对秸秆的降解错综复杂，有的微生物酶系齐全，三类组分都可降解，有的只 能降解其中之一，甚至仅限于某一反应过程。微生物的纤维素酶系齐全，并向外分泌纤 维素酶，水解天然纤维素的种类不多。 人们对纤维素降解菌的研究目光转移到微生物群体的研究上。研究发现纤维素降解 菌之间协同作用明显，不同菌株共同作用能够更好的降解纤维素。自然生境中有很多可 以降解纤维素的菌群。于艳玲等【5 4 】采用限制性培养微生物的方法，从瘤胃残渣中获得了 降解能力强、性能稳定的厌氧降解菌群f y g 2 。该菌群可以在体外进行培养生长，在 3 8 5 ，p h6 4 6 8 条件下，能够使1g 滤纸在5d 内完全崩解。该菌群传代培养3 0 第一章绪论 代后，仍然能够保持稳定的纤维素降解能力，且无论纤维素底物是否灭菌都不会对其降 解产生影响。对f y g 一2 进行分离纯化得到7 株单菌株，但其纤维素酶活均低于f y g 2 。 殷中伟【5 5 j 从土壤中筛选到一个高效降解菌群y 2 b ，可以在1 0d 降解纤维素4 0 2 。董玉 玲掣5 6 】通过“外淘汰法”获得一个包含1 3 个菌属的微生物菌群，经过1 0d 的发酵培养 发现，1 8 6g 小麦秸秆中纤维素分解了o 7 8g ，秸秆失重率高达7 7 o 。 从上个世纪术开始，研究人员着重研究如何构建高效降解纤维素的微生物菌群。首 先组合具有纤维素降解能力的不同菌株，测定菌群的降解能力，进而筛选出纤维素降解 性能最好的菌群。目前常用此种构建方法获得纤维素降解菌群。崔宗均等【5 7 】认为有目的 地构建稳定的菌群，形成较稳定的自然循环系统，将不易被外界杂菌所破坏，有助于环 境微生物的有效利用。潘海波等【5 8 】将绿色木霉和根霉按比例为1 ：1 混合发酵培养，当 初始p h 为3 5 时，f p a 酶活提高到5 4 1 8i u m l ，几乎是活化前两菌株的酶活之和。张 瑞清等1 5 0 j 从土壤、枯枝落叶和麦垛中分离出1 4 株高效降解纤维素的菌株，将其构建组 成菌群，在常温下4d 内对麦秆粉的降解达到4 0 7 。 菌群培养就是利用共生原理将菌株混合培养发酵，借助菌株之间的互补优势，提高 纤维素降解效率，提升产物产量和价值。 1 5 3 纤维素降解菌群研究存在的问题与发展趋势 目前，无论是从自然生境中直接筛选得到的，还是通过构建获得的菌群，都显示出 了较高的纤维素降解能力。但是在纤维素降解菌群的生长过程中还存在很多的问题。 存在协同作用的菌种之间是相互依存的，各菌种对环境要求苛刻，难以应用于自然 环境咖】。纤难素降解菌群在发酵过程中p h 总是不稳定，容易出现偏高或偏低，这种现 象可能会导致纤维素降解活性降低，甚至会产生抑制作用 6 1 - 6 2 】。菌群的稳定性有待提高， 生长过程中会出现衰退现象。所以，如何获得高效稳定的纤维素降解菌群使我们的研究 重点。 随着人们对纤维素降解酶的空间结构和降解机理认识的提高，以及蛋白质工程、基 因工程技术的迅速发展、改造菌结构、提高酶活力也已成为可能。国内外有不少研究工 作，已有应用蛋白质工程菌而使其性能得到改善的成功报道。 1 6 研究的目的和意义 循环经济和可持续发展战略的提出，使秸秆资源转化和利用的研究受到高度重视和 广泛应用。我国拥有庞大数量的秸秆资源，由于秸秆结构不均一，且各部分的化学成分 非常复杂，使得秸秆在短时间内不容易被降解。很多秸秆在田间被直接烧掉，破坏了生 态平衡，使土壤肥力衰竭，造成农业上的恶性循环，而且污染了环境。利用适合常温， 养分失衡的微生物，构建具有高效纤维素降解功能的混合菌群，使秸秆资源能被快速充 分的利用。对于促进秸秆资源的有效利用，解决环境污染，保持经济可持续发展具有重 大现实意义。 本研究的目的就是找到产纤维素酶能力强，能够高效降解玉米秸秆的菌群，探索其 第一章绪论 最佳生长条件，为构建微生物菌群以降解纤维素提供理论基础，为人类有效利用秸秆提 供依据。 1 7 研究内容和技术路线 1 7 1 研究内容 1 从土壤样品中初步筛选纤维素降解菌，对降解作用较好的菌株，再以c m c 、f p a 、 c - 和1 3 - g a s e4 种酶活性指标进行复筛，得到高效纤维素降解菌株，再将其进行混合培养， 筛选高效混合菌群。 2 通过测定菌群在液体培养条件下的产酶能力，探讨菌群在液体条件下产酶情况 以及影响因素，确定最佳生长条件。 3 测定比较菌群降解秸秆前后纤维素、半纤维素和木质素的含量变化，并观察扫 描电镜下秸秆结构变化，分析菌群对秸秆的降解效果。 4 利用形态观察和1 6 sr r n a 序列同源性分析对菌株进行种属鉴定。 1 7 2 技术路线 第二章秸秆纤维素降解菌的筛选与菌群构建 第二章秸秆纤维素降解菌的筛选与菌群构建 农作物秸秆的主要成分是纤维素，是地球上最丰富的可再生有机资源【6 3 1 。然而天然 纤维素的晶体结构中存在许多高能氢键，使其不易被降解。细菌、真菌、放线菌等微生 物可以产生纤维素酶降解纤维素。细菌中有纤维杆菌属( c u l m o l n o a s ) 、生孢纤维菌属 ( s p o r o c y t o p h a g a ) 并l 梭菌属( c e l l u l o m o n a s ) 等酶活力较强的菌种，目前研究最多的细菌是 纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s ) 和热纤梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 。细菌在降解纤维 素过程中，产生的纤维素酶量较少，大多是胞内酶不能分泌到细胞外，而且对结晶纤维 素降解活性非常低，降解能力要比真菌低得多，因此细菌很少在工业生产中应用蝌】。目 前对真菌研究较多，尤其是木霉属( t r i c h d e r m a ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 和青霉属 ( p e n i c i l l i u m ) 等高效降解菌种的报道最多【6 5 1 。具有降解纤维素能力的放线菌种类不多， 但放线菌能够分泌耐碱性的胞外酶，在强碱性条件下仍能保持较高活性【6 6 1 。放线菌能形 成芽孢以抵抗不利环境，正受到越来越多研究者的青睐，目前对高温放线菌研究报道较 多【6 7 】。吴翔等【6 8 】从高温稻草堆肥中分离到1 株能降解纤维素的高温链霉菌，在比较适宜 的培养条件和价格合理的培养基上对纤维素的降解效果良好。 在长期的实践中发现，单一菌株对纤维素的降解作用有限，多菌株共同降解纤维素 的效果更好，因此菌种混合培养逐渐受到重视【6 引。 目前，对于从土壤中筛选出的纤维素降解菌，基本上都是以纤维素酶活性高低来判 定菌株降解纤维素能力的大小，但是很多试验对酶活性的测定并不全面，大多只测定 c m c 和f p a 的活性，不能充分反映菌株降解纤维素能力的大小。为此，本试验从土壤 样品中筛选出纤维素降解菌株后，以c m c 、f p a 、c l 和1 3 - g a s e4 种酶活性指标进行复 筛，得到高效纤维素降解菌，再将其进行混合培养寻找高效混合菌群，为微生物混合培 养降解纤维素提供理论基础。 2 1 试验材料 2 1 1 样品 样品采集自天津理工大学主校区内及其周边树丛土壤中。选择1 0c m 2 0c m 土层 深度进行采集，置于4 冰箱保存。将玉米秸秆清洗干净，剪成2 3c m 小段，烘干后 粉碎并过4 0 目的筛子，制成秸秆粉备用。 2 1 2 培养基 c m c n a 固体培养基( g l ) ：c m c n a1 5g ；n h 4 n 0 31g ；酵母膏l g ：m g s 0 4 7 h 2 0 0 5g ：k h 2 p 0 41g ，琼脂2 0g ；p h 自然，1 2 1 灭菌2 0m i n 。 第二章秸秆纤维素降解菌的筛选与茵群构建 c m c n a 液体培养基：c m c n a15g ，n h 4 n 0 31g ，酵母膏1g ，m g s 0 4 7 h 2 00 5g ， k i - 1 2 p 0 41g ，蒸馏水10 0 0m l ，p h 自然，1 2 1 灭菌2 0r a i n 。 产酶培养基( g l ) 7 0 】：k h 2 p 0 41 0g ，n a c l0 1g ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 3g ，n a n 0 32 5g ， f e c l 30 0 1g ，c a c l 2o 1g ，秸秆粉2 0g ，p h 为7 2 - 7 4 。 保藏培养基( l ) ：细菌用普通牛肉膏蛋白胨培养基保藏；放线菌用高氏一号培养 基。 2 1 3 试验试剂 化学试剂购白天津化学试剂公司 ( 1 ) 羧甲基纤维素钠( c m c n a ) 溶液【_ 7 1 】准确称取2gc m c n a ，缓缓加入柠檬 酸缓冲液约2 0 0m l ，置于8 0 9 0 水浴锅中加热溶解，可用磁力搅拌加速溶解， c m c n a 全部溶解并冷却后，用柠檬酸缓冲液稀释至3 0 0m l ，用2m o l lh c i 或n a o h 溶液调节p h 到4 8 ，最后用柠檬酸缓冲液定容到3 0 0m l ，混匀，于冰箱中贮存备用。 ( 2 ) 浓度为1m g m l 的葡萄糖标准液准确称取1 0 0m g 干燥至衡重的无水葡萄 糖，先用少量蒸馏水溶解，再定容到1 0 0m l ，摇匀备用。 ( 3 ) 3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 溶液【7 l 】称取d n s1 0g ，加入约6 0 0m l 蒸馏水溶 解，再缓慢加入n a o h1 0g ，放置在5 0 水浴中搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠 2 0 0g 、苯酚( 重蒸) 2g 和无水亚硫酸钠5g ，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用蒸 馏水定容至1 0 0 0m l ，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d 后方可使用。 ( 4 ) o 0 5m o l lp h4 8 的柠檬酸缓冲澍7 l 】 称取一水柠檬酸4 8 3g ，用约7 5 0m l 蒸馏水溶解，边搅拌边加入柠檬酸三钠7 9 4g ，用蒸馏水定容至1 0 0 0m l ，调节p h 到 4 8 备用。 ( 5 ) 0 5 水杨酸苷溶液准确称取0 5g 水杨酸盛于1 0 0m l 小烧杯中，先用少量 柠檬酸缓冲液溶解后，再用柠檬酸缓冲液定容至1 0 0m l ，混匀备用。 2 1 4 试验仪器 小型粉碎机( y l 9 0 1 2 ) ，超净工作台( s w - c j i f d ) ，手提式不锈钢蒸气消毒器 ( y x 2 8 0 b ) ，生化